CENTRIFUGAZIONE
Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza
centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre.
Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete
tenderanno a sedimentare per effetto della gravità.
Per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è
proporzionale alla forza applicata, conseguentemente
macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando
la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla
terra.
Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione
Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre
aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col
fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e
dimensioni e quindi sedimentano con velocità diversa sotto
l’influenza di un campo centrifugo applicato.
TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate)
Centrifughe a bassa velocià (max3.000-6.000 g) si usano per raccogliere
organelli di grandi dimensioni e precipitati grossolani.
Microcentrifughe (10.000 g) sono capaci di accelerazioni rapide.
Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule.
Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre
attraverso il rotore.
Centrifughe ad alta velocità (max 60.000g) utili per frazionamento cellulare.
Ultracentrifughe (MAX 600.000 g) possiedono sistemi di vuoto e
refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come
i ribosomi e le vescicole di membrana.
Tecniche centrifugative
Le tecniche di separazione per centrifugazione si basano sul comportamento delle
particelle quando esse vengono sottoposte ad un campo centrifugo.
Tecniche di centrifugazione preparativa: permettono di separare, isolare e
purificare cellule intere, organuli subcellulari, membrane plasmatiche, polisomi,
ribosomi, cromatina, acidi nucleici, complessi proteici e virus.
Tecniche di centrifugazione analitica: servono a studiare macromolecole già
pure o praticamente pure.
Tipi di rotore
Rotore ad angolo fisso
Rotore basculante
Principi base della sedimentazione
La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo G, diretto
radicalmente verso l’esterno. Il campo è funzione del quadrato della velocità
angolare del rotore (w espressa in rad s-1) e della distanza radiale (r ) espressa
in centimetri della particella dall’asse di rotazione.
Campo centrifugo G= w2 r
La velocità del rotore può essere espressa in termini di
rivoluzioni al minuto (rev min –1).
Il campo centrifugo G espresso in termini di rivoluzioni al minuto è
espresso come multiplo della forza gravitazionale terrestre (g= 980 cm/s), cioè
come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il
peso della stessa sottoposta alla sola forza di gravità. Esso viene quindi
riportato come campo centrifugo relativo o più semplicemente come
“numero di g”.
Quando si riportano le condizioni di separazione di particelle è necessario specificare la
velocità del rotore, le dimensioni del raggio e il tempo di centrifugazione.
La velocità di sedimentazione dipende comunque anche
1) dalla massa della particella;
2) dalla densità del mezzo;
3) dalla forma della particella.
Questi parametri pratici ovviamente modificano l’equazione teorica.
Coefficiente di sedimentazione
La velocità di sedimentazione (v) di una particella può essere anche espressa in termini
di velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, più comunemente
chiamato coefficiente di sedimentazione, s.
Il valore sperimentale per il coefficiente di sedimentazione è una funzione della
temperatura,
viscosità e
densità della soluzione.
Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato viene corretto in quel
valore che si otterrebbe in acqua a 20°C e viene riportato come coefficiente di
sedimentazione standard, s20,w.
Il coefficiente di sedimentazione di molte macromolecole, inclusi acidi nucleici e
proteine, di norma diminuisce all’aumentare della concentrazione del soluto. Per questo
motivo si misura il coefficiente a diverse concentrazioni di soluto e si estrapola il valore a
concentrazione nulla.
Per la maggior parte delle particelle biologiche i coefficienti di sedimentazione sono
valori molto piccoli e, per convenzione, il loro valore unitario di base è:
10-13 s , detta unità Svedberg (S)
Ad esempio, una molecola di RNA ribosomale che ha un coefficiente di
sedimentazione pari a 5x10-13 s ha un valore di 5 S
In genere, più grande è la molecola o la particella e maggiore è la sua unità
Svedberg. Pertanto maggiore la sua velocità di sedimentazione.
Esempi:
enzimi, ormoni
Acidi nucleici
Ribosomi e polisomi
Virus
tra 2 a 25 S
tra 3 a 100 S
tra 20 a 200 S
tra 40 a 1000 S
Centrifughe e loro utilizzo
Piccole centrifughe da banco.
Generalmente la loro velocità massima è tra 4.000 e 6.000 rev min –1 , per un
campo centrifugo relativo variabile tra i 3.000 e i 7.000 g.
Microcentrifughe.
8.000-13.000 rev min –1
pari a 10.000g
Centrifughe refrigerate a grande capacità
6.000 rev min –1
Centrifughe refrigerate ad alta velocità
25.000 rev min –1
Ultracentrifughe preparative
Possiedono rotori in grado di raggiungere 80.000 rev min –1 e di generare un campo
centrifugo relativo di 600.000 g. La camera del rotore è refrigerata, sigillata e viene
mantenuto il vuoto all’interno onde minimizzare gli attriti che si possono generare tra il
rotore in movimento e l’aria e che causerebbero un aumento di temperatura. Il sistema
di controllo della temperatura utilizza un sensore a infrarossi che registra di continuo la
temperatura.
Ultracentrifughe analitiche
La velocità raggiunge i 70.000 rev min –1 (500.000 g).
Sono costituite da un rotore alloggiato in una camera in cui sia stato fatto il vuoto e di un
sistema ottico di rivelazione del materiale che va sedimentandosi durante la
centrifugazione.
Importante! Sempre equilibrare le provette!!!
Frazionamento cellulare
Le cellule possono essere rotte in vario modo: shock osmotico, ultrasuoni,
frantumandole per omogeneizzazione. Questi procedimenti rompono molte
membrane ma lasciano intatti gli organuli che possono essere separati sulla
base delle loro dimensioni e densità.
Metodi di separazione
Sedimentazione differenziale: la centrifugazione di una sospensione di
particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e
di un sovranatante
Centrifugazione in gradiente di densità
Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente
Gradienti
Continuo(a)
Discontinuo (b)
Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare
selettivamente una particella (c)
Centrifugazione Zonale
Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della
massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)
Centrifugazione Isopicnica
Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il
saccarosio o il ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione).
Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga
per il tempo necessario per la formazione dei gradienti.
Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la
loro densità è uguale a quella del mezzo)
Classificazione CENTRIFUGHE per velocità
VELOCITA'
Velocità (rpm)
BASSA
7.000
MEDIA
14.000
ALTA
ULTRA
26.000
100/150.000*
Gravità (xg)
7.200
18.000
75.000
800/901.000*
Capacità
9 litri
1 litro
3 litri
1.500/40 ml
Raffreddamento
no
alcune
tutte
Vuoto
no
no
alcune
tutte
tutte
Equipaggiament
o
angolo fisso
oscillante
micropiastre
cyto
angolo fisso
oscillante
micropiastre
tamburo
angolo fisso
oscillante
verticale
zonale
flusso continuo
tamburo
angolo fisso
oscillante
verticale
neo-verticale
zonale
flusso continuo
Materiale
(equipaggiament
o)
mat. plastico
alluminio
mat. plastico
alluminio
alluminio
composito
alluminio
composito
titanio
Posizionamento
banco/pavimento
banco/pavimento
banco/pavimento
pavimento/banco
Tipo di separazione
tipo equipagg.
Pelleting
Isopicnica
Rate-zonal
angolo fisso
eccellente
variabile*
no
oscillante
inefficiente
buono
buono
verticale
no
eccellente
buono
zonale
no
buono
eccellente
*
buono:
macromolecole
inefficiente:
cellule,
nuclei,
mitocondri
Selezione delle bottiglie e/o provette
La scelta del tipo di provetta o bottiglia più adatta alla centrifugazione
dovrà tener conto dei seguenti fattori:
adattabilità agli alloggiamenti dell'equipaggiamento rotante
resistenza meccanica (rottura delle provette)
resistenza chimica
resistenza alla temperatura
trasparenza
autoclavabilità
facilità di pulizia
sterilizzazione
economicità
La resistenza meccanica delle provette in plastica è influenzata da diversi
fattori: limiti fisici dei materiali costruttivi, interazione di tali limiti con agenti
chimici, presenza o meno di tappi di chiusura, lavaggi, processi di
sterilizzazione, tempo e durata della centrifugazione.
I prodotti chimici influenzano le caratteristiche meccaniche, la flessibilità e
le proprietà fisiche delle provette.
I materiali per provette più utilizzati sono:
Polipropilene copolimero (PA) Copolimero lineare con aggiunta di etilene e propilene;
disponibile con parete sottile e spessa, normalmente elencato come PA (Poliallomero).
Ha buone proprietà chimiche e di media trasparenza; adatto per pelletting e
separazione in gradiente di densità.
Eccellente per essere tagliato (sliceable) o perforato (pierceable) e ideale per
centrifugazioni a bassa temperatura.
Sia a temperatura ambiente che a bassa temperatura di centrifugazione, ha buona
resistenza meccanica a basse e medie velocità.
Policarbonato (PC) Trasparente e rigido, buona resistenza agli acidi con ottima
compatibilità verso le soluzioni di acido diluito. Disponibile con parete spessa e sottile,
in tubi o bottiglie. Autoclavabile e riutilizzabile.
Sia a temperatura ambiente che a basse temperature di centrifugazione, mantiene la
propria rigidità e resistenza meccanica anche ad alte velocità.
Polipropilene (PP) Traslucido. Buone proprietà chimiche. Richiesto quando è
necessario ottenere una netta interfaccia tra separazioni di particelle con diverso
coefficiente di densità (layer).
A temperatura ambiente mantiene la propria forma originale e la propria resistenza
meccanica anche ad alte velocità.
A basse temperature di centrifugazione non è consigliabile, dato che aumenta la
propria fragilità.
Polietilene (CPE) Polimero opaco, ideale per acido acetico o idrofluorico.
Adatto per taglio e foratura, nelle centrifugazioni in gradiente.
Utilizzato quando necessitano basse temperature di centrifugazione.
Polistirene (PS) Rigido e non tossico; trasparente e compatibile con la maggior parte
delle soluzioni acquose. Normalmente utilizzato per pelletting.
Polisulfone (Phenylene-Isopropylidene) (PSF) Di colore giallo trasparente. Resistente
agli acidi, basi, alcool e idrocarburi. Ottima resistenza alla temperatura.
Teflon (FEP) Traslucido, flessibile e ad alta densità. Resiste a temperature di esercizio
molto basse. Eccellente con Acetone e altri solventi. Autoclavabile e sterilizzabile.
Riduce le proprie qualità quando utilizzato ad alta forza di gravità con temperature
>20 °C.
Vetro (VJ) Duran 50
Vetro (VS) Vetro soffiato
Corex (C) Per centrifugazioni a basse e medie velocità. Cinque volte più resistente del
vetro convenzionale. Buono per alte temperature.
La vita media delle provette in vetro è in funzione della frequenza d'uso, della
accelerazione centrifuga relativa, dei lavaggi, abrasioni, cura del trattamento. Gli sforzi
sviluppati in questi processi si accumulano nei vetri VJ e VS, i quali peraltro hanno
un'eccellente resistenza chimica e possono sopportare velocità moderate se usati con
gli opportuni riduttori/adattatori.
Con gli appositi riduttori/adattatori le provette in Corex possono essere usate a velocità
medio-alte.