• CENTRIFUGAZIONE
• SEPARAZIONE di sostanze basata sul differente
comportamento di particelle (o molecole) in CAMPO
GRAVITAZIONALE
• PREPARATIVA
•
•
•
•
per separare:
cellule
frazioni subcellulari
organelli, virus, membrane
macromolecole
• SI PARTE da grandi quantità di materiale
• ANALITICA
• studio delle caratteristiche di SEDIMENTAZIONE
• di molecole o particelle PURE
• MONITORAGGIO- - > equip. speciale
– SI UTILIZZANO piccole quantità di materiale da
analizzare
Campo gravitazionale artificiale
Fc = m2r
Fc = m2r
• m = massa (peso della particella in grammi)
• 2 = velocità angolare del rotore (rad/sec)
• r = distanza dall’asse di rotazione (cm)
• Fg = mg
• Fg = Forza di gravità
• g = accellerazione della forza di gravità
pari a 980 cm x sec-2
RCF (Relative Centrifugal Field) Forza Centrifuga
Relativa
•RCF = Fc/Fg = m2 r
mg
=
2 r
g
•  = numero di giri al minuto
• RCF = 4 p (rpm)2 r = 1.118 x 10-5 x rpm2 r
•
3600 x 980
• RCF rapporto tra peso di una particella sottoposta ad
un campo centrifugo ed il peso della stessa soggetta
al solo campo centrifugo gravitazionale
x
x
Fc = m2r
RCF (Relative Centrifugal Field) Forza
Centrifuga Relativa
• RCF: rapporto tra peso di una particella
sottoposta ad un campo centrifugo ed il
peso della stessa soggetta al solo campo
centrifugo gravitazionale
raggio
RCF
x g
Velocità rotore
rpm
Tipi di rotori
• a braccio oscillante
• ad angolo fisso
ROTORI
• A BRACCIO OSCILLANTE:
• a riposo è in posizione verticale
• durante la centrifugazione il campione si
dispone in posizione perpendicolare all’asse di
rotazione e parallela al campo centrifugo
applicato;
• durante la decelerazione, il campione ritorna
nella posizione originaria.
AD ANGOLO FISSO
• tubi ospitati in alloggiamenti inclinati secondo un
angolo fisso, da 15° a 40°
• sotto l’influenza del campo centrifugo le particelle si
muovono in senso radiale, incontrano la parte della
provetta e precipitano su di essa formando un
sedimento piccolo e compatto
• - cammino delle particelle breve
• - sedimentazione rapida
CENTRIFUGHE DA BANCO
• 4000 - 15000 rpm (RCF fino a 10000 x g)
• Possono alloggiare sia rotori ad angolo fisso che a
braccio oscillante.
• utili per centrifugare volumi relativamente piccoli
(frazioni di ml --> 50 ml)
• si utilizzano generalmente per isolare rapidamente
materiali che sedimentano velocemente
• (cellule, nuclei, ac.nucleici o proteine, etc.)
• possono essere refrigerate o a temperatura ambiente
CENTRIFUGHE DI GRANDE CAPACITA'
•
•
•
•
•
sono sempre refrigerate
capacità da pochi ml a oltre a 2 litri
fino a 8000 rpm (10000 x g)
fino a 25000 rpm (60000 g)
- sedimentazione di cellule, batteri, frazioni
subcellulari di grandi dimensioni, acidi
nucleici, proteine
• - rotori ad angolo fisso o a braccio oscillante
• -BILANCIAMENTO
ULTRACENTRIFUGA PREPARATIVA
•
•
•
•
•
•
•
- volumi fino a 200-300 ml
- Vel. Max 80000 rpm (RCF fino a 600000 g)
- Refrigerate, con camera del rotore sigillata e
sotto vuoto
- controllo della temperatura, velocità e del
bilanciamento
- camera del rotore corazzata
• - sedimentazione di acidi nucleici, proteine, piccoli
• organelli (es: ribosomi)
La sedimentazione di una particella in soluzione,
soggetta ad un campo centrifugo DIPENDE:
•
•
•
•
•
Dal campo centrifugo applicato
Dalla sua densità (massa e volume)
Dalla densità e/o viscosità del mezzo
Dalla forma della particella
Dalla distanza tra la particella e l’asse di
rotazione
• tempo di centrifugazione
• PARTICELLE CON MASSA DIVERSA
sottoposte allo stesso campo centrifugo
sedimentano a velocità diversa
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
Basata sulla differente velocità di sedimentazione di
particelle dotate di diverse dimensioni e densità
Se particelle diverse hanno stessa massa ma diversa
densità, quelle a densità maggiore sedimentano più
velocemente.
Le particelle vengono separate mediante varie tappe
di centrifugazione aumentando di volta in volta il
campo centrifugo applicato (RCF) in modo da ottenere
in ogni tappa un SEDIMENTO contenente uno
specifico tipo di particelle,
ed un SOPRANATANTE contenente tutte le particelle
non sedimentate
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
L’analisi della sedimentazione di una particella in
Sospensione può essere utilizzata per studiarne le
sue proprietà
Le dimensioni di una particella hanno la maggior influenza
sulla velocità di sedimentazione;
Particelle di dimensioni diverse = tempi di sedimentazione
diversi
Una miscela di particelle eterogenee e
approssimativamente sferiche possono essere separate
mediante centrifugazione sulla base della loro dimensione
(o densità) in termini di:
* tempo necessario per la loro sedimentazione completa
* entità della sedimentazione in un definito periodo di
tempo
La velocità di sedimentazione di una particella può
essere espressa in termini di coefficiente di
sedimentazione (s) che corrisponde alla velocità di
sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato
Il coefficiente di sedimentazione ha le dimensioni
di un tempo e si misura in Svedberg, S.
1 S = 10-13 sec
Esempio: s = 5 x 10-13 sec corrisponde a 5S
Specie sedimentate
Enzimi, ormoni e proteine
Acidi nucleici
Ribosomi, polisomi
Virus
Lisosomi
Membrane
Mitocondri
Coeff. di sedimentazione
2 – 25S
3 – 100S
20 - 200S
40 – 1000S
4000S
100 – 100000S
20000 – 70000S
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’
•
•
•
•
Sfrutta differenze di:
dimensioni
forma
densità
GRADIENTE DI DENSITA’
• CARATTERISTICHE
• Materiali con buona solubilità
• Poco costoso, Non tossico, non deve
interagire con le particelle da separare
• Materiali Puri
• SOSTANZE USATE
• Sali di minerali pesanti
CsCl
• Piccole molecole organiche
Saccarosio
• Polimeri sintetici
Ficoll
• Silice colloidale
Percoll
Dispositivi per la preparazione di un gradiente
Gradiente lineare
Gradiente discontinuo
CENTRIFUGAZIONE ZONALE
separazione di particelle con densità simile ma massa
(e quindi dimensioni) diversa.
1) Formazione di un gradiente continuo di densità
2) stratificazione del campione sul gradiente di
SACCAROSIO
3) centrifugazione per un tempo sufficiente alla
sedimentazione delle particelle in ZONE discrete, ma
NON sufficiente per la sedimentazione al fondo della
provetta
4) raccolta di frazioni per l’analisi
Usata per la separazione di organelli, proteine,
ibridi RNA –DNA, subunità ribosomali etc.
CENTRIFUGAZIONE ISOPICNICA
o ALL’EQUILIBRIO
Separa le particelle di una miscela esclusivamente in base alla
DENSITA’, e NON in base alla forma ed alle dimensioni.
E’ INDIPENDENTE dal tempo di centrifugazione.
-Il gradiente di densità può essere continuo o discontinuo
-(viene allestito utilizzando una soluzione la cui densità massima DEVE
essere superiore a quella di tutte le particelle da separare)
- Stratificazione del campione nel caso di gradienti discontinui
- CENTRIFUGAZIONE ALL’EQUILIBRIO
(cioè, per un tempo sufficiente affinché TUTTE le particelle
raggiungano una regione del gradiente dove la loro densità
corrisponde a quella presente in quella zona del gradiente)
- raccolta delle frazioni per l’analisi;
USATA PER LA SEPARAZIONE DI POPOLAZIONI
CELLULARI, FRAZIONI SUBCELLULARI DI SIMILI
DIMENSIONI ETC.
Separazione di DNA plasmidico da quello del cromosoma batterico
Mediante centrifugazione all’equilibrio in gradiente di Cloruro di Cesio
Un esempio di applicazione
della centrifugazione in
GRADIENTE DI DENSITA’