Frazionamento di un lisato cellulare
tramite
CENTRIFUGAZIONE
Capitolo 3
Centrifugazione preparativa e analitica
1. Centrifugazione preparativa
Centrifugazione preparativa permette di separare
i vari elementi di un omogenato cellulare
2. Ultracentrifugazione analitica
Centrifugazione analitica è utilizzata principalmente
per gli studi di macromolecole purificate o
di complessi sovramolecolari isolati
Centrifughe
Centrifughe preparative
Centrifughe da tavolo
Centrifuga tipo
sorvall
•Massimo volume di
carico: 24
microprovette da ml
1,5/2.0
•Massima velocità
(RPM): 13300
•Massima
accelerazione
centrifuga
Ultracentrifuga analitica
Puo’ operare a velocita’ di 700.000 rpm (500.000g)
Il rotore e’ contenuto in una camera blindata,
refrigerata e sottovuoto.
Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistente
Es. TITANIO
La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per
consentire l’ osservazione del materiale che va sedimentandosi
Ultracentrifugazione analitica viene utilizzata per
determinare:
-il grado di purezza di una macromolecola
-la massa molecolare relativa di soluti nel loro
stato nativo
-le costanti di affinità tra ligandi e proteine
-esaminare i cambiamenti di massa molecolare
relativa di complessi sovramolecolari
-
studiare i
cambiamenti
conformazionali
Tipi di rotori
Rotore
Verticale
Centrifugazione
isopicnica
Rotore ad angolo fisso
separazione differenziale
Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina
Rotore a
bracci
Oscillanti
Centrifugazione
isopicnica
massima
risoluzione
delle bande
Che cosa è il campo centrifugo?
CAMPO CENTRIFUGO:
Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno
di un rotore da centrifuga
avrà una velocità di sedimentazione che sarà pari al
campo centrifugo G applicato
G = w 2r
w = velocita’ angolare del rotore
espressa come 2p rad
r = distanza radiale (cm)
della particella dall’asse di
rotazione
Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina
la velocita’ angolare (w) del rotore
si può esprimere come
velocità del rotore in giri al min= rev min-1=r.p.m.
Una rivoluzione del rotore e’ pari a 360°=
2p rev min-1 =2p r.p.m.
da cui la velocità angolare
rad sec-1
Campo centrifugo G = w
2r
r = distanza radiale della
particella dall’asse della
rotazione espressa in cm
w
= 2p r.p.m.
60
= 2p r.p.m.
60
2
r =
4p 2 (r.p.m.)2r
3600
Campo centrifugo relativo (RCF)
si esprime in g
= il rapporto tra campo centrifugo G , a uno specifico raggio,
e la velocità all’accellerazione normale g=981
campo gravitazionale terrestre g = 981 cm s -2
RCF=G = w 2r =
g
g
2 (r.p.m)2 r
4
p
=
3600 x 981
= 1.12x10-5 r.p.m2 r
RCF= = 1.12x10-5 r.p.m.2 r
RCF = rapporto tra il peso della particella sottoposta
al campo centrifugo
e il peso della particella in presenza della sola forza di gravita’
Le centrifughe sono provviste di NOMOGRAMMA
che permettono di trasformare r.p.m in g
Distanza
radiale
(mm)
ForzaRCF
centrifuga
(xg)
relativa
Velocità
del
rotore
(r.p.m)
NOMOGRAMMA
Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina
Una volta stabilito che cosa è il campo centrifugo
Ci interesserà sapere quali leggi governano la sedimentazione
Di una particella in quel determinato compo centrifugo relativo
Una miscela di particelle eterogenee,
approssimativamente sferiche,
può essere separata mediante centrifugazione,
in base alla :
1. densità
2. dimensione delle particelle,
3. tempo di sedimentazione,
4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un
periodo di tempo definito..
La velocita’ di sedimentazione n di una particella
e’ proporzionale alle sue dimensioni,
alla differenza tra le densita’ di particella e mezzo
e al campo centrifugo applicato
Legge di STOKES
h= coef . di viscosita’ del
mezzo
rp =densita’della particella
r m=densita’ del mezzo
n =2rp2(rp -r m ) w2 r
9h
rp=raggio della
particella
La velocita’ di sedimentazione
dipende anche dalla forma della particella:
una particella allungata offre maggior attrito rispetto ad una con
la stessa massa ma di forma globulare quindi le particelle allungate
sedimentano piu’ lentamente
In sommario:
La velocita’ di sedimentazione di una particella disciolta
in una soluzione dipendera’ non solo dal campo centrifugo applicato
ma anche dalla:
1.massa della particella
2.Densita’ e viscosita’ del solvente in cui avviene
la sedimentazione e
3.dalla sua forma (sferica o allungata)
Quando si riportano le condizioni per la
separazione
di particelle bisogna quindi specificare:
1) la velocita’ del rotore,
2) dimensioni dell raggio (o tipo di rotore)
3) tempo di centrifugazione
Coefficienti di sedimentazione
Il coefficiente di sedimentazione s
È dato dalla velocità di sedimentazione v su
campo centrifugo G applicato
s = v/ G = v/w2 r
E’ espresso in secondi e dipende dalla
1) temperatura
2) densita’
3) viscosita’ del mezzo
Per convenzione si usa esprimere il coefficiente di
sedimentazione trovato sperimentalmente in quel
valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’
e densita’ fosse pari all’ acqua a 20°C
xg
unita’ Svedberg
Es. 5S RNA
=5x10-13 sec
1unita’ Svedberg
= 10-13 sec
vescicole
Coefficienti di sedimentazioni
standard = Svedberg units
Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina
Segue…CENTRIFUGAZIONE
Frazionamento cellulare
Nuclei (P1)
Vescicole secretorie (P3)
Apparato del Golgi (P2)
~2µm
= GFP-Sec2p
DAPI
Centrifugazione differenziale
LT
S2
S1
S1
S2
10g
P1
P2
500g
35000g
P3
e’ la sedimentazione successiva di particelle
aventi dimensione e densità diverse
Es. schematico di centrifugazione differenziale di un lisato cellulare:
P2
P3
P1
Vescicole ER, Golgi
PM, Nucleo Mitocondri
Membrane frammentate
Lisato
ER, Golgi
S2
S1
6500g
S3
13000g
100000g
LT
S1
S1
S2
P1
P2
Esempio di
Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p
CE from wt cells
expressing GFP-Mlc1p
P1/ S1= 6.250xg
P2/ S2 = 35.000xg
P3/ S3= 100.000xg
Pdr5p : PM protein
Sec61p :ER +Golgi protein
Sec4p : vesicles and cytosol
Centrifugazione in gradiente di densita’:
Tecnica zonale di velocita’ e isopicnica
1. Nella tecnica zonale di velocita’
le particelle si separano principalmente per differenza di dimensioni,
perchè particelle biologiche di tipo simile sono spesso simili in forma e la
loro densita’ rientra in una gamma ristretta.
2.Nella tecnica isopicnica: la separazione dipende dalla densita’
idrostatica delle particelle e non dalla forma ne’ dalla dimensione ed e’
indipendente dal tempo:
Questa tecnica viene utilizzata per separare particelle di dimensioni
simili ma di diversa densita’
Materiali usati per la formazione dei gradienti
La scelta del soluto dipende dalla natura delle particelle da
separare
Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina
Separazione di velocita’ su gradiente di densita’
Il campione viene fatto stratificare su
un gradiente pre-formato la cui
densita’ massima non deve superare
quella delle particelle piu’ dense da
separare
campione
Campo
centrifugo
G
R
A
D
I
E
T
E
Nota: Gli organelli
subcellulari che hanno
densita’ differenti ma
dimensioni simili
non sono ben separati con
questo metodo
Particelle a bassa densita’
Particelle ad alta densita’
Separazione isopicnica zonale di velocità:
la corsa deve essere terminata prima che le particelle
raggiungano la base del tubo
Centrifugazione isopicnica all’equilibrio
Il gradiente non è preformato ma si genera durante
la centrifugazione
Gli organelli subcellulari che hanno
densita’ differenti ma dimensioni simili
sono separati con questo metodo
Centrifugazione isopicnica con
metodo dell’isodensita’ all’equilibrio
Campo
centrifugo
G
R
A
D
I
E
T
E
Campione +mezzo
Il campione
viene
mescolato
con il
mezzo del
gradiente
Il gradiente si
forma durante
la
centrifugazione
Particelle a bassa densita’
Particelle ad alta densita’
La centrifugazione va
fatta all’equilibrio
(densita’ idrostatica = a
quella dell gradiente)
Centrifugazione isopicnica con
metodo all’equilibrio
Campo
centrifugo
campione
G
R
A
D
I
E
T
E
Particelle a bassa densita’
Particelle ad alta densita’
Il campione viene stratificato sotto (o sopra) il gradiente la cui densita’
massima deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare
TEMPO di centrifugazione
La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella del
gradiente)
Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti
ma dimensioni simili sono separati con questo metodo
Esempi di
Sucrose Velocity
gradient
wt cells expressing GFP-Mlc1p
Esempi di
Density
gradient
2 3 4 5 6
Gradiente di saccarosio
7 8 9 10 11 12 13
wt cells expressing GFP-Mlc1p
Cellule wt +GFPMlc1p
Gradiente di saccarosio
frazioni
Metodi di determinazione della concentrazione
di proteine nel lisato cellulare
Paragrafo 8.3.2
Metodi colorimetrici:
La soluzione proteica reagisce con un reagente che da luogo
ad un prodotto colorato.
La quantita’ del prodotto viene quindi determinata allo
spettrofotometro.
Con appropriata calibratura si correla
l’ intensita’ della colorazione alla quantita’ della proteina
Metodi colorimetrici:
Metodo di Lowry, BCA e Bradford.
Metodo di Bradford
Questo metodo si basa sul legame del colorante
Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
(non molto accurato, poco sensibile 20g/cm3)
Protein + Comassie brilliant blue
(acidic, A465nm)
Protein Dye complex
(A595nm)
E’ basato sull’ immediato shift di assorbimento
da 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante
Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine in
soluzione acida.
Si assume che il colorante si leghi alla proteina via attrazione
elettrostatica dei gruppi acidi sulfonici del colorante.
Gli studi sul meccanismo della formazione di questo
complesso suggeriscono che la forma anionica del colorante
e’ la specie che complessa con la proteina.
Questa interazione
picco a 595nm
causa lo shift di assorbimento con un
Metodo di Lowry:
rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm3.
Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile
Proteine+Cu+
OH-
complesso tetracoordinato-Cu+1
+ Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenico
complesso colorato
Blu A750nm
Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente
solfato di rame in presenza di tartrato
(reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio)
si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di
A 660nm
Interference.: con tamponi Tris, e zwitterionici (PIPES, HEPES)
o contenenti EDTA
1
Assorbimento della luce ultravioletta:
utile per piccole quantita’ di proteine e per riutilizzare il campione
(sensibilita’ fino a 10g/cm3)
I residui aromatici della tirosina e triptofano
hanno un assorbimento max a 280nm.
In una miscela complessa si puo’ calcolare con buona approssimazione
che
una soluzione con A280= 1.0 (considerando 1cm di percorso) abbia una
concentrazione proteica di circa 1mg/cm3
Attenzione :
questo metodo e’ soggetto ad interferenza.
es.: anche gli acidi nucleici assorbono a 280nm
Fattore di correzione:
Proteine mg/cm3 =1.55A280-0.76A260
2
Misurazione dell’ assorbanza dei
legami peptidici a 205-210nm.
Questo metodo ha una sensibilita’ maggiore fino a >1g/cm3.
Nota che:
I legami peptidici assorbono ad un massimo di 190nm
ma gli spettrofotometri hanno scarsa resa a queste lunghezze d’onda
applicazioni:
FPLC= Fast Protein liquid chromatography
HPLC= High Performance Liquid Chromatography
METODI DI FRAZIONAMENTO delle proteine
Paragrafo 8.3.4
Frazionamento stabilità :
-denaturazione tramite temperatura
Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità :
-Sali,
-solventi organici,
-punto isoleletrico,
Frazionamento per carica:
-colonne a scambio ionico
-
Frazionamento per STABILITA’
Fattori che diminuiscono la stabilità delle
proteine:
-Temperatura
-Congelamento
-Scuotimento
-pH dei buffer di solubilizzazione
-Ossidazione
-Presenza di metalli come co-fattori
-Sali
SOLUBILITA’ differenziale delle proteine
Può essere un criterio di purificazione di
proteine da una miscela complessa
Pag 345-348
Precipitazione
della proteina
d’interesse
Precipitazione
Precipitazione
delle proteine
delle proteine
meno solubili
più solubili
Frazione solubile
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
[(NH4)2SO4] (M)
Figures from:http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc
Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità
Precipitazione delle proteine
-Precipitazione con Sali
-Precipitazione con Solventi
organici
-Precipitazioni con PEG
Perche’ in presenza di sali o metanolo
le proteine precipitano?
Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari
esposti al solvente
Precipitazione
della proteina
d’interesse
http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc
Frazione solubile
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
% del[(NHsolvente
) SO ] (M)
quindi la loro solubilita’ sara’ diversa in presenza
di concentrazioni diverse di sali o solventi
organici.
4 2
4
Una proteina e’ solubile in acqua
fintanto che i gruppi carichi sono
solvatati da molecole di acqua e i
gruppi idrofobici sono mantenuti all’
interno della proteine.
+H
+H
OI gruppi idrofobici sono rivolti verso
l’interno
I gruppi idrofilici sono rivolti verso
l’esterno.
Questo permette interazioni dipolari
con il solvente
PRECIPITAZIONE CON SALI
In una soluzione acquosa contenente proteine e
sali
..
Se si aumenta la concentrazione di sali
le molecole libere di H2O che possono solvatare gli
ioni salini diminuiscono.
Le prime molecole di H2O che si rendono disponibili a questo
punto sono quelle che si trovano intorno ai gruppi idrofobici delle
proteine
poiche’ le altre sono impegnate con interazioni elettrostatiche
con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu’ difficilmente
cedibili.
+H
+H
Na+-ClO+H
+H
Na+-Cl- +
H
Na+-ClNa+-ClNa+-Cl+H
+H
+H
I gruppi idrofobici sono rivolti verso
l’interno
O-
ONa+-Cl-
O- Na+-Cl-
I gruppi idrofilici sono rivolti verso
l’esterno.
+H
+H
O-
Na+-Cl-
al crescere della concentrazione salina i gruppi
idrofobici delle proteine vengono scoperti
Questi frammenti idrofobici esposti causano l’
aggregazione delle proteine e a seguito di interazioni
idrofobiche che e causano la precipitazione delle
proteine
o ‘salting out’ .
Precipitazione
della proteina
d’interesse
Precipitazione
Precipitazione
delle proteine
delle proteine
meno solubili
più solubili
Schema di
percipitazione in
presenza di
Ammonio solfato
Frazione solubile
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
[(NH4)2SO4] (M)
Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici e’ piu’
risultera’ insolubile a basse concentrazioni saline
(e vice versa).
PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI
In una soluzione acquosa contenente solventi
organici
(metanolo, etanolo, butanolo, acetone)
le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di
solvente organico. L’ acqua di solvatazione viene quindi rimossa
dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine.
I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le
proteine si aggregano per formazione
di interazioni ioniche tra le molecole proteiche.
I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti
e le proteine si aggregano per formazione
di interazioni ioniche tra le molecole
proteiche
+H
+H
+H
O-
+H
O+H
O-
+H
+H
+H
+H
+H
+H
I gruppi idrofobici sono rivolti verso
l’interno
O-
I gruppi idrofilici sono rivolti verso
l’esterno.
O-
+H
+H
O-
+H
O-
+H
+H
O-
Di conseguenza le proteine presenti in una soluzione
acquosa contenente solventi
precipitano
organici
+H
+H
O-
+H
O-
+H
+H
+H
O-
+H
+H
O-
in ordine decrescente a seconda del numero di
gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in
misura maggiore man mano che aumenta la
concentrazione del solvente
Poly(ethylene glycol) (PEG) :
HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
Il PEG e’ un polimero organico
che precipita le proteine con un meccanismo simile a quello dei solventi organici
richiede concentrazioni piu’ basse per precipitare le proteine e ha minor probabilita’ di
determinare la loro denaturazione.
PEG puo’ essere usato
1. per guidare le proteine e acidi nucleici a formare cristalli.
2. Per purificazioni proteiche: PEG + destrano + buffer --> e’ un sistema bifasico utile per ospitare materiali biologici
3.per aiutare la fusione cellulare. Il PEG interagisce con le membrane
cellulari, a un processo chiave usato in biotecnologia.
4. Il legame covalente del PEG alle proteine da coniugati che non sono "immunogenici" e antigenici = uso in vaccini .
5. Il legame covalente del PEG a superficie retarda l’ assorbimento delle
proteine a queste superfici
Altri metodi di frazionamento delle proteine
Frazionamento per dimensioni:
-centrifugazione,
-cromatografia a settaccio molecolare,
Frazionamento per affinità :
Co-immunoprecipitazione utilizzando interazione
tra antigene-anticorpo
colonne di affinità per cofattori