Centrifugazione • Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (Campo centrifugo). • Viene sfruttata la differenza di densità tra le particelle ed il mezzo in cui sono sospese Il principio della centrifugazione Campo gravitazionale indotto con la centrifugazione Sopranatante Precipitato (pellet) Sospensione Separazione completata Campo centrifugo • Il campo centrifugo (G) è dato da: G 2r • Dove è la velocità di rotazione espressa in radianti·s-1 r è la distanza dall’asse di rotazione. • Per esprimere la velocità di rotazione in giri·min-1 (RPM): 2 RPM 60 • Il campo centrifugo viene quindi definito come: 4 2 ( RPM ) 2 G r 3600 Campo centrifugo relativo • In genere il campo centrifugo viene espresso come campo centrifugo relativo (RCF) come multiplo della costante gravitazionale (980 cm·s-2): G 4 ( RPM ) RCF r g 3600 980 2 2 • Che diventa: 5 RCF 1.1110 ( RPM ) r 2 Velocità di sedimentazione F0 v 6a 4 F a3 ( p m ) 2r 3 Per F = F0 il moto è rettilineo uniforme 4 3 2 v 6 a a ( p m ) r 3 Velocità di sedimentazione Velocità di sedimentazione della particella Raggio della particella Densità della particella Densità del mezzo 2 a ( p m ) 2 r 9 2 Campo gravitazionale Costante per una sfera Viscosità del mezzo Velocità di sedimentazione • Se una particella ha una densità uguale a quella del mezzo: p m p m 0 0 non vi è sedimentazione. Tempo di sedimentazione • Il tempo di sedimentazione si ottiene attraverso l’integrazione della legge di Stokes tra due raggi: – rt = raggio di rotazione alla superficie e – rb = raggio di rotazione al fondo rb 9 t 2 2 ln 2 a ( p m ) rt rt rb Coefficiente di sedimentazione 2 a ( p m ) 2 r 9 2 S Coefficiente di sedimentazione 1 S (Svedberg) = 10-13 Centrifughe • Centrifuga da banco • Ultracentrifuga Centrifughe • • • • Da banco Micro Super Ultra RPM g 4000-6000 max. 16000 ~ 25000 ~ 80000 3000-7000 max. 22000 ~ 60000 ~ 600000 Centrifugazione differenziale Z Campo centrifugo A Solvente Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi Tempo di centrifugazione • All’inizio le particelle sono distribuite uniformemente nel mezzo (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni e della loro densità. • Centrifugazione in gradiente di densità: – Zonale – Isopicnica (uguale densità) Centrifugazione zonale Z Campione Gradiente di densità Campo centrifugo A Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi • All’inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo. Centrifugazione zonale (con centrifuga apposita) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Il gradiente è caricato nel rotore. il rotore è accelerato lentamente, il gradiente si riorienta Il campione è pompato ad una estremità del rotare Il campione sedimenta radialmente Alla fine il rotore decelera lentamente, Il gradiente si riorienta senza disturbare le bande di particelle Le bande vengono estratte usando una pompa peristaltica. Centrifugazione isopicnica Campo centrifugo A Z Particelle piccole Particelle medie che si vogliono separare Particelle grandi • All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A) che ha densità uguale a quella delle particelle che si vogliono separare, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del mezzo uguale alla loro. Centrifugazione isopicnica con gradiente Campo centrifugo A Z Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi • All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente uguale alla loro. Rotori I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra rmax e rmin Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso I rotori a brazzi mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente. Rotore ad angolo fisso rmax - rmin Rotore swing-out rmax - rmin Gradiente su rotore swing-out Rotori • Rotore ad angolo Fisso • Rotore zonale • Rotore swing-out Attenzione ai rotori !!!
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