CROMATOGRAFIA LIQUIDA A
FASE INVERSA
Fase stazionaria e’ costituita da catene idrocarburiche
apolari (butile, ottile, ottadecile) che formano un film
liquido legato al supporto di silice
Fase mobile è un solvente polare (puo’ essere un
tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele)
La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura
solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti.
La separazione cromatografica avviene principalmente
sulla base delle caratteristiche della fase mobile.
Gli analiti polari eluiscono per primi
e quelli non polari per ultimi
Poiché il numero di piatti teorici è correlato
all’area di superficie della fase stazionaria,
ne consegue che particelle di dimensioni
minori forniranno un
grado di risoluzione maggiore
In HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) si
utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a quelle
usate nella cromatografia classica.
numero più alto di piatti teorici
aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente
(aumento di pressione)
Colonna cromatografica rivestita in acciaio
Le tecniche di centrifugazione si basano sul comportamento delle molecole quando
esse sono sottoposte ad un campo centrifugo, assumendo che i parametri delle
molecole analizzate – quali la massa molecolare relativa, la forma e la densità –
siano correlati al loro comportamento in un campo gravitazionale.
Particelle in soluzione, se lasciate in condizioni di quiete, tenderanno a
sedimentare per effetto della gravità. Per ogni particella, la velocità alla quale
essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, per cui le particelle
sedimentano più rapidamente quando la forza applicata è maggiore di quella di
gravità esercitata dalla terra.
In alcuni casi (fluidi biologici) il tempo impiegato per la sedimentazione spontanea
sarebbe troppo lungo ed alcune particelle impiegherebbero anni per sedimentare.
Lo scopo delle tecniche centrifugative è quindi quello di esercitare una forza
maggiore del campo gravitazionale terrestre, aumentando in tal modo la velocità
di sedimentazione delle particelle.
Ai fini della centrifugazione, le particelle di interesse sono risospese
in un adatto solvente e poste in provette o bottiglie alloggiate in un
rotore.
Il rotore è posto centralmente sull’albero motore della centrifuga.
Particelle che differiscono per densità, forma o dimensioni possono
essere separate poiché sedimentano con velocità diverse quando
sono sottoposte ad un campo centrifugo, ogni particella con una
velocità direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato.
La velocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo applicato (G), diretto
radialmente verso l’esterno; il campo è funzione del quadrato della velocità
angolare del rotore (ω, espressa in rad s-1) e della distanza radiale (r, espressa in
cm) della particella dall’asse di rotazione, in base all’equazione:
G = ω2r
Dunque se la provetta contenente il campione di interesse è fatta ruotare in
circolo, la soluzione è sottoposta ad una forza di gravità artificiale
proporzionale alla distanza dal centro di rotazione ed al quadrato della velocità
di rotazione.
Dal momento che ogni rivoluzione del rotore è pari a 2 radianti, la sua velocità
angolare (in rad s-1) può essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto
(rev min-1), che è poi il modo più frequente di esprimere la velocità del rotore:
= 2 rev min-1
60
Il campo centrifugo (G) espresso in termini di rev min-1 diventa quindi:
G = 4 2 (rev min-1)2 r
3600
Generalmente il campo centrifugo è espresso come multiplo della forza
gravitazionale terrestre (g = 980 cm sec-2), cioè come rapporto tra il peso della
particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa sottoposta alla
sola forza di gravità. Esso è quindi riportato in termini di Campo Centrifugo
Relativo (RCF) o, più semplicemente, come “numero di g”.
Quindi:
RCF= 4 2 (rev min-1)2 r
3600 x 980
Per il calcolo del campo centrifugo relativo in una centrifuga
si utilizza la seguente formula:
RCF = 1,12r (RPM/1000)2
RPM = velocità di rotazione giri min-1 (rev min-1)
r = raggio dell’equipaggiamento espresso in mm
Quando si riportano le condizioni per la separazione delle particelle tramite
centrifugazione devono essere specificati velocità del rotore, dimensioni del
raggio e tempo di centrifugazione.
Dal momento che le analisi biochimiche sono condotte di solito su particelle
disciolte o sospese in soluzione, la loro velocità di sedimentazione dipende
non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche da:
1.
Massa della particella, una funzione del suo volume e della sua densità
2.
Densità e viscosità del mezzo nel quale essa sta sedimentando
3.
Da quanto la sua forma differisce da quella sferica
Quando una particella sedimenta deve spostare una parte di liquido nel
quale si trova sospesa, generando una spinta apparente verso l’alto, pari
al peso di liquido spostato.
Assumendo che una particella sia sferica, con volume e densità noti, dopo
aver corretto la sua densità per la “galleggiabilità” dovuta alla densità del
mezzo, allora la forza (F) che incontra quando è centrifugata con una
velocità angolare ωrads-1 è data da:
F
4  rp3 (ρp – ρm) ω2r
3
dove 4/3  rp3 è il volume della sfera di raggio rp, ρp è la densità della
particella, ρm è la densità del mezzo in cui essa si trova sospesa, ed r è la
distanza della particella dall’asse di rotazione.
Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano nella soluzione;
se si tratta di una particella rigida, di forma sferica che si sposta con una
velocità nota, la forza di attrito (F0) che si oppone al suo spostamento è data
da:
F0 = vf
dove v è la velocità di sedimentazione della particella , ed f è il coefficiente
d’attrito per quella particella nel solvente.
Il coefficiente d’attrito f di una particella dipende dalle sue dimensioni, forma
e grado di idratazione, oltre che dalla viscosità del mezzo.
Una particella sferica, non idratata, di volume e densità noti, sospesa in un mezzo
a densità costante, sottoposta ad un campo centrifugo, è soggetta ad
accelerazione finchè la forza applicata non diventa uguale alla forza d’attrito che
si oppone al suo movimento nel mezzo.
Nella pratica, l’equilibramento tra queste due forze si realizza abbastanza
rapidamente, dopo di che la particella si muove con velocità costante, poiché la
forza di attrito aumenta con la velocità della particella. In queste condizioni, la
forza risultante che agisce sulla particella è pari a zero; perciò essa non accelera
più, avendo raggiunto la velocità massima che la porta a sedimentare con una
velocità costante.
La velocità di sedimentazione di una particella (v) può anche essere espressa in
termini di velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato,
più comunemente definita coefficiente di sedimentazione, s.
Quando la composizione del mezzo di sospensione è definita, la velocità di
sedimentazione è proporzionale ad ω2r (G) → v = sω2r
s = v / ω2r
Il valore determinato sperimentalmente per di coefficiente di sedimentazione è
una funzione di temperatura, viscosità e densità della soluzione.
Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato è corretto in quel
valore che si otterrebbe in acqua, a 20°C e viene riportato come coefficiente di
sedimentazione standard (s20,w).
Per la maggior parte delle molecole biologiche, i coefficienti di sedimentazione
sono valori molto piccoli, quindi si utilizza come unità di misura l’unità
Svedberg (S), pari a 10-13 s.
Esempio: una molecola di RNA ribosomale avente coefficiente di
sedimentazione pari a 5 x 10-13 s ha un valore 5 S.
In generale una particella più grande ha una unità Svedberg maggiore e quindi
una maggiore velocità di sedimentazione.
La centrifugazione può essere adoperata per separare molecole con diversi
coefficienti di sedimentazione.
1
10
102
103
104
S
enzimi –
ormoni peptidici proteine solubili
2 – 25 S
acidi nucleici
3 - 100 S
polisomi
20 - 220 S
virus
40 - 1000 S
lisosomi
4000 S
membrane
100 - 100.000 S
mitocondri
20.000 - 70.000 S
nuclei
4x105 – 4x107 S
da banco
centrifughe
separazioni rapide di
sospensioni grossolane
preparative
separazioni preparative di
particelle diverse
fra loro
analitiche
analisi di particelle già pure
per studiare le
caratteristiche di
sedimentazione delle
macromolecole
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
•
Si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle con
diversa forma e densità
•
Il materiale è separato in un certo numero di frazioni per
centrifugazioni successive aumentando gradualmente il campo
centrifugo applicato
•
Si tratta di una metodica adoperata per l'isolamento degli
organuli cellulari a partire da omogenati di tessuto
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ
Consente di determinare la densità idrostatica ed
il coefficiente di sedimentazione delle molecole
Zonale:
• dipendente dal
tempo di centrifugazione
• utilizza un gradiente preformato
• la separazione si basa principalmente sulle diverse dimensioni molecolari
Isopicnica (uguale densità):
• è una tecnica all'equilibrio
• indipendente dal tempo di centrifugazione
• utilizza un gradiente autoformantesi
• separa particelle di dimensioni simili (organuli cellulari) ma diverse in densità (non
separa proteine solubili che possiedono densità molto simili)
Il gradiente
• è costituito da una materiale inerte nei confronti del materiale
biologico (CsCl per acidi nucleici, saccarosio per proteine e
particelle subcellulari)
• stabilizza la colonna di liquido all'interno della provetta
• previene il rimescolamento
• migliora la risoluzione della separazione
• consente la separazione della maggior parte o, talora, di tutti i
componenti di una miscela
ULTRACENTRIFUGA ANALITICA
1. determinazione della massa molecolare relativa
2. analisi delle variazioni conformazionali
3. studi sulla purezza del campione
Velocità massima= 500.000 g (campo centrifugo relativo)
E’ costituita da: motore, rotore contenuto in una camera
refrigerata in cui sia fatto il vuoto,
sistema ottico di rivelamento del
campione che sedimenta durante la
centrifugazione
DETERMINAZIONE DELLA MASSA MOLECOLARE
A) Metodo della velocità di sedimentazione
Durante la sedimentazione una molecola tende a diffondere radialmente
nella soluzione in funzione della sua densità.
Tale fenomeno si riflette in un allargamento del picco di sedimentazione.
Essendo costante la v di sedimentazione è possibile risalire al coefficiente
di diffusione D misurando l’incremento dell’area del picco in funzione
del tempo.
Equazione di Svedberg:
PM
sRT
D(1-vρm)
volume specifico parziale = l’aumento di volume che si verifica
quando 1 g di soluto è aggiunto ad un volume infinito di
soluzione
B) Equilibrio di sedimentazione (l’equilibrio è tra la forza centrifuga che fa
sedimentare la molecola e la tendenza di questa a diffondere nel solvente)
Facendo girare il rotore a basse velocità la molecola si dispone nella cella
secondo un gradiente di concentrazione che va dal menisco al fondo della
cella. Si misurano due valori di concentrazione della molecola (ca e cb)
in due punti che distano diversamente dal centro di rotazione (ra e rb, rb>ra).
PM = 2 RT ln(cb-ca)
ω2(1-vρ) (r2b-r2a)
ci : concentrazioni a distanza ri dall’asse di rotazione
R: costante dei gas
T: temperatura in Kelvin
ANALISI DELLE VARIAZIONI CONFORMAZIONALI
Le variazioni conformazionali di una molecola possono essere saggiate
esaminando le differenze di velocità di sedimentazione.
Molecola più compatta
Molecola meno compatta
minore attrito con il solvente
maggiore attrito
(sedimentazione più lenta)
 DNA a singola o doppia elica
 DNA lineare o circolare
 Proteine trattate con urea o altri denaturanti possono essere
disaggregate nelle subunità costituenti (protomeri)
 Proteine allosteriche possono subire variazioni conformazionali in
seguito al legame col substrato e/o piccoli ligandi (attivatori e
inibitori)
STUDI SULLA PUREZZA DEL CAMPIONE
L'ultracentrifugazione analitica è utilizzata per determinare la purezza delle
preparazioni di:
• DNA
• Virus
• Proteine
 L'omogeneità della soluzione è verificata mediante l'analisi del fronte di
sedimentazione (essa è generalmente caratterizzata da un unico e ben
definito fronte di sedimentazione)
 Le impurità si traducono in picchi addizionali, spalle del picco principale
o asimmetria del picco