Schema generale della camera di flusso di un citometro ottico
Diffrazione
Sistemi ad Impedenza
e Globuli Rossi
RBC
PLT
Emocromo: Terminologia
• WBC. White Blood Cells, Globuli Bianchi (GB). Indica il numero
di GB per mL o L di sangue.
• RBC. Red Blood Cells o Globuli Rossi (GR). È il numero di GR
per mL o L di sangue.
• Hb. Hemoglobin o emoglobina Esprime la quantità (espressa in
grammi) di Hb presente in un L o dL di sangue.
• Ht. Hematocrit (ematocrito).
• Reticolociti. G.R. neoformati
Emocromo: Terminologia
INDICI
• MCV, Mean Corpuscular Volume, (Volume Corpuscolare Medio). Indica il
volume medio dei globuli rossi. I GR normali sono, per quanto riguarda il
volume, normocitici. Se il volume diminuisce, come nelle talassemie o
nell'anemia da carenza di ferro, i GR sono definiti microcitici; se aumenta
(p.e. nelle anemie da carenza di vitamina B12) si avrà una macrocitosi delle
emazie.
• MCH, Mean Corpuscolar Hemoglobin. Indica la quantità media di
emoglobina in ogni globulo rosso.
• MCHC, Mean corpuscolar Hemoglobin Concentration o Concentrazione
Emoglobinica Corpuscolare Media. Indica la concentrazione media di
emoglobina all'interno del singolo globulo rosso.
• MPV, Mean platelet Volume o Volume Piastrinico Medio. Indica il volume
medio delle piastrine.
Emocromo: Terminologia
• Anisocitosi. notevole variazione nelle dimensioni dei globuli rossi o
delle piastrine. Se di entità importante sono segnalate con una
scala numerica (1+, 2+ ecc.) Se le dimensioni dei GR diminuiscono
o aumentano avremo una microcitosi o una macrocitosi delle
emazie, Lo stesso per le piastrine.
• Poichilocitosi. Variazione della forma del contorno dei G.R. Forma
a falce: drepanociti (anemia falciforme); di cellula a bersaglio o
codocita (talassemie ed altre anemie); sferica o sferociti (sferocitosi
ereditaria); di ellissi (ellissicitosi o ovalocitosi ereditaria); di
frammenti globulari o schizociti
• Aggregati piastrinici. Indica la presenza di ammassi piastrine che
appaiono riunite assieme, invece di essere separate, come di
norma. In genere è un artefatto di laboratorio e non ha nessun
significato clinico.
•
•
CITOMETRIA A FLUSSO
Stabilità nel tempo dei
parametri ematologici
U.O.
Pat. Clinica
2002
Hb
(mg/dl)
Hct
(%)
MCV
(fl)
PLT
(103/l)
RET
(#)
0
13.91.2 42.02.9 87.03.8 244.857.4 83.924.2
6h
13.91.0 41.72.6 86.13.8 245.751.2 83.717.9
9h
14.01.1
24h
(T°a)
42.02.5
86.63.8
243.553.6 75.816.9
14.31.2 43.72.9 89.43.6 247.557.5 71.723.3
24h (T4°C) 14.51.1 43.43.1 86.63.8 248.857.3 85.423.8
RBC
HGB
HTC
MCV
MCH
MCHC
RDW
MCV
60 fL
CHCM
120 fL
RDW
Anisocitosi
Fisiologica
28 g/dL
41 g/dL
HDW
Anisocromia
Fisiologica
RDW (Red Distribution Width)
È un valore statistico corrispondente alla DS o al CV della distribuzione dei
Globuli Rossi. Equivale all’ Indice di Anisocitosi
50
100
200
RDW Normale
< 15,5%
50
100
RDW Elevato
18 %
200
50
100
200
RDW Molto Elevato
35 %
How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports
to Clinicians?
Am J Clin Pathol 118(5):787-793, 2002
PARAMETRI PIU’ FREQUENTEMENTE USATI
RBC
HB
HT
reticolociti
MCV
MCH
MCHC
Ematocrito o PCV (Packed Cells
Volume) o HCT (HematoCriT)
• Valori ematici normali nell'uomo: 42% - 51% Valori ematici
normali nella donna: 37% - 47% rappresenta il volume
percentuale della frazione corpuscolata del sangue rispetto al
volume totale del sangue.
Metodo di determinazione Manuale
• Il sangue venoso reso incoagulabile (per aggiunta di una soluzione
di ossalato di calcio ed ossalato di potassio in rapporto 3:2 e con
concentrazione finale di 2 mg per ml di sangue) si centrifuga nella
provetta ematocrito di Wintrobe a 1500 giri per 30 minuti. In
condizioni normali la frazione corpuscolata occupa circa il 45%
del volume totale di sangue.
How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports
to Clinicians?
Am J Clin Pathol 118(5):787-793, 2002
PARAMETRI PIU’ FREQUENTEMENTE USATI
RBC
HB
HT
reticolociti
MCV
MCH
MCHC
Variazioni dell’emoglobina
Increased Hemoglobin (Increased Red Blood Cell Count )
•
Polycythemia Vera
•
Vigorous Exercise
•
High altitude
•
Tobacco Abuse
•
Renal cell carcinoma
•
Cardiovascular disease
•
Stress
•
Dehydration
•
Decreased Hemoglobin (decreased Red Blood Cell Count )
•
Anemia
Anemia
Classificazione fisiopatologica
Ridotta produzione di eritrociti
Aplasia midollare
Infiltrazione neoplastica del midollo osseo
Carenza di vitamina B12 e/o di folati
Sindromi mielodisplastiche
Anemia da IRC
Sintesi emoglobinica anomala o ridotta
Anemia sideropenica
Anemia da disordini cronici(infiammazioni, infezioni, neoplasie)
Sindromi talassemiche
Emoglobine abnormi
Anemia associata a endocrinopatie
Aumentata distruzione eritrocitaria
Anemie emolitiche
Da causa intracorpuscolare
Alterazioni della membrana eritrocitaria
Alterazioni della glicolisi anaerobia
Deficit enzimatici dello shunt degli esosomonofosfati
Alterazioni qualitative dell’emoglobina
Da cause extracorpuscolare
Cause meccaniche
Malattie emolitiche isoimmuni e autoimmuni
Anemia
Classificazione di laboratorio
Anemia microcitica/ipocromica (MCV<79fl, MCHC<32%)
Diagnosi differenziale fra anemia sideropenica e trait talassemico
Anemia normocitica/normocromica (80<MCV<94 fl,
32%<MCHC<36%)
Una spiccata reticolocitosi esclude un difetto dell’emoglobinosintesi
o dell’eritropoiesi, mentre suggerisce una anemia post emorragica
acuta o una forma emolitica
Anemia macrocitica/normocromica o ipocromica (MCV
>94 fl, 32%<MCHC<36%)
Quando il valore di MCV supera i 110 fl l’anemia viene definita
megaloblastica. Riduzione della reticolocitosi
High angle detector
5°-15°
LUCE RIFRATTA
Concentrazione Hb
Low angle detector
2°-3°
SCATTER
Volume RBC
sfericizzazione
V
O
L
U
M
E
Densità (concentrazione Hb)
V
O
L
U
M
E
Densità (concentrazione Hb)
Macrocitiche
normocromiche
Macrocitiche
ipocromiche
Macrocitiche
ipercomiche
Normocitiche
ipocromiche
V > 120
Normocitiche
ipercromiche
HC <28
Normocitiche
HC 28-41
HC >41
normocromiche
946 (4.7%)
6256 (31.1%)
V 60-120Microcitiche
3082 (15.3%) 7553 (37.6%)
ipocromiche
V < 60
981 (4.6%)
9 (0.0%)
Microcitiche
64 (0.3%)
ipercrimche
1221 (6.1%)
Microcitiche 40 (0.2%)
normocromiche
L’anemia non è un “innocent bystander”, ma impatta
decisamente sulla mortalità e morbilità ed il suo
trattamento ha effetti benefici evidenti.
Nissenson et al. Arch Inter Med 2003; 163:1400-3
L’anemia è un fattore di rischio indipendente nello scompenso
cardiaco cronico e per ogni 1% di HcT in meno vi è un aumento
della mortalità del 1.6%.
L’anemia è associata con
sintomi più gravi, maggior
insufficianza funzionale e un
significativo aumento della
mortalità in pazienti con
insufficienza cardiaca
avanzata
Horwich, T. B et al. JACC 39:
1780-1786
In un’ampia coorte di pazienti
in istituti di ricovero con
insufficienza cardiaca,
l’anemia è un fattore
prognostico indipendente di
mortalità
Justin A. Ezekowitz et al.
Circulation. 2003;107:223
Blood transfusion is associated with a lower short-term mortality rate
among elderly patients with acute myocardial infarction if the hematocrit
on admission is 30.0 percent or lower and may be effective in patients
with a hematocrit as high as 33.0 percent on admission.
Wu W-C et al.NEJM 345:1230-1236, 2001
In older women with disabilities, a haemoglobin (Hb) concentration of
14,0 g/dL was associated with a lower risk of all cause mortality than
concentrations of 11,0 g/dL and 12,0 g/dL after adjustment for chronic
disease burden. Mortality risk decreased with increasing Hb
concentrations up to a threshold of 13,9 g/dL.
Chaves PH et al Evidence-Based Medicine 2005; 10:90-97
L’anemia (HcT < 35%) è un fattore indipendente di morte in interventi di
chirurgia generale
Nei dializzati un HcT fra 33 e 39 abbatte del 16% la possibilità di
ospedalizzazione ed è associato ad un basso rischio di morte
Definizione di Anemia della WHO
Hemoglobin < 13g/dL for men and < 12 g/dL for
women
Source
Men g/dL
Women g/dL
WHO
13,0
12,0
Jandl
14,2
12,2
Beutler
14,0
12,3
Lee
13,2
11,6
Rapaport
14,0
12,0
Goyette
13,2
11,7
Tietz
13,2
11,7
Hoffman
13,5
12,0
… e nei neonati e
nei bambini ?
… e nelle gravide?
… e negli anziani?
Emoglobina
I.
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
1.
2.
A.
1.
2.
Normal Values per age (-2 to +2 S.D)
Birth: 13.5 to 24.0 g/dl (mean 16.5 g/dl)
Age <1 month: 10.0 to 20.0 g/dl (mean 13.9 g/dl)
Age 1-2 months: 10.0 to 18.0 g/dl (mean 11.2 g/dl)
Age 2-6 months: 9.5 to 14.0 g/dl (mean 12.6 g/dl)
Age 0.5 to 2 years: 10.5 to 13.5 g/dl (mean 12.0 g/dl)
Age 2 to 6 years: 11.5 to 13.5 g/dl (mean 12.5 g/dl)
Age 6-12 years: 11.5 to 15.5 g/dl (mean 13.5)
Female
Age 12-18 years: 12.0 to 16.0 g/dl (mean 14.0 g/dl)
Age >18 years: 12.1 to 15.1 g/dl (mean 14.0 g/dl)
Male
Age 12-18 years: 13.0 to 16.0 g/dl (mean 14.5 g/dl)
Age >18 years: 13.6 to 17.7 g/dl (mean 15.5 g/dl)
Variazioni dell’emoglobina
Anemia Cut-offs
Men
1.
Age 12-14 years: <12.5 g/dl
(CDC)
2.
Age 15-17 years: <13.3 g/dl
(CDC)
3.
Age >17 years: <13 g/dl
(WHO) or <13.5 g/dl (CDC)
Women (Non-pregnant, nonlactating)
1.
Age 12-14 years: <11.8 g/dl
2.
Age 15-17 years: <12.0 g/dl
3.
Age >17 years: <12 g/dl
(WHO and CDC)
Women in Pregnancy (CDC
Guidelines <5th percentile)
1. First Trimester: <11.0 g/dl
2. Second Trimester: <10.5
g/dl
3. Third Trimester: <11.0 g/dl
Children (CDC Guidelines <5th
percentile)
1. Age 1-2 years: <11.0 g/dl
2. Age 2-5 years: <11.1 g/dl
3. Age 5-8 years: <11.5 g/dl
4. Age 8-11 years: <11.9 g/dl
•
… e nelle persone
di colore?
Group
Hemoglobin, g/dL
White men, y
20-59
13.7
60+
13.2
White women, y
20-49
12.2
50+
12.2
Black men, y
20-59
12.9
60+
12.7
Black women, y
20-49
11.5
50+
11.5
Anemia sideropenica
• MCV < 80 fl (fase clinica)
• Hb correla con MCV e RBC
• Ipocromia e
•
•
•
•
•
anisopoichilocitosi
Ferritina ↓, transferrina ↑
sideremia ↓
Recettori solubili per la
transferrina ↑
Reticociti ↓
Ridotta Hb reticolocitaria
RDW ↑
STADI DI CARENZA MARZIALE
Fe deposito
Fe trasporto
Fe eritrocitario
Ferritina (ng/ml)
N
Sideremia (ng/ml)
N
N
Transferrina (mg/dl)
N
N
Saturazione
Transferrina (%)
>20
>20
<15
<10
Eritrociti
N
N
N
Ipocro.Mi
croc.
Emoglobinopatie e Talassemie
Anomalie del tetramero dell’emoglobina
• Anomalie strutturali delle catene dell’emoglobine
(EMOGLOBINOPATIE)
• Riduzione o completa mancanza della sintesi di una o più
catene polipeptidiche della molecola dell’emoglobina
(TALASSEMIE)
N.B. 250 milioni di persone (4.5% della pop.mondiale) sono
eterozigoti per un gene globinico difettivo ed annualmente
nascono almeno 300 mila omozigoti affetti!!!
Beta talassemia
•Anemia mediterranea: (la beta-talassemia tipica
dell'area mediterranea)
trait talassemico
(condizione asintomatica)
un solo gene difettoso
talassemia maior
(malattia grave)
ambedue i geni difettosi
talassemia intermedia
(da lieve a grave)
ambedue i geni difettosi
Parametri nella Talassemia
• MCV 
• RDW normale o 
• Reticolociti normali o 
• Ferritina normale o 
• Transferrina normale
• Sideremia normale o 
• Recettori solubili normali
Trait Talassemico
• MCV < 80 fl (eccetto aa/a- e b+)
• Hb non correla con MCV and RBC
• punteggiatura basofila delle
cellule target
• studio delle catene globiniche
HbA2
• RDW normale
Screening per talassemia e emoglobinopatie
Diagnosi differenziale tra Anemia
sideropenica
e Trait Talassemico
• RBC
Anemia in corso di malattia
cronica
•
•
•
•
•
MCV ridotto o normale
MCH ↓
Sideremia, T.I.B.C. ↓
Ferritina normale o aumentata
Recettori solubili per la transferrina
normali
• Transferrina ↓
• Anemia normo/microcitica
Anemia macrocitica
RDW aumentato in presenza di un
valore MCV ai limiti superiori della
norma, permette di individuare
precocemente la presenza di:
• alcoolismo
• epatopatie
• carenza subclinica di B12/folati
• esposizione industriale a solventi
organici
• mielodisplasia primitiva o chemioindotta
• assunzione terapeutica di AZT and HU
Deficitaria Sintesi del DNA
Persistenza della Sintesi di
RNA e delle Proteine
V
O
L
U
M
E
Densità (concentrazione Hb)
Bambina di 2 anni.
Deficit di
accrescimento
Paziente di 77 anni
P.S.
Shock
Paziente di 70 anni
P.S.
Astenia
Ret 0,8%
MCVr 146
Bambina di 2 anni.
Deficit di accrescimento,
irritabilità
Anemia Megaloblastica
EFFETTO DELLA NORMALIZZAZIONE DEI LIVELLI DI VITAMINA B12
RBC
HgB
MCV
MCHC
PLT
2.680.000
9.5
106.9
33.1
63.000
RBC
HgB
MCV
MCHC
PLT
3.090.000
9.4
95.5
31.7
157.000
RBC
HgB
MCV
MCHC
PLT
3.680.000
9.7
84.1
31.7
167.000
Sindromi Mielodisplastiche
Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica
Target cells
Difetti di
membrana
Reticolocitosi
Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica
Agglutinati da
Crioagglutinine
Rouleaux
Paziente del P.S. anni 77
Shock
Falsa macrocitosi e
ipocromia da IPERGLICEMIA
(da prelievo eseguito con
glucosata in corso)
Situazioni di importante Iperglicemia
glucosio
glucosio
glucosio
glucosio
glucosio
glucosio
Diluente
dell’analizzatore
Acqua
Acqua
Acqua
glucosio
glucosio
glucosio
glucosio
Acqua
Acqua
Acqua glucosio
glucosio
Ore 21.00
Glicemia 1 gr
Ore 12.00
Glicemia 146 mg
• Esame dirimente: Conta dei Reticolociti
Reticolociti nel
Sangue Periferico
Reticolociti
Midollari
Eritroblasti
Ortocromatici
Tempo di
Permanenza
2-3 giorni
Barriera
EMATO- MIDOLLARE
Tempo di
permanenza
1-1.5 giorni
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della
eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
I RETICOLOCITI
• I reticolociti sono globuli rossi in cui la
colorazione sopravitale a fresco con alcuni
coloranti basici mette in evidenza la
sostanza granulo-filamentosa, sotto forma
di granuli isolati o riuniti tra loro da una rete
più o meno fitta di materiale basofilo.
Contengono RNA
(colorazioni sopravitali con
blu di metilene o blu di
Cresile)
Sono più grandi dei
globuli rossi
MCVr > MCVgbr
Possono avere un diverso
contenuto di RNA (cioè un
diverso contenuto di granuli e
filamenti) e un diverso volume in
rapporto al loro grado di
maturazione
D’Onofro e Zini
“Morfologia del Sangue”
Maturazione reticolocitaria
• Riduzione delle dimensioni
• Aumento della densità
• Perdita dei ribosomi, mitocondri e frammenti di
membrana
• Riduzione di: RNA , mRNA e attività enzimatica
• Cambio della forma (plurilobata -› biconcava)
• Perdita dei recettori di membrana per transferrina
(CD71) e fibronectina
• Perdita di motilità e adesività
• Aumento della deformabilità
L M
H
RMI = Reticulocyte Maturity Index
Nei diversi studi è stato usato come:
• intensità media di tutta la popolazione
reticolocitaria
• reticolociti ad elevata Fluorescenza o
Assorbimento
• reticolociti a media ed elevata fluorescenza
o assorbimento, che alla fine sono stati
definiti come
IRF = Immature Reticulocyte Fraction
Nuovi parametri in
citometria
• Frazione dei reticolociti immaturi (IRF)
• Contenuto emoglobinico reticolocitario
• Volume reticolocitario
IRF: applicazioni cliniche
• Monitoraggio della ripresa midollare dopo
trapianto o chemioterapia
• Monitoraggio della terapia delle anemie
• Monitoraggio della terapia con Epo
• Monitoraggio dell’attecchimento del
trapianto renale
• Rilevamento delle crisi aplastiche nelle
anemie emolitiche
Caratteristiche delle anemie
emolitiche
•
•
•
•
•
•
Anemie normocitiche-normocromiche
Reticolociti ↑
Urobilinogeno ↑
Bilirubina indiretta ↑
Emoglobinemia ed Emoglobinuria
LDH eritrocitaria ↑
Caratteristiche delle anemie
emolitiche
• Anemie emolitiche da cause
intraglobulari
• Anemie emolitiche da cause
extraglobulari
• Esame dirimente: Coomb’s test
Anemie Emolitiche
• Cause intraglobulari (difetti di membrana)
• Sferocitosi, ellissocitosi
• Cause intraglobulari (difetti enzimatici)
• Deficit di G6PD o Favismo
• Deficit di Piruvato K
• Deficit di Glutatione reduttasi
• Cause intraglobulari (Emoglobinopatie)
• Talassemie
• Drepanocitosi
Anemie emolitiche da cause
extraglobulare
• Anemie emolitiche da isoanticorpi
• Anemie emolitiche da autoanticorpi
• Anemie da farmaci e veleni
Elementi diagnostici delle anemie emolitiche da difetto
intraeritrocitario
Comuni
Segni di emolisi
Specifici
Segni di iperDipendenti dalla
funzione midollare causa
Bilirubinemia
non coniugata
Reticolocitosi
 Urobilinogeno
Iperplasia
eritroblastica
Morfologia Emazie
Emosiderosi
 LDH isoenzima 2  Turnover del Fe - Aumentata fragilità
sideremia  alla osmotica
 Aptoglobinemia
norma
- Dosaggi enzimi
eritrocitari (G6PD)
- Elettroforesi Hb