Trasporto del piruvato dal citoplasma al mitocondrio Membrana esterna Membrana interna Piruvato translocasi COOH C=O COOH C=O CH3 CH3 TCA Reazione catalizzata dal complesso mitocondriale della piruvato deidrogenasi (gruppi prostetici: prostetici: TTP, Lipoamide, Lipoamide, FAD) Complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi (PDH) O O H3C CH2 N H3C CH2 O P O− + N C O P O− O− S H+ acido H N CH2 NH2 tiamina pirofosfato (TPP) S CH2 Acido lipoico CH2 S O CH CH2 CH2 CH2 CH2 C lipoammide lisina NH NH (CH2)4 CH C − + O In E. coli il “core” core” contiene 24 monomeri di E2, ognuno legato a 3 molecole di acido Lipoico. Lipoico. Inoltre il complesso contiene 24 monomeri di E1 e 12 di E3 Ha un diametro di 45 nm (5 volte più più grande di un ribosoma). ribosoma). Mr = 4,5 × 106 Complesso della Piruvato deidrogenasi CICLO DI KREBS-1a Reazione (condensazione) Enzima: citrato sintasi HS-CoA COOH CH3 C=O S-CoA + C=O + CH2 COOH COOH CH2 HO-C Acetil-CoA ossalacetato COOH CH2 COOH citrato -Il ciclo di Krebs inizia con una reazione catalizzata dalla citrato sintasi (enzima condensante) che unisce l’acetile dell’acetil-CoA con l’ossalacetato formando citrato (il ciclo di Krebs viene anche detto ciclo deli acidi tricarbossilici (TCA). CICLO DI KREBS-2 a Reazione (isomerizzazione) Enzima: aconitasi COOH CH2 HO-C COOH CH2 COOH citrato COOH COOH CH2 CH2 C COOH CH COOH cis-aconitato H C COOH HO-C H COOH iso-citrato Il secondo enzima detto aconitasi catalizza l’isomerizzazione del citrato trasformandolo in isocitrato. Nel sito attivo di questo enzima si forma un composto intermedio: il cis-aconitato. Il nome aconitasi deriva dal nome di tale intermedio. CICLO DI KREBS- 3a Reazione (decarbossilazione ossidativa) Enzima: isocitrato deidrogenasi COOH CO2 CH2 H C COOH HO-C H COOH iso-citrato COOH CH2 CH2 C=O NAD NADH + H+ COOH α-chetoglutarato 1 Il terzo enzima detto isocitrato deidrogenasi catalizza una reazione di decarbossilazione ossidativa, trasformando l’isocitrato in α-chetoglutarato e CO2. Il NAD viene ridotto a NADH + H+ CICLO DI KREBS- 4a Reazione (decarbossilazione ossidativa) Enzima: α-chetoglutarato deidrogenasi COOH HS-CoA CO2 COOH CH2 CH2 CH2 CH2 C=O C=O COOH α-chetoglutarato NAD NADH + H+ S-CoA Succinil-CoA 1 Il quarto enzima (α-chetoglutarato-deidrogenasi) catalizza la decarbossilazione ossidativa dell’α-chetoglutarato trasformandolo in succinil-CoA e formando la seconda molecola di NADH del ciclo. (di fatto è un complesso multienzimatico simile alla piruvato deidrogenasi !) CICLO DI KREBS- 5a Reazione (fosforilazione a livello di substrato) Enzima: succinato tiocinasi COOH GDP GTP COOH CH2 CH2 CH2 CH2 C=O Pi COOH S-CoA Succinil-CoA succinato 1 Il quinto enzima (succinil-CoA sintetasi) catalizza la reazione del succinil-CoA con GDP e fosfato inorganico (Pi) formando succinato e GTP (una sostanza energeticamente equivalente all’ATP). CICLO DI KREBS- 6a Reazion (ossidazione) Enzima: succinato deidrogenasi COOH CH2 | CH2 FAD FADH2 COOH CH || HC COOH COOH succinato fumarato 1 Il sesto enzima (succinato-deidrogenasi) ha come coenzima il FAD che accetta 2 atomi di idrogeno dal succinato trasformandolo in fumarato (un composto insaturo) e producendo 1 molecola di FADH2. CICLO DI KREBS7a Reazione (addizione di acqua) Enzima: fumarasi COOH COOH CH || HC COOH fumarato HO-C-H | CH2 H2O COOH L-malato 1 il settimo enzima (fumarasi) addiziona una molecola di H2O al doppio legame C=C presente nel fumarato producendo L-malato. CICLO DI KREBS8a Reazione (ossidazione) Enzima: malato deidrogenasi COOH HO-C-H | CH2 COOH L-malato NAD NADH + H+ COOH C=O | CH2 COOH ossalacetato 1 l’ottavo ed ultimo enzima (malato deidrogenasi) ossida L-malato utilizzando il NAD come ossidante e rigenera la molecola di ossalacetato producendo anche la terza molecola di NADH + H+ e chiudendo il ciclo Acetil-CoA O CH3 C SCoA HSCoA O C OH NADH2 CH2 HO C C NAD+ O C OH malato CH2 OH CH O H2O O ossalacetato HC OH C O C O C OH OH CH2 citrato OH HC C isocitrato O C OH O CH O C NAD+ OH O C OH CH fumarato OH HO CH C O a -chetoglutarato OH O O C OH FADH CH2 CH2 HSCoA FAD O C OH succinato O C OH GTP GDP + Pi CH2 CH2 O C SCoA Succinil-CoA CH2 CH2 C C O OH NAD+ SCoA CO2 NADH2 NADH2 CO2 1 NADH = 2,5 ATP 1 FADH2 = 1,5 ATP Resa energetica del ciclo di Krebs (accoppiato con la fosforilazione ossidativa) RESA NETTA IN ATP DAL METABOLISMO AEROBIO DEL GLUCOSIO 30-(32) ATP Regolazione della piruvato deidrogenasi e del ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs è una via metabolica mitocondriale ed è regolato in maniera differente rispetto alla glicolisi, glicolisi, al metabolismo del glicogeno ed a quello dei lipidi. I seguenti metaboliti regolano la velocità velocità con cui opera il ciclo: La piruvato deidrogenasi (il complesso che trasforma il piruvato in acetilacetil-CoA) CoA) viene regolata con due modalità modalità: la prima mediante inibizione da prodotti (NADH e AcetilAcetil-CoA); CoA); la seconda mediante in meccanismo di fosforilazione/ fosforilazione/defosforilazione di una delle sue subunità subunità. Quando la concentrazione cellulare dell’ dell’ATP è alta (abbondanza di energia) il complesso viene fosforilato da una specifica proteina cinasi ed inattivato, mentre quando la concentrazione cellulare dell’ dell’ATP è bassa una specifica proteina fosfatasi defosforila ed attiva il complesso. •Disponibilità di ossalacetato e acetil-CoA: infatti nel mitocondrio l’enzima citrato sintasi non è mai saturato dai substrati. Per questa ragione (vedi Km e saturazione dei siti attivi degli enzimi), una diminuzione della concentrazione dell’ossalacetato o dell’acetil-CoA determina una riduzione della velocità, mentre un aumento della concentrazione di tali metaboliti porta ad un incremento della velocità. •Rapporto [NADH]/[NAD]: quando aumenta la concentrazione cellulare di NADH la velocità del ciclo viene ridotta, mentre quando aumenta la concentrazione del NAD la velocità del ciclo viene incrementata. Tali effetti sono dovuti ad una azione inibitoria da prodotto (NADH) nelle reazioni catalizzate dalle deidogenasi piridiniche ((isocitrato deidrogenasi e alfachetoglutarato deidrogenasi), ma anche ad una inibizione della citrato sintasi. Rapporto [succinil-CoA]/[HSCoA]: quanto aumenta la concentrazione del succinil-CoA il ciclo viene inibito (inibizione da prodotto sulla alfa-chetoglutarato deidrogenasi ed inibizione competitiva sulla citrato sintasi). Come ben si vede, il ciclo viene regolato in base alle necessità energetiche della cellula: se la cellula ha bisogno di ATP il ciclo viene attivato, mentre se la cellula contiene già elevate concentrazioni di ATP il ciclo viene inibito. Il ciclo di Krebs è una via metabolica terminale. In esso confluiscono tutte le vie ossidative dei carboidrati, dei grassi e degli ammino acidi. Infatti i carboidrati, dopo essere stati trasformati in piruvato mediante la glicolisi, generano l’acetilCoA per azione della piruvato deidrogenasi. Gli acidi grassi seguono lo stesso destino mediante la beta-ossidazione. Anche molti ammino acidi formano o piruvato o acetil-CoA mediante vie specifiche per ogni ammino acido. Tuttavia, alcuni ammino acidi formano direttamente metaboliti del ciclo di Krebs. Gli ammino acidi che, nel loro catabolismo, formano piruvato o metaboliti del ciclo (come ossalacetato e alfa-chetoglutarato o succinil-CoA) possono avere un destino metabolico differente dalla ossidazione diretta: infatti essi sono convertiti in glucosio nel fegato mediante una via metabolica detta gluconeogenesi (vedi amino acidi glucogenici). Il glucosio formato viene secreto nel sangue per essere poi utilizzato da altri organi. Il ciclo di Krebs ha un ruolo centrale nel metabolismo. Se è vero che la sua funzione di ciclo metabolico terminale è molto importante per la produzione di energia (come ATP), è anche vero che singoli metaboliti del ciclo di Krebs possono lasciare il ciclo e partecipare a metabolismi di sintesi, come ad esempio la gluconeogenesi (per formare nuove molecole di glucosio a partire da amino acidi), la biosintesi del gruppo eme, la biosintesi di amino acidi etc. Quando un metabolita del ciclo di Krebs abbandona il ciclo per prendere parte ad altri metabolismi, la popolazione delle molecole di ossalacetato diminuisce. Per questo sono molto importanti vie metaboliche che formano l’ossalacetato. Negli animali superiori la più importante di queste vie è la carbossilazione del piruvato: Regolazione covalente della PDH Il complesso della piruvato deidrogenasi [PDH, (E1-E2-E3)] contiene anche una proteina cinasi che fosforila E1 sulla catena laterale di una serina, serina, ed una proteina fosfatasi che può rimuovere il fosfato ØLa velocità con cui procede il ciclo di Krebs dipende dalla concentrazione mitocondriale di ossalacetato Le vie metaboliche che sintetizzano ossalacetato vengono dette “anaplerotiche” Meccanismo di azione della piruvato carbossilasi