NANOBIOTECNOLOGIE – 4 CFU (32 ore)
-Nanosistemi e multivalenza: cooperatività
-Dimensioni e densità
-Funzionalizzazione
-Targeting
-Delivering
-Sensing
Esame scritto su 5 esercizi
Energie dei legami covalenti
C-O bond
81 kcal/mol 1.43 Å
C-C bond
86 kcal/mol 1.54 Å
C-H bond
103 kcal/mol 1.11 Å
C=C bond
143 kcal/mol 1.33 Å
C=O bond
165 kcal/mol 1.21 Å
Se confrontate con molte interazioni non covalenti sono
caratterizzate da:
•
Energie molto elevate
•
Distanze piccole
•
Forte dipendenza dall’orientazione
Interazioni non covalenti
(guidano la formazione delle interazioni supramolecolari)
idrofobiche
<10 kcal/mol
elettrostatiche
~5 kcal/mol
legame ad idrogeno
2-10 kcal/mol
π-π
π aromatiche
0-10 kcal/mol
van der Waals
0.1-1 kcal/mol
La forze intermolecolare che agisce tra due molecole è la somma
di tutte le forze che esercitano l’una con l’altra.
Conclusione: molte interazioni devono operare in maniera
concertata per portare ad energie simili a quelle di un legame covalente
Dal punto di vista
topologico un virus
e la superficie di
una cellula sono
simili ad un
nanosistema
sintetico
Multiple interactions in binding: definitions
reference:
receptor
multiple binding sites:
receptor interacts with
a multivalent ligand
ligand
multiple binding sites:
receptor interacts with
a monovalent ligand
complex
poly
∆G avg
= ∆G Npoly N
poly
∆G avg
= α∆G mono
∆G = − R T ln( K )
poly
N ∆G avg
= ∆G Npoly = αN ∆G mono
poly N
K Npoly = ( K avg
)
poly N
K Npoly = ( K avg
) = ( K mono ) αN
lg( K Npoly )
α=
lg( K mono ) N
α?
α=degree of cooperativity
α>1: positive cooperativity (synergistic)
α=1: noncooperative (additive)
α<1: negative cooperativity (interfering)
in all cases overall
binding constants
increase!
when talking about cooperativity (in binding) we often consider this one as the
typical situation.
On the contrary this is a rare situation!
most of the available examples are characterized by α<1
Don’t be fooled by the overall strength of binding which is always larger:
∆G Npoly = ∆G mono − R T ln( β )
β = K Npoly K mono
Entropy
Enthalpy
Positive cooperativity is due to entropic and enthalpic contributions to binding.
Entropy: loss of motion of the molecule, including internal rotation and vibrations
(contribution already paid for in connecting together the recognition
elements)
Enthalpy: secondary functional groups interactions, conformational changes,
polarization of the interacting groups
Il peso dell’entropia
Energie di associazione (∆G in kJ mol-1) tra molecole in seguito alla
formazione di legami ad idrogeno o coppie ioniche in funzione del
numero di legami singoli che separano i siti di interazione.
(vedi: Angew. Chem. Int. Ed Eng. 1998, 37, 826; Chem. Eur. J. 1999, 5, 1284)
Sperimentalmente si osserva che il costo entropico è molto
maggiore quando si ha a che fare con interazioni covalenti
che con interazioni non covalenti tra coppie ioniche (suggerimento: le
interazioni tra coppie ioniche non comportano una totale
“rigidificazione” del complesso). Nel caso di interazioni tra coppie
ioniche si trova una relazione lineare tra -∆G e numero di interazioni
-∆Gmono=5 kJ mol-1
è un esempio di
sistema non
cooperativo (α=1)
Energie libere di complessazione (-∆
∆G in kJ mol-1) in funzione del
numero di interazioni tra coppie ioniche (n) misurate in acqua.
noncooperative
α=0.87
β=1x105.2
α=0.93
β=1x1012.8
PNAS 2006, 103, 3034-3038
negative cooperativiy
N
N
N
N
N
HN
O
N
HN
NH
O
O
N
N
N
NH
N
N
HN
O
N
O
N
N
O
N
S
S
N
O
N
S
S
N
H
N
S
S
S
H
N
S
Au
S
S
S
S
S
N
N
N
O
S
S
S
S
S
N
S
S
O
N
H
N
O
SS
S
S
S
S
N
S
S
N
Zn
N
HN
HN
S
S
H
N
S
N
S
N
HN
NH
O
O
CH3O
N
O
HN
N
O
O
NH
R
NH
HN O
O
N
HN
N
N
N
N
N
N
H
N
HS
N
R
N
O
R
N
N
N
R
N
N
R
α=1
O
HN
R
O
HN
HN O
10
N
N
8
R
N
N
6
R
N
N
N
R
N
R
N
N
N
N
R
R
R
R
4
1
2
α=0.75
β=90
R
Data1_B
Data1_B
Data1_B
12
N
N
3
n. porphyrins
Chem. Comm. 2003, 1004-1005
α=0.58
β=1000
2β
K=0.42
α=0.38
β=2.4
3β
K=1
negative cooperativity
JACS 2000, 122, 8350-8356
Dato sperimentale:
α<1
β=30
β=420
β=2800
α<1
Not considered:
S
K
Typicallly “cooperativity” in these multiple interactions is due to
conformational changes of the different sites of the polyvalent
receptor (allosterism).
They are described by the Hill equation:
Y
log
= h log S − log K
1 −Y
Y = degree of saturation; h =Hill constant (h ≤ number of sites; h > 1 positive cooperativity;
h = 1 no cooperativity; h < 1 negative cooperativity)
(GM1 = porzione saccaridica del ganglioside GM1)
Un possibile esempio di cooperatività positiva (α
α>1)
Grafico di Hill
log
Y
= h log S − log K
1 −Y
G=S
h
Esempi di interazioni
di tipo allosterico
Coniugazione di una biomolecola ad un nanosistema
Nanosistema
Cluster inorganico: richiede
Polimero organico, dendrimero,
lipide: gruppi funzionali già presenti funzionalizzazione o in fase di sintesi
nei singoli monomeri
o successivamente
AuCl4
F
S
F
SH
S
F
X
F
S
F
F
Coniugazione di una biomolecola ad un nanosistema
Gruppi funzionali presenti in una
proteina o in un oligisaccaride: ci
consentono l’ancoraggio al
nanosistema ma la chimica necessaria
può non essere banale.
I gruppi finzionali che servono per la
coniugazione dipendono dalle
condizioni operative
Coniugazione di un oligosaccharide
NS
NS
pericolo!
In generale l’ambiente nel quale si conduce la coniugazione non deve presentare
gruppi funzionali competitivi con la reazione di coniugazione stessa!
NS
La formazione di un legame peptidico può essere condotta sfruttando le classiche strategie di accoppiamento;
L’approccio qui sotto riporta quella che viene chiamata “native chemical ligation”
NS
NS
NS
NS
In queste funzionalizzazioni la proteina può essere sostituita da un amminooligosaccaride
N-maleimmide
NS
NS
NS
NS
NS
NS
La reazione a-b è la reazione di Staudinger che permette di ottenere un gruppo amminico a partire da una
azide; quest’ultima si ottiene facilmente per sostituzione nucleofila di un alogenuro. La reazione c e la d
sono invece le reazioni di formazione di un legame peptidico che può essere condotta in situ. Queste
reazioni si chiamano “Staudinger ligations”.
Una possibile alternativa è usare una reazione di cicloaddizione come in questo caso tra
un diene ed un alchene povero di elettroni; le reazioni di cicloaddizione sono reazioni
poco sensibili al solvente.
NS
NS
NS
NS
Questo prodotto si forma invece da una reazione di cicloaddizione
nota come 1,3-dipolare. I due partners sono un alchino e una
azide: viene chiamata “click reaction”
NS
Proteina o
polisaccaride
NS
NS
NS
NS
Esiste anche la possibilità di coniugare il nanosistema alla proteina o al
polisaccaride attraverso un “legame” non covalente. Questa interazione
però deve essere molto forte, cioè essere caratterizzata da un valore di ∆G molto elevato (>20 kcal/mole; cioè una costante di associazione di
almeno 1 x 1014 M-1).
Questa situazione si verifica per l’interazione biotina/(strept)avidina
Confronto tra avidina e streptavidina
Biotina
Strategie per l’interazione nanosistema/target mediate
dalla complessazione biotina/(strept)avidina
NS
NS
NS
Strategie di coupling via estere attivo (nucleofilo
tipico: ammina primaria o secondaria)
Strategie di coupling con tioli
Strategie di coupling con:
a) carboidrati; b) derivati di acidi carbossilici
a) Idrazoni
b) Ammidi
Ruolo delle dimensioni del nanosistema e della
densità dei gruppi funzionali nella complessazione
con il target
NS
NS
Gruppo
RUOLO DELLA % DI FUNZIONALIZZAZIONE DEL NS
inerte
Gruppo
funzionale
?
Gruppi funzionali (attivi) possono
mescolarsi con unità inerti in maniera
casuale o formando domini
Kd
random
domini
Inserimento casuale
Queste due situazioni posono
essere rappresentate da una
superficie nella quale esagoni
o pentagoni sono affiancati
gli uni agli altri
+
+
+ …+
+
Inserimento a cluster
: unità funzionale
: unità inerte
Analisi (semplice target bivalente)
Affinità per singolo
sito assunta costante
(α=1)
Siti potenziali
‘Kd’
Siti saturabili
‘molecole di target max’
random
18
8
clustering
35
8
Che cosa mi aspetto
100
:
max
mol
target
kcat, rel
75
random
50
25
0
0.00
:
0.25
0.50
0.75
1.00
x1
clustering
25
20
Kd
KM,rel
:
+
15
10
self-sorting
5
0
0.00
0.25
0.50
x1
0.75
1.00
Binding di un oligonucleotide ad una nanoparticella cationica
tri
Efficienza di
finterazione
(normalizzata)
di
% cariche positive
3
La conclusione è che
per target ad alta
valenza conviene usare
un NS ad alta % di
funzionalizzazione
Valenza Target
2
1
0
25
50
75
% funzionalizzazione NS
per massima interazione
RUOLO DELLA DIMENSIONE DEL NS
I gruppi funzionali sono più lontani
I gruppi funzionali sono più vicini
Il “peso” relativo della frazione
funzionale è però maggiore nel
NS più piccolo
La superficie di
contatto con il
target è
direttamente
proporzioanela
alla dimensione
del NS
Ruolo delle dimensioni nell’interazione con il target biologico: NS non funzionalizzati
In this work, the focus is on spherical
particles not coated with ligand molecules and with a size
ranging from 0.5 μm up to 0.10 μm. The adhesive performances
of these particles is assessed in terms of the number
of particles adhering non-specifically to a confluent layer of
endothelial cells under fixed hydrodynamic conditions in a
parallel plate flow chamber.
Particelle commerciali di
polistirene (Fluoresbrite)
Numero totale di particelle legate
Particelle legate alle cellule
Densità delle
particelle legate
alle cellule
Conclusions: (i) the absolute number of particles
adherent to the cell layer per unit surface decreases
with the size of the particle as d −1.7; (ii) the
volume of the particles adherent per unit surface
increases with the size of the particles as d +1.3.
From these results and considering solely nonspecifi c particles, the following hypothesis are
generated (i) use the smallest possible particles in
biomedical imaging and (ii) use the largest
possible particles in drug delivery.
Densità delle
particelle
legate in
totale
Ruolo delle dimensioni nell’interazione con il target biologico: NS funzionalizzati
Herceptin
Herceptin (Trastuzumab) is a monoclonal antibody that
interferes with the HerbB2 receptor, a tyrosine kinase. The
Herb receptors are proteins that are embedded in the cell
membrane and communicate molecular signals from outside
the cell to inside the cell, and turn genes on and off. The
Herb proteins regulate cell growth, survival, adhesion,
migration, and differentiation—functions that are amplified
or weakened in cancer cells. In some cancers, notably some
breast cancers, HerbB2 is over-expressed, and, among other
effects, causes breast cells to reproduce uncontrollably
Au-NP
Target: HerbB2 receptor over
expressed by SK-BR-3 human breast
cancer cells
Andamento della quantità di
proteine legata alle NP in
funzione delle loro dimensioni.
Nature Nanotechnology 2008, 3, 145-150
Densità della proteina sulla
superficie della NP in funzione
della dimensione (è possibile
che vi siano modi diversi di
complessazione!)
L’affinità per il target dipende dalla
dimensione: NP più grandi hanno una
affinità maggiore.
L’affinità si correla con la densità della
proteina sulla NP.
ATTENZIONE: l’affinità è misurata in
funzione della concentrazione di NP e NON
di proteina!
Au-NP
(7.550
nm)
IgE
FcεεRI
Target: complesssi IgEFcεεRI nei mastociti con
conseguente variazione
della trasmissione del
segnale cellulare
Varia la
densità sulla
superficie
Rilascio di β-esosaminidasi
(degranulazione)
Determinazione del grado di copertura delle Au-NP con il tiolo
funzionalizzato con il dinitro derivato mediante spostamento della
Rodamina 6G dalla superficie.
Rodamina 6G
Concentrazione di Au-NP alla
quale si osserva la massima
degranulazione
Valore limite di
dimensione per
ottenere il massimo
effetto di
degranulazione
Risultati ottenuti
variando la
concentrazione di tioli
funzionali su Au-NP di
19.8 nm
Grafico dose/risposta
nell’inibizione della
degranulazione da parte di un
sistema multivalente costituito
da BSA-DNP
The family Neisseriaceae consists of
Gram-negative aerobic bacteria from
fourteen genera. The genus
Neisseria contains two important
human pathogens, N. gonorrhoeae
and N. meningitidis. N. gonorrhoeae
causes gonorrhea, and N.
meningitidis is the cause of
meningococcal meningitis. N.
meningitidis infections have a low
prevalence and high mortality.
Neisseria meningitidis scanning EM
Neisseria meningitidis has 13 clinically significant serogroups. These are classified according
to the antigenic structure of their polysaccharide capsule.
Saccharides-functionalyzed
nanoparticle
RS
a polyvalent interaction
SR
RS
Au
SR
RS
O
OH NHAc
O
HO
HO
OH NHAc
O
1
O
P O
Na -O
HO
HO
O
4
O
2
HO
HO
H
N
O
SH
HO
HO
O
P
O
O
NHAc
O
HO
HO
O
P O
Na O
HO
HO
O
NHAc
O
3
H
N
O
7
SH
O
O
NH2
NHAc
O
O
P O
Na O
HO
HO
NHAc
O
6 O
SH
O
NHAc
5
O
H
N
O
Adv. Mater. 2008, 20, 4348-4352
O
P
O
O
HO
HO
O
O
P O
O
HO
HO
OH NHAc
O
Na
NH2
OH NHAc
O
Na
OH NHAc
O
Na
O
HO
HO
SH
NHAc
O
HO
HO
A
O
O P
O-
H
N
OH NHAc
O
HO
HO
O
HO
RO
O
SR
NHAc
NH2
Amplification of the interaction between the antibody
and the saccharide-functionalized nanoparticle
antibodies
competitive
antigen
100
Antigen
(MenA)
cleave
1.wash
% Inhibition
80
5 nm
nanoparticles
Men A
nanodimer
and
nanotrimer
60
40
2.
nano
mono
20
Test ELISA
0
1,0E-10
1,0E-08
1,0E-06
1,0E-04
Concentration / M
1,0E-02
The strength of the interaction depends on the density of the saccharides
on the monolayer and on the size of the nanoparticle: the largest 100%
functionalized nanoparticles show the strongest binding with the antibodies
40
80
35
70
5 nm NPs
30
25
50
107 IC50 / M
107 IC50 / M
60
40
30
20
15
20
10
10
5
0
50
60
70
80
90
100
0
2
% Saccharide
2,5
3
3,5
Size / Ǟ
Di-saccharide-functionalized NPs
4
4,5
5