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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA - VITERBO
DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI
PROGRAMMA DI RICERCA AGRICOLA, AGROAMBIENTALE,
AGROALIMENTARE E AGROINDUSTRIALE DEL LAZIO (PRAL)
Area tematica 8.1: “Qualità della vita e gestione delle risorse del vivente”
TITOLO DEL PROGETTO:
“MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA’ IGIENICO SANITARIA DEL LATTE
BUFALINO, OVINO E CAPRINO”
(COD. 2003/57)
RELAZIONE TECNICO-SCIENTIFICA FINALE
Coordinamento: Prof. Bruno Ronchi
(Dip. Di Produzioni Animali – Universita’ della Tuscia)
- VITERBO 6 dicembre 2007 -
INDICE
1. PREMESSE ......................................................................................................................... 3
2. VALUTAZIONE DELLO STATO IGIENICO SANITARIO DELLA MAMMELLA E
CARATTERISTICHE REOLOGICHE DEL LATTE OVINO E CAPRINO ........................................... 4
2.1. Introduzione ...................................................................................................... 4
2.2. Studio epidemiologico: contenuto in cellule somatiche nel latte di massa
ovino e caprino ................................................................................................... 5
2.2.1. PREMESSE .................................................................................................................. 5
2.2.2. MATERIALI E METODI .................................................................................................. 7
2.2.3. RISULTATI .................................................................................................................. 7
2.2.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 10
2.3. Studio sperimentale: qualità igienico sanitaria del latte caprino ........................... 11
2.3.1. PREMESSE ................................................................................................................ 11
2.3.2. MATERIALI E METODI ................................................................................................ 11
2.3.3. RISULTATI ................................................................................................................ 14
2.3.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 21
2.4. Studio sperimentale: qualità igienico sanitaria del latte ovino .............................. 22
2.4.1. PREMESSE ................................................................................................................ 22
2.4.2. MATERIALI E METODI ................................................................................................ 22
2.4.3. RISULTATI ................................................................................................................ 23
2.4.4. CONCLUSIONI ........................................................................................................... 32
3. ANALISI DELLE FRAZIONI CASEINICHE DEL LATTE OVINO .................................................. 33
4.1. Premesse ......................................................................................................... 33
4.1.1. Il latte ovino .............................................................................................................. 33
4.1.2. Metodi cromatografici per l’analisi delle proteine del latte ............................................... 36
4.2. Materiali e metodi ............................................................................................ 37
4.2.2. Campionamento ........................................................................................................ 37
4.2.3. Metodo RP-HPLC per le caseine del latte di pecora ......................................................... 37
4.2.4 Metodo per la produzione della γ-caseina ...................................................................... 40
4.3. Risultati e discussioni........................................................................................ 41
4. VALUTAZIONE DELLA QUALITA’ DEL LATTE DI BUFALA ....................................................... 52
3.1. Messa a punto conta differenziata cellule somatiche ........................................... 52
3.1.1. Metodo conta differenziata cellule somatiche ................................................................. 52
3.2. Analisi di qualità del latte bufalino ..................................................................... 56
3.2.1. Materiali e metodi ...................................................................................................... 56
3.2.2. Risultati .................................................................................................................... 57
3.2.3. Conclusioni ................................................................................................................ 67
3.3. Analisi genetica ................................................................................................ 67
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI ............................................................................................. 75
1. PREMESSE
Il presente elaborato costituisce relazione finale del programma di ricerca denominato
“MIGLIORAMENTO DELLA QUALITA’ IGIENICO SANITARIA DEL LATTE BUFALINO, OVINO
E CAPRINO” e riporta nel dettaglio, per ogni unità operativa, i risultati ottenuti durante
l’implementazione del programma idi cerca.
Conformente ai presupposti proggettuali ed ai possibili risultati, in termini di vantaggi per
gli operatori del sistema agricolo laziale e per la collettività, da ottenersi mediante
l’attuazione del programma medesimo, le azioni elencate nel seguito, ed i risultati ottenuti,
sono stati inquadrati al fine di:
- mettere a punto metodiche analitiche ed ottimizzare gli strumenti utilizzati presso i
laboratori per la determinazione delle cellule somatiche per l’ottenimento di risultati di
prova accurati nell’applicazione al settore dell’allevamento ovi-caprino;
- individuare parametri che permettono di effettuare una diagnosi accurata dello stato
sanitario della mammella al fine di ridurre l’incidenza della mastite nelle specie animali
considerate e di mettere in atto interventi appropriati con l’utilizzazione mirata e
limitata di farmaci;
- fornire dati di tipo genetico utili per avviare piani di selezione al fine di migliorare le
capacità d’adattamento del bestiame allevato e ridurre l’impiego di trattamenti
terapeutici, anche per le esigenze dell’allevamento di tipo biologico.
Nel complesso, lo studio ed i relativi risultati nel seguito descrittI, potranno consentire il
miglioramento della sostenibilità economica dei sistemi di allevamento di grande interesse
per la Regione Lazio quali quelli del bufalo, della pecora e della capra, oltre che della
qualità igienico-sanitaria del latte prodotto e destinato ai diversi tipi di trasformazione.
3
2. VALUTAZIONE DELLO STATO IGIENICO SANITARIO DELLA
MAMMELLA E CARATTERISTICHE REOLOGICHE DEL LATTE OVINO
E CAPRINO
2.1. Introduzione
Il parametro cellule somatiche rappresenta uno dei sistemi di valutazione qualitativa del
prodotto latte, sebbene per quel che riguarda il comparto ovi-caprino, attualmente, non
esista un livello di cellule somatiche con valenza di requisito. Il contenuto in cellule
somatiche (CCS) nel latte di massa dei piccoli ruminanti frequentemente è superiore a
106/ml, come evidenziato in un recente volto alla definizione del valore soglia nazionale di
cellule somatiche nel latte di massa caprino e ovino (Rosati et al., 2004). Le mastiti
subcliniche rappresentano il principale fattore di incremento del CCS e sono sostenute
prevalentemente da Stafilococchi Coagulasi Negativi (SCN), Streptococcus spp. (non
emolitici, S. uberis), Enterococcus spp., Escherichia coli ed altri enterobatteri quali
Corynebacterium spp., Mannheimia haemolytica e Pseudomonas spp. Una modesta
percentuale dei patogeni isolati da casi di mastite subclinica è rappresentata da
Staphylococcus aureus, che ha rilevanza per la sicurezza alimentare essendo responsabile
di forme di tossinfezione alimentare.
La risposta cellulare nelle mastiti subcliniche dei piccoli ruminanti è più intensa rispetto al
bovino, soprattutto nelle infezioni da SCN, con valori prossimi a 1,5.106/ml. Nella pecora, il
CCS è un efficace parametro di valutazione dello stato sanitario della mammella. Nella
capra la causa principale di variazione del CCS è rappresentata dalle infezioni
intramammarie, sebbene sia riconosciuto che variazioni riconducibili anche a fattori
fisiologici, incidono sulla sua efficienza quale indicatore sanitario. In generale, l’efficacia
del CCS quale parametro diagnostico è spesso in discussione anche per le possibili
difficoltà applicative.
La relazione che segue esporrà i risultati ottenuti relativi all’attività svolta dal Centro Latte
dell’IZS nell’ambito del progetto di ricerca “miglioramento della qualità igienico-sanitaria
del latte bufalino, ovino e caprino”. Parte dell’attività, secondo gli obiettivi generali del
piano, è stata svolta in collaborazione con il Dipartimento di Produzioni Animali della
Facoltà di Agraria dell’Universitò degli Studi della Tuscia di Viterbo.
4
Il progetto di ricerca è stato articolato in una parte epidemiologica e una parte
sperimentale.
Lo studio epidemiologico è stato condotto su 400 allevamenti ovini da latte e 35
allevamenti caprini da latte distribuiti nelle province di Latina, Frosinone, Roma, Rieti e
Viterbo con l’obiettivo di determinare il contenuto in cellule somatiche (CCS) nel di latte
massa.
Lo studio sperimentale è stato realizzato in due allevamenti, uno di pecore da latte ed un
altro di capre da latte, con l’obiettivo di valutare i seguenti aspetti:
•
Individuazione degli indicatori idonei a diagnosticare precocemente le mastiti nella
pecora e nella capra.
•
Valutazione dei parametri produttivi e delle caratteristiche chimico-fisiche e
tecnologiche del latte ovino e caprino in relazione al contenuto in cellule somatiche.
•
Studio delle relazioni esistenti tra il contenuto in cellule somatiche e lo stato sanitario
della ghiandola mammaria.
•
Caratterizzazione delle cellule somatiche (per la specie caprina).
•
Definizione di valori di riferimento di cellule somatiche nel latte di capra e di pecora.
2.2. Studio epidemiologico: contenuto in cellule somatiche nel latte di
massa ovino e caprino
2.2.1. PREMESSE
La Direttiva CE 92/46, normativa verticale comunitaria, indicava i limiti per i parametri
chimico-fisici e igienico-sanitari, per il latte crudo delle specie bovina, ovina, caprina e
bufalina. Tale norma, recepita in Italia con il D.P.R. n° 54 del 14 gennaio 1997
“Regolamento recante attuazione delle Direttive 92/46 e 92/47/CEE in materia di
produzione e immissione sul mercato di latte e di prodotti a base di latte”, tuttavia non
individua alcun valore soglia per il contenuto in cellule somatiche per il prodotto da
pecore, capre e bufale e destinato al consumo umano.
5
La Direttiva CE 92/46 prevedeva che le norme riguardanti il contenuto in cellule
somatiche, nel latte ovino e caprino, sarebbero state fissate a partire dal 1° gennaio del
1998 mediante studi tendenti ad individuare il valore soglia nel latte crudo di massa.
Il Comitato Scientifico del Simposio Internazionale “Cellule somatiche e qualità del latte dei
piccoli ruminanti”, tenutosi nel 1994 a Bella (Pz), ha proposto come obiettivo a termine, un
valore soglia unico per i piccoli ruminanti pari a 1.500.000 cell./ml. Gli studi condotti nel
nostro Paese sono stati effettuati su realtà territorialmente definite, che proprio per
l’estrema variabilità del latte sotto il profilo del contenuto in cellule somatiche, hanno
portato fino ad oggi ad individuare valori di riferimento molto eterogenei.
Caria et al. (2000) hanno condotto alcuni studi regionali per individuare il contenuto medio
in cellule somatiche nel latte ovino di massa; nella tabella che segue (Tab. 1) vengono
riportati i risultati di quel lavoro.
Tabella 1 - Valori medi del contenuto in cellule somatiche del latte ovino di
massa in alcune regioni italiane. Da: Caria et al., 2000
REGIONE
CELLULE SOMATICHE (cell./ml)
Sardegna
1.700.000
Lazio
1.000.000
Toscana
1.700.000
Sicilia
1.655.000
Marche
1.463.000
Basilicata
945.000
Calabria
1.235.000
Per la valutazione delle cellule somatiche nel latte di capra, Aleandri et al. (1993) e Rosati
et al. (1995; 1998), in riferimento a studi condotti su allevamenti intensivi di capre di razza
Saanen ed Alpine, hanno dimostrato l’importanza dei fattori di allevamento nell’incremento
delle cellule somatiche.
Con un progetto di ricerca (Rosati et al., 2000) a cui hanno partecipato le regioni Lazio,
Toscana, Sicilia e Sardegna, territori nei quali viene allevato oltre l’80% del patrimonio
6
ovino nazionale (FAOSTAT, 2003), è stato determinato il valore medio delle cellule
somatiche nel campione di latte di massa che è risultato pari a 1.389.000 cell./ml come
media aritmetica e a 1.133.000 cell./ml come media geometrica.
Nello stesso lavoro è stato anche determinato il valore discriminante delle cellule
somatiche tra mammelle sane ed affette da mastite che è risultato di 265.000 cell./ml,
molto più basso rispetto a valori riscontrati nei campioni del latte di massa. Sulla scorta di
tali informazioni, appare evidente quindi l’elevata diffusione delle mastiti negli allevamenti
ovini, ed in particolare delle mastiti subcliniche, come dimostrato da numerosi studi a
livello nazionale ed internazionale.
2.2.2. MATERIALI E METODI
Negli anni 2005-2006 sono stato monitorati campioni di latte di massa provenienti da 425
allevamenti ovini e 5 allevamenti caprini dislocati nelle province di Roma, Viterbo e Latina.
Durante il corso di due lattazioni sono stati analizzati in totale 2291 campioni di latte di
massa ovino e 46 campioni di latte di massa caprino rappresentativi, in media, di 4
mungiture.
I campioni di latte, addizionati di Bronopol (0,03% nel latte), sono stati analizzati entro 2436 ore dal prelievo per il contenuto in cellule somatiche mediante metodo opto-fluorometrico (Fossomatic 5000).
2.2.3. RISULTATI
Ovini
Nel presente studio, durante il primo anno, il valore medio più basso è stato registrato ad
aprile (1.557.000 cell./ml) mentre il valore massimo a giugno (1.933.000 cell./ml).
Nel secondo anno tale parametro ha oscillato tra 1.318.000 cell./ml e 2.407.000 cell./ml,
valori riscontrati rispettivamente nei mesi di novembre 2005 e settembre 2006 (Fig. 1).
7
3000
2407
2500
2000
2280
1933
1788
1761
1502
1495
1414
1000
1318
1252
1562
1551
1557
1500
2117
1829
1751
1631
1653
1270
1208
1077
1444
1318
1676
1349
1861
1568
1271 1288
1200
1098
1611
1365
1087
500
0
gen- feb- m apr- m giu- lug05 05 ar- 05 ag- 05 05
05
05
.
n dic- gen- feb- m apr- m giu- lug- setov- 05 06 06 ar- 06 ag- 06 06 06
05
06
06
C.S. med. Arit.
C.S. med.geo.
Figura 1 - Andamento del valore medio delle cellule somatiche per il
periodo 2005/2006
Dividendo i campioni di latte in classi in base al contenuto in cellule somatiche (Fig. 2), il
48,23% dei campioni è risultato compreso tra 501.000 cell./ml e 1.500.000 cell./ml e il
30,25% si colloca nella classe oltre 2.000.000 cell./ml. Solo il 4,9% dei campioni ha fatto
registrare valori inferiori a 500.000 cell./ml.
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
% camp. CS
<500
501-1000
1001-1500
1501-2000
>2000
4,89
22,96
25,27
16,67
30,25
Figura 2. Distribuzione dei campioni di latte in base alle classi di
contenuto in cellule somatiche nel periodo 2005/2006.
Distribuendo il totale dei campioni, in base ai valori determinati per il latte di massa da
Rosati et al. (2004) risulta che il 51,9% ed il 64,6% di questi, rispettivamente per la media
aritmetica e per la media geometrica, supera questi limiti (Fig. 3).
Considerando il totale dei campioni analizzati in tutto il periodo di studio, emerge un valore
di cellule somatiche pari a 1,38.103 cel./ml, espresso come media geometrica, e di 1.718
.
103 cell./ml, espresso come media aritmetica.
8
64,6
70
%
ca
mp
ion
i
60
50
51,9
48,1
35,4
40
30
20
10
0
<=1133
>1133
<=1389
>1389
Medie
Figura 3. Distribuzione dei campioni in base ai valori medi di
riferimento di cellule somatiche
Caprini
Per le cinque aziende oggetto di studio, è emersa una media geometrica pari a 1.508.000
cell./ml e una media aritmetica pari a 1.745.000 cell./ml (Tab. 2).
Tabella 2 - Valori medi di cellule somatiche per il latte carpino di massa delle aziende
considerate (cell. x 103/ml)
N° aziende
5
N° Campioni Media Geometrica
46
1.508
M. Aritmetica ± D.S.
1.745 ±988
Nella Figura 4 è riportato l’andamento medio mensile delle cellule somatiche durante
l’intera lattazione oggetto di studio. I valori più elevati si sono evidenziati all’inizio ed alla
fine della lattazione rispettivamente con 2.367.000 cell./ml in gennaio e con 2.379.000
cell./ml nel mese di settembre. Il valore più basso, pari a 1.150.000 cell./ml, si è registrato
nel mese di luglio.
9
Cellule Somatiche (x1000 /ml)
Figura 4. Andam ento m edio m ensile delle Cellule Som atiche
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
2379
2367
1341
G en
Feb
1329
1310
M ar
1728
1612
1235
Apr
M ag
G iu
1150
Lug
Ago
Set
M edia Geom etrica
Figura 4 - Andamento del valore medio (media geometrica) delle
cellule somatiche nel latte caprino di massa per il periodo 2005/2006
2.2.4. CONCLUSIONI
Il valore medio del contenuto di cellule somatiche nel latte di massa ovino è risultato pari
a 1.380.000 cell./ml (media geometrica) e di 1.718.000 cell./ml (media aritmetica). In
accordo con quanto asserito nella letteratura consultata, sono stati evidenziati valori più
elevati di cellule somatiche nelle fasi iniziali ed in quelle finali della lattazione. Per quanto
riguarda l’allevamento caprino, è stato ottenuto un valore medio di cellule somatiche nel
latte di massa pari a 1.508.000 cell./ml, considerando la media geometrica, e 2.004.000
cell./ml. espresso come media aritmetica. Anche per l’allevamento caprino nella fase
iniziale e finale di lattazione si osserva un incremento del contenuto cellulare.
Malgrado l’esiguità del campione considerato i valori ottenuti, sono risultati in linea con
quanto altri precedenti lavori evidenziato. Il conteggio delle cellule somatiche nel latte di
massa rappresenta anche per i piccoli ruminanti un valido ausilio per la valutazione e il
monitoraggio dello stato sanitario del gregge.
10
2.3. Studio sperimentale: qualità igienico sanitaria del latte caprino
2.3.1. PREMESSE
Le problematiche relative all’individuazione di un valore soglia di CCS nel latte di capra
sono legate a diversi fattori non infettivi che contribuiscono a determinare un maggiore
contenuto cellulare, fisiologico in questa specie, rispetto a quella bovina e ovina. La
presenza di percentuali elevate di granulociti neutrofili polimorfonucleati nel latte di capra
(45%-74%) suggerisce che la migrazione leucocitaria sia più sostenuta rispetto alle due
specie di riferimento (2%-28%).
La secrezione lattea nella capra è apocrina, e ciò conduce all’eliminazione nel latte di
elevate quantità di particelle citoplasmatiche che costituiscono, sul piano qualitativo, la
principale specificità citologica. Questo ha creato notevoli problemi di natura metodologica
ed interpretativa del conteggio cellulare. Fattori di variazione non infettivi (stadio di
lattazione, estro, vaccinazioni) causano ulteriori difficoltà nell’interpretazione corretta nel
conteggio delle cellule somatiche.
2.3.2. MATERIALI E METODI
La prova sperimentale è stata realizzata presso un allevamento, sito in Provincia di
Viterbo, di circa 70 capre di razza Saanen al loro primo anno di attività. Gli animali sono
allevati con sistema intensivo a stabulazione fissa in strutture coperte in muratura.
L’alimentazione è rappresentata da foraggi misti di produzione aziendale, concentrati
(micronizzati misti, polpe di barbabietola, mangime composto integrato del commercio)
integrazione minerale e vitaminica.
Gli animali sono stati sottoposti con regolarità a interventi di profilassi vaccinale e
antiparassitaria raccomandati per tale sistema di allevamento. La mungitura, eseguita due
volte al giorno, è di tipo meccanico con impianto lineare a 12 posti a linea bassa;
l’impianto è controllato con regolarità dai tecnici del settore. Al termine delle operazioni di
mungitura la sala e l’impianto sono sottoposti a rigorose operazioni di pulizia e
disinfezione.
11
Per lo studio, sono stati selezionati 30 soggetti e monitorati da aprile a luglio. I prelievi di
latte sono stati effettuati ogni tre settimane per un totale di 5 controlli. Per ogni soggetto
sono stati prelevati campioni di latte di massa individuale e di emimammelle. Per i
campioni di latte individuale sono stati determinati i seguenti parametri: produzione,
grasso, proteine, lattosio, residuo magro (RM), urea, caseina, pH, °SH, cellule somatiche
con metodo automatico e microscopico. Plasmina, plasminogeno e frazioni proteiche sono
stati determinati dal Dipartimento di Produzioni Animali. Per i campioni di emimammelle
sono stati eseguiti esami batteriologici per la ricerca di agenti mastidogeni e conteggio
delle cellule somatiche con metodo automatico.
Prelievo dei campioni
Prima di procedere al prelievo ogni emimammella è stata pulita con garza sterile imbevuta
di alcol etilico denaturato. Per i campioni di emimammelle, si è proceduto alla raccolta di
circa 10 ml di latte, utilizzando contenitori sterili monouso, dopo l’eliminazione dei primi
getti di latte. Per i campioni di latte individuale sono stati utilizzati lattoprelevatori e
registrate le produzioni. I campioni prelevati sempre durante la mungitura della mattina,
sono stati trasportati in laboratorio entro le 4 ore dalla raccolta in contenitori refrigerati.
Esame batteriologico
L’esame batteriologico è stato eseguito secondo quanto raccomandato dal National
Mastitis Council (National Mastitis Council, 1987). Ciascun campione, in ragione di 10 µl , è
stato seminato per strisciamento con ansa monouso calibrata su terreno Agar Sangue
defibrinato sterile di montone al 5% (AS) e su terreno Edward’s medium modified (EMM).
I terreni sono stati incubati a 37°C in aerobiosi con lettura delle piastre dopo 24 e 48 ore.
Grasso, proteine, lattosio, caseina, urea e punto crioscopico
La determinazione del contenuto di grasso, proteine, lattosio, caseina, urea, punto
crioscopico è eseguita con Milko Scan FT 6000. Lo strumento usa un sistema infrarosso
compatto a singolo raggio basato sulla tecnica FTIR (Fourier Transform Infrared
Spectroscopy).
12
Conteggio in automatico delle cellule somatiche
Il conteggio delle cellule somatiche viene effettuato con Fossomatic 5000, mediante
citometria di flusso. Le cellule somatiche, colorate con bromuro di etidio, sono inviate
all’interno della cella di flusso e sottoposte ad eccitazione luminosa. La luce fluorescente
emessa è registrata e trasformata in valore numerico per 1000ml.
Attitudine alla coagulazione del latte di pecora e di capra
Il metodo lattodinamografico (Annibaldi et al., 1977; Zannoni & Annibaldi, 1981) permette
la determinazione dell’attitudine alla coagulazione presamica del latte intero crudo,
mediante la determinazione di tre parametri lattodinamometrici che misurano: il tempo di
coagulazione del latte, la velocità di formazione del coagulo, la consistenza del coagulo. I
campioni di latte termostatati a 35 °C vengono addizionati di caglio (200µl della soluzione
consigliata secondo la specie) e posti nel modulo di registrazione per un tempo di 30
minuti. Come campione di riferimento è consigliato latte standard (FIL-IDF 110-87) come
prova in bianco, per controllare il titolo del caglio e come riferimento nelle letture
lattodinamografiche. La metodica permette la determinazione dei seguenti parametri:
r: tempo di coagulazione o durata della reazione primaria tra presame e caseina,
espresso in minuti primi, visualizzato in verticale fino all’aperture della forcella;
k20: velocità di formazione del coagulo o tempo, espresso in minuti primi, che
impiega la cagliata a raggiungere una resistenza meccanica tale da produrre uno
spostamento di 20 mm. iniziare a misurare dall’apertura della forcella di 1 mm fino
a quando la stessa apertura raggiunge i 20 mm;
a30: consistenza del coagulo a 30 minuti, espresso in mm, come misura
dell’ampiezza della forcella a 30 minuti dall’introduzione del caglio.
Determinazione del numero di cellule somatiche per microscopia
Il principio del metodo si basa sulla colorazione differenziale di una quantità prefissata di
latte distesa su vetrino. Il film colorato con Pyronin-Y Methyl-Green è osservato mediante
13
microscopio a 1000 ingrandimenti. Tale colorazione permette di distinguere le cellule
somatiche dai frammenti citoplasmatici per la specificità del Verde- Metile nei confronti del
DNA cellulare.
Il nucleo delle cellule somatiche appare di colore verde-bluastro, mentre i frammenti
citoplasmatici assumono il colore rosso della Pyronin-Y. Nella lettura dei vetrini vanno
contate solo le cellule con un nucleo colorato in verde-bluastro, ben identificabile e
integro. Per i polimorfonucleati sono contate solo cellule che presentano due o più lobi.
Per la parte di preparazione del vetrino, determinazione del campo microscopico, metodo
di conteggio, calcolo del numero in cellule, si fa riferimento alla Gazzetta Ufficiale del
16/04/1992 n.90 – Attuazione della decisione n.91/180/CEE concernente la fissazione di
metodi di analisi e prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente-. Per quanto
riguarda le modalità di colorazione e lettura microscopica si fa riferimento alla Food and
Drug Administration : Direct Microscopic Somatic Cell Count (FDA 2400d).
2.3.3. RISULTATI
Caratterizzazione del contenuto in cellule somatiche mediante lettura microscopica
Nella caratterizzazione del contenuto in cellule somatiche, i leucociti polimorfonucleati
(PMN) rappresentano la componente maggiore in tutti i controlli, oscillando dal 73 all’85%
(Tab. 3).
Tabella 3 - Medie stimate delle componenti cellulari durante l’arco della
sperimentazione.
%
Residui
Citoplasm.
x10³/ml
77
21%
407
85%
97
15%
713
434
76%
133
24%
1006
713
536
75%
90
25%
936
720
531
73%
189
27%
680
556
433
77%
119
23%
745
Controllo
CCS
PMN
x10³/ml
x10³/ml
1°
381
304
79%
2°
423
360
3°
567
4°
5°
Medie totali
Linf/macr
%
x10³/ml
14
Considerazione le classi di ampiezza di CCS superiore ad 106cell./ml e inferiore a
106cell./ml la percentuale di PMN tende ad aumentare nella classe di CCS maggiore a
106cell./ml. La presenza in quest’ultima classe di soggetti con infezioni intramammaria può
spiegare questo incremento poiché nelle emimammelle infette si ha un notevole richiamo
di PMN dal circolo ematico in sede mammaria. Conseguentemente la percentuale di
linfociti e macrofagi, che in questo studio sono stati considerati globalmente, tendono a
diminuire nella classe di CCS maggiore a 106cell./ml.
Tabella 4 - Medie stimate delle componenti cellulari suddivise nelle due classi
di ampiezza (<1.000.000; >1.000.000)
PMF
CCSc
%
CCs
x10³
Linf./macrof
x10³
/ml
x10³/ml
Residui
%
/ml
citoplasmatici
%
x10³/ml
<1.000.000
326
238
73
88
26
715
~doppio
>1.000.000
1707
1436
84
21
16
909
53
Dalla Tab. 4 si può osservare come i residui citoplasmatici (di colore fucsia)(Figura 5), che
costituiscono una specificità fisiologica di questa specie, sono maggiormente presenti nella
classe di CSS inferiore a 106cell./ml. Infatti, in quest’ultima classe rappresentano circa il
doppio del contenuto totale, mentre nella classe con CCS maggiori a 106cell./ml
costituiscono il 53%.
Figura 4 - Caratterizzazione microscopica delle cellule somatiche
del latte di capra(1000 x)
15
Variazioni del contenuto cellulare in relazione allo stato sanitario della mammella
Il contenuto medio di cellule somatiche (CCS) durante l’arco della sperimentazione ha
mostrato un valore di 669.000 cell./ml, facendo registrare un aumento del CCS con
l’avanzare della lattazione. L’esame batteriologico condotto sui campioni di emimammella
ha evidenziato la presenza di S.aureus, S.coagulasi negativo e germi minori quali
Aerococcus viridans, Enterococcus durans, Bacillus cereus, Streptococcus spp. non βemolitico(fig.2). Gli SCN sono stati i microrganismi maggiormente isolati durante la
sperimentazione.
0,02
S.aureus
S.coag.neg
0,22
pat.minori
sane
0,03
0,73
Figura 5 - Prevalenza percentuale degli isolati batterici nel corso della prova
Nella valutazione delle variazioni del CCS, sono state considerate le medie CCS divise per
classi di animali:
1) capra sana in assenza di isolamento batterico nel latte delle due emimammelle;
2) capra infetta in caso di isolamento batterico in almeno una delle due emimammelle.
Fra le capre infette sono state distinte, secondo l’origine dell’infezione:
- le infezioni dovute a germi patogeni maggiori, S. aureus;
16
- le infezioni dovute a stafilococchi coagulasi negativi (SCN);
- le infezioni dovute a patogeni minori.
Considerando i contenuti medi di cellule somatiche e gli isolamenti batteriologici sono state
individuate tre diverse classi, distinte da un differente grado di infiammazione mammaria.
contenuti cellulari medi in funzione dello stato
sanitario della mammella
3000
2573
x 1000 cell/ml
2500
sane
2000
Patogeni minori
1500
SCN
1000
500
422
615
396
S.aureus
0
1
Figura 5 - contenuti cellulari medi in funzione dello stato sanitario della mammella di capra
Nella prima classe (Fig. 5) che comprende soggetti sani e soggetti positivi a patogeni
minori, i contenuti medi cellulari hanno fatto registrare valori al di sotto di 400.000
cell./ml. Nella seconda classe, che comprende soggetti positivi a SCN, i contenuti medi
cellulari sono stati più alti con un valore di 615.000 cell./ml. In ultimo, nella terza classe,
che comprende gli animali positivi a S. aureus, sono stati osservati valori medi di CCS di
2.573.000 cell./ml.
La Tabella 5 mostra come i CCS in presenza di S. aureus si mantengono elevati con forti
oscillazioni durante il periodo di studio. Le variazioni di CCS nella classe di animali sani e
positivi a patogeni minori hanno mostrato contenuti bassi nel corso dei 5 controlli.
17
Tabella 5 - Contenuti cellulari medi (x 103) in funzione dello stato sanitario della
mammella nel tempo.
Stato sanitario
1°
2°
3°
4°
5°
Sane
327
269
411
936
170
Patogeni minori
299
281
379
623
397
SCN
365
704
464
645
896
3560
1415
2329
3404
3158
S. aureus
Caratteristiche chimico-fisiche e produzione del latte in funzione del contenuto in cellule
somatiche
Nella valutazione degli effetti del CCS sui parametri produttivi e quali-quantitativi del latte
sono state considerate due classi di ampiezza di CCS: inferiore ad 1.000.000 cell./ml e
superiore ad 1.000.000 cell./ml. Sono di seguito riportati i valori medi dei parametri
misurati durante il periodo considerato.
Tabella 6 - Medie stimate (± SE) di alcuni parametri chimico-fisici del latte di tutto il periodo
considerato
Grasso %
Proteine %
Lattosio %
Caseina %
pH
°SH/50 ml
2,39 ± 0,055
2,59±0,016
4,42±0,02
2,08±0,024
6,72±0,008
2,78±0,042
Influenza del CCS sulla produzione
La produzione media di latte per capo relativa alla mungitura della mattina nel periodo
considerato è stata di 1707 g. Il minimo della produzione ha coinciso con il massimo
contenuto cellulare registrato (Tabella 7).
Tabella 7 - Produzione di latte di capra nel corso dei cinque
controlli eseguiti duralte la lattazione e CCS
1°
2°
3°
4°
5°
Prod. kg
1,747
1,808
1,718
1,529
1,838
103 cell./ml
571
632
557
833
782
18
Se si considera la produzione in funzione delle due classi di ampiezza di CCS risulta una
differenza di circa 50 g di latte (1712 g vs 1661 g). Anche se la produzione di latte in
funzione del CCS non è risultata statisticamente significativa, occorre evidenziare che se
rapportata ad un intero ciclo di produzione la perdita produttiva può risultare rilevante.
Influenza del CCS sulle caratteristiche chimico-fisiche del latte
Il confronto dei parametri qualitativi in funzione del CCS nelle due classi di ampiezza
hanno mostrato significative differenze per il contenuto in lattosio, e in grasso (Tabella
8).
Tabella 8 - Valore medio (±
± ES) di alcune caratteristiche del latte di capra in relazione alla classe di CCS.
Classe di CCS
(103cell./ml)
Grasso %
Proteine %
Lattosio % Caseina %
pH
°SH/50 ml
<1.000
2,36*±0,05 2,59±0,01
4,42*±0,01 2,11±0,01 6,72±0,007 2,76±0,03
>1.000
2,54*±0,17 2,60±0,04
4,34*±0,05 2,07±0,04 6,69±0,022 2,79±0,096
Per quanto riguarda le frazioni caseiniche riduzioni significative della αs- caseina e ßcaseina si osservano nel latte con CCS maggiori a 106 cell./ml (Tabella 9) mentre aumenti
significativi si evidenziano nella stessa classe a carico dei proteoso-peptoni (prodotti della
degradazione caseinica). Anche l’indice caseinico (I-CN), ottenuto dal rapporto tra caseina
totale e proteine totali, tende a diminuire significativamente con l’aumentare del contenuto
cellulare.
Tabella 9 - Valore medio frazioni caseiniche (α-, β- e γ-caseine), indice caseinico, prodotti della
degradazione caseinica (proteso peptonei, PP) del latte di capra in relazione con la classe di
CCS.
Classe di CCS αs-CN (g/l)
(103cell./ml)
ß-CN (g/l)
γ-CN (g/l)
PP (g/l)
I-CN (%)
<1.000
9,7
15,9
0,9
0,69
81
>1.000
8,1
14,3
0,9
0,84
79
19
Influenza del CCS sulle caratteristiche lattodinamografiche
In funzione del tempo di cogulazione, suddiviso in tre classi ( r<10 min’; 20 min’>r>10
min’; r>20 min’) sono stati elaborati i valori medi di: K10, A30, pH, SH, α-CN%, β-CN%, κCN%, CCS e produzione. Dal confronto tra classi (Tab. 10) è emerso che i campioni di
latte con r inferiore a 10 minuti, hanno dato una risposta significativamente migliore alla
coagulazione avendo tra l’altro una più veloce formazione del coagulo (K10), un maggior
contenuto in α-CN ed un valore di pH più basso. Nei campioni di latte con valori di r
superiori a 20 minuti, si sono avute differenze significative e un peggioramento qualiquantitativo del latte.
Tabella 10 - Valori medi ± ES di alcune caratteristiche del latte di capra e della produzione
quantitativa in funzione dei valori del tempo di coagulazione r. Significatività statistica delle
differenze: A,B,C =P<0,01; a,b,c P<0,05.
r < 10 min’
10 min’<r< 20 min’
r >20 min’
K10
1,50±0,74A
4,89±0,68B
22,39±0,89C
a30
14,65±0,88B
13,680,80±B
3,28±1,06A
pH
6,64±0,16Aa
6,69±0,14b
6,71±0,19B
°SH/50 ml
2,62±0,06B
2,68±0,05B
2,48±0,07A
αs-CN (g/l)
5,03±0,37b
5,30±0,38b
4,73±0,26a
β-CN (g/l)
11,40±0,58
12,43±0,61
11,79±0,69
k-CN (g/l)
1,80±0,14
1,91±0,24
1,89±0,15
CCS (103/ml)
608±108a
586±95a
771±145b
Plasmina (U/l)
19,8±0,1
19,9±0,1
20,1±0,3
Produzione (ml/die)
2732±117
2645±106
2501±142
Influenza del CCS sul sistema plasmina – plasminogeno
L’attività della plasmina e del plasminogeno hanno mostrato un graduale aumento con
l’avanzare della lattazione. Confrontando l’attività di questi enzimi con le due classi di
ampiezza di CCS si evidenziano differenze significative tra le due classi (Tabella 11).
20
Tabella 11 – Valori medi del contenuto in plasmina e
plasminogeno del latte di capra in funzione della classe di
CCS.
CCS (cell./ml)
Plasmina
Plasminogeno
< 1.000.000
19,33
3,09
> 1.000.000
20,35
3,23
Come riportato da altri autori lo stato sanitario della mammella influenza l’attività della
plasmina e del plasminogeno, che aumenta durante i processi infiammatori-infettivi.
2.3.4. CONCLUSIONI
I risultati ottenuti in questa sperimentazione hanno evidenziato un valore medio di CCS di
669.000 cell./ml. I granulaciti polimorfonucleati rappresentano la principale componente
cellulare presente nel latte di capra (oltre il 70%). L’esame batteriologico ha evidenziato
una maggiore prevalenza di SCN confermando quanto è emerso da altri studi. L’incidenza
di S.aureus è stata bassa e ciò in accordo con altri studi circa la minore capacità di
trasmissione che lo S.aureus ha negli allevamenti caprini. Gli animali positivi a S. aureus,
oltre a presentare i più alti contenuti cellulari, hanno mostrato un notevole incremento
dell’attività della plasmina e del plasminogeno. Pur essendo stata effettuata una adeguata
terapia antibiotica, si è costantemente riscontrata nel latte la presenza di S. aureus. Da ciò
si può dedurre l’estrema difficoltà nella lotta terapeutica contro tali infezione mammaria e
la convenienza ad eliminare i soggetti positivi, quale presidio fondamentale per il
risanamento dell’allevamento. Va ricordata inoltre la capacità che hanno alcuni ceppi di S.
aureus di produrre enterotossine e di causare quindi tossinfezioni alimentari. In particolare
un punto critico potrebbe essere l’utilizzo di latte crudo infetto per la trasformazione
casearia.
Per quanto riguarda le infezioni da SCN non sempre si sono osservati variazioni del CCS,
della produzione e dell’attività della plasmina e del plasminogeno. Gli studi fatti fino ad
oggi, non sono ancora in grado di chiarire il ruolo degli SCN come patogeni intramammari.
21
La presenza di altri microrganismi (minori) non ha fatto registrare variazioni significative
del CCS e degli altri parametri, mostrando valori simili ai soggetti sani. Si conferma che il
latte di capre non infette possono contenere fino a 2x106 cell./ml. Emerge che contenuti
cellulari superiori a 106 cell./ml sono correlati con perdita produttiva, riduzione del lattosio
e aumento degli enzimi caseinolitici i quali possono causare una degradazione della
componente caseinica con conseguente peggioramento dell’attitudine alla caseificazione.
L’indicazione di un valore soglia di CCS inferiore a 750.000 cell./ml può essere utilizzato
per definire lo stato di sanità della ghiandola mammaria. Il livello di 1,5 x 106 cell./ml per il
latte di massa sembra essere un limite appropriato per migliorare la condizione degli
allevamenti di capre da latte.
2.4. Studio sperimentale: qualità igienico sanitaria del latte ovino
2.4.1. PREMESSE
Come per la specie caprina, anche nella specie ovina, l’Unione Europea, non ha ancora
stabilito un limite legale circa il contenuto di cellule somatiche (CCS) nel latte di massa.
Nonostante le indicazioni reperibili dalla letteratura internazionale e nazionale ancora oggi
non è chiaro quali siano i livelli di cellule somatiche a cui fare riferimento in condizioni di
campo che possano dare informazioni sulla qualità totale del latte e quella tecnologica in
particolare.
2.4.2. MATERIALI E METODI
La prova sperimentale è stata realizzata presso un allevamento di tipo semintensivo
costituito da 400 pecore di razza sarda sito in provincia di Viterbo. L’alimentazione è
rappresentata da pascolo su erbai e prati, con integrazione di mangimi semplice al
momento della mungitura. La mungitura, eseguita due volte al giorno, è di tipo meccanico
con impianto lineare a 24 posti.
Per tale prova sono stati selezionati 30 animali sani (sia primipare che pluripare) e
monitorati per l’intera lattazione. I prelievi di latte sono stati effettuati ogni 4 settimane,
durante la mungitura della mattina per un totale di 5 controlli. In ogni controllo è stata
valutata la morfologia della mammella. Per ogni soggetto sono stati prelevati, dapprima,
22
campioni di emimammella per l’esame batteriologico e citologico. Subito dopo è stata
misurata la produzione di ogni emimammella, mediante cilindri graduati, ed eseguito un
prelievo di latte rappresentativo di ciascuna emimammella. Su tali campioni sono stati
determinati i seguenti parametri: produzione, grasso, proteine, lattosio, residuo magro
(RM), urea, caseina, pH, °SH, cellule somatiche con metodo automatico e microscopico. I
parametri quali plasmina, plasminogeno e frazioni proteiche sono stati determinati dal
Dipartimento di Produzioni Animali. Le metodiche d’analisi dei parametri sopra citati sono
già descritte nel paragrafo riferito all’analisi del latte caprino, al quale si rimanda per le
specifiche.
2.4.3. RISULTATI
Variazioni del contenuto cellulare in relazione allo stato sanitario della mammella
Il contenuto medio di cellule somatiche durante l’arco della sperimentazione ha mostrato
un valore di 648 cell./ml. La percentuale di emimammelle infette, nel periodo considerato,
è stata del 24,2%. I principali patogeni isolati sono risultati gli Stafilococchi coagulasi
negativi (SCN) (Fig. 6).
18,8%
5,5%
75,7%
CNS
Other bacteria
Negative
Figura 6 - prevalenza percentuale di isolati batterici durante la lattazione
Durante l’intera lattazione il 67,7% delle emimammelle infette sono risultate positive
all’esame batteriologico in tre o più campionamenti consecutivi. La prevalenza di mastiti
subcliniche è stata maggiore nei soggetti dalla terza lattazione in avanti rispetto agli
animali in prima o seconda lattazione.
Il 66,2% dei soggetti ha mostrato una infezione unilaterale. Confrontando emimammelle
di soggetti con infezione unilaterale e bilaterale non sono state osservate differenze
significative dei parametri produttivi e qualitativi, anche se i soggetti con infezione
23
bilaterale hanno mostrato una minore produzione di latte e un maggiore CCS rispetto ai
soggetti con infezione unilaterale (Tabella 12).
Tabella 12 - Media stimata e DS della produzione di latte nell’ovino e del CCS di emimammelle con infezione unilaterale e bilaterale
CCS (log10)
Produzione (Kg/mungitura)
Infezione unilaterale
Infezione bilaterale
5,80±0,73
6,04±0,74
0,302±0,138
0,250±0,149
Le emimammelle infette hanno mostrato un CCS significativamente superiore rispetto a
quelle sane (871.000 cell./ml Vs 204.000 cell./ml), mentre per quanto riguarda la
produzione si è osservata una riduzione di circa il 30% della quantità di latte. In termini
quantitativi un’emimammella sana mediamente produce 410 g di latte per singola
mungitura contro i 284 g prodotti da una emimammella infetta. Considerando una
lattazione di 200 giorni, si avrebbe una perdita produttiva stimata di circa 45,4 litri di latte
per animale corrispondente ad una perdita economica di ca. 34 Euro (prezzo del latte 0,75
euro/l).
Tabella 13 - Medie della produzione, CCS e caratteristiche chimico-fisiche del latte ovino in
base allo stato igienico.sanitario delle emimammelle. Significatività statistica delle differenze:
A,B,C
=P<0,01; a,b,c P<0,05.
Emimammella infette
CCS, cell./ml
Produzione, kg/mungitura
Grasso ,%
Proteine, %
Lattosio, %
Indice di caseina, %
pH
°SH
Tempo di coagulazione, min
Consistenza coagulo, mm
Velocità formazione, min
a
871.000
0,284a
4,91
5,55
4,98a
77.32a
6,57a
8,55a
21,10
42,00
1,58
Emimammella sane
204.000b
0,410b
4,87
5,38
5,16b
78,48b
6,49b
10,53b
20,84
45,57
1,64
Relativamente alle caratteristiche chimico-fisiche del latte, le emimammelle infette hanno
presentato un’acidità titolabile (°SH), un indice di caseina e un contenuto in lattosio più
basso rispetto alle emimammelle sane (Tab. 13). La qualità tecnologica del latte ha fatto
24
registrare una elevata percentuale di campioni con scarsa attitudine alla coagulazione
presamica.
Nell’ambito dei soggetti che hanno presentato infezione unilaterale, sono state confrontate
le emimammelle infette con le rispettive controlaterali sane. Dal confronto è emerso che le
prime hanno mostrato un maggiore CCS, un aumento di pH e una minore acidità titolabile.
Tuttavia non sono state osservate differenze significative per quanto riguarda la
produzione e gli altri componenti. Per verificare l’effetto della emimammella infetta sulla
controlaterale non infetta sono stati confrontati i parametri analizzati di emimammelle
sane di soggetti con infezioni unilaterale e emimamelle sane di soggetti completamente
sani. Risulta che le emimammelle di animali completamente sani hanno presentato una
produzione significativamente maggiore e un minore CCS rispetto alle emimammelle sane
di animali con mastiti unilaterali (Tabella 14). Ciò potrebbe significare un effetto
sistemico della emimammella infetta sulla controlaterale sana.
Tabella 14 - Medie della produzione, CCS e caratteristiche chimico-fisiche di emimammelle sane di
soggetti con infezione unilaterale e di emimammelle di soggetti completamente sani. Significatività
statistica delle differenze: A,B,C =P<0,01; a,b,c P<0,05.
Controlaterale sane
Completamente sane
871.000a
204.000b
0,309 a
0,416b
Grasso, %
4,82
4,71
Proteine, %
5,76
5,31
Lattosio, %
5,01a
5,22b
Indice di caseina, %
78.44
78,72
pH
6,50
6,49
°SH
11,12a
9,84b
Tempo di coagulazione, min
20,05
21,55
Consistenza coagulo, mm
41,91
41,16
Velocità formazione, min
1,58
1,72
CCS, cell./ml
Produzione, kg/mungitura
25
Caratteristiche chimico-fisiche e produzione del latte in funzione del contenuto in cellule
somatiche.
Nella valutazione dell’influenza che ha il CCS sui parametri produttivi e di composizione del
latte di emimammella, sono state considerate quattro classi di cellule somatiche come di
seguito riportate:
1) contenuto inferiore a 200.000 cell./ml
2) contenuto tra 200.000 e 400.000 cell./ml
3) contenuto tra 400.000 e 800.000 cell./ml
4) contenuto maggiore a 800.000 cell./ml
La produzione media di latte per capo per giorno è di 1,149 Kg/die. Nella Figura 7 è
riportata la variazione della produzione nel corso della lattazione.
1,600
1,400
1,400
1,351
1,173
1,156
1,200
kg/dì
1,000
0,827
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
30
58
86
114
142
gg dal parto
Figura 7 - Variazione della produzione nel corso della lattazione.
Considerando la produzione in funzione del CCS si può osservare che all’aumentare del
contenuto cellulare corrisponde una riduzione significativa della quantità di latte prodotto
(Figura 8). In particolare la riduzione risulta essere più marcata quando si passa dalla
classe 1° alla classe 2° e dalla 2° alla 3°, mentre non si osservano differenze tra la classe
con contenuti cellulari tra 400 e 800 x 103 e tra la classe con contenuti cellulari maggiori a
800 x 103.
26
0,450
0,400
0,350
0,300
0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
0,404 A
0,335 B
0,278 C
<200
0,273 C
>=200 ;<400 >=400;<800
>800
Figura 8 - Produzione media (kg) di emimammella nell’ovino in funzione
delle classi di CCS considerate. A,B,C P<0.01
In termini di perdita produttiva (Tab. 15), si può osservare la riduzione percentuale di
latte per classi di CCS considerate. Le emimammelle che presentano contenuti cellulari
superiori a 400 x 103 cell./ml producono mediamente il 31% in meno.
Tabella 15 - Perdita produttiva nell’ovino in funzione delle classi delle classi di CCS.
Classe CCS (103 cell./ml)
Calo prod. (g/die)
Calo prod. (%)
1°
<200
-
-
2°
>200, <400
- 69 g
- 17
3°
>400-<800
- 125 g
- 31
4°
>800
- 131 g
- 32
Influenza del CCS sulla composizione in grasso, proteine, lattosio
I valori medi dei componenti del latte durante il periodo considerato sono risultati: grasso
5,13%, proteine 5,93, lattosio 4,77. Considerando tali parametri in funzione del contenuto
cellulare (Fig. 9) risulta un aumento significativo del grasso (4,79% Vs 5,37%) e proteine
(5,25% Vs 5,82%) nella classe di cellule somatiche maggiori a 200 x 103. Contrariamente
il lattosio subisce una riduzione significativa (5,26% Vs 4,73%). Il lattosio, disaccaride di
27
stretta sintesi mammaria, risulta essere un indicatore molto sensibile della funzionalità
della ghiandola mammaria.
% grasso, proteine , lattosio
<200
>=200 ;<400
>=400;<800
>800
5,60
7
5,40
6
5
5,20
4
5,00
3
4,80
2
4,60
1
0
4,40
<200
>=200 ;<400
>=400;<800
grasso
proteine
>800
lattosio
Figura 9 - Contenuto in grasso, proteine e lattosio in funzioni delle classi di ampiezza di SCC.
Influenza del CCS sulle caratteristiche lattodinamografiche
L’attitudine del latte alla coagulazione presamica risulta influenzata dal contento cellulare.
Infatti si può osservare (Tabella 16) un aumento significativo del tempo di coagulazione
in campioni di latte con contenuti cellulari maggiori a 800 x 103 cell./ml e negli stessi una
riduzione significativa della consistenza del coagulo.
Tabella 16 - Parametri lattodinamografici in funzione delle classi di CCS. Significatività
statistica delle differenze: a,b,c P<0,05.
<200
>200- <400
>400-<800
>800
Tempo di coag. (min’)
20,57a
20,29a
18,42a
22,67b
Consistenza coagulo (mm)
43,23a
43,63a
45,78a
33,67b
Velocità formazione (min’)
1,63
1,53
1,49
1,90
28
Inoltre si assiste all’aumentare del contenuto cellulare un aumento dei campioni non
reattivi alla prova della coagulazione (Figura 10). In particolare il 49% dei campioni con
contenuti cellulari maggiori a 800 x 103 cell./ml non hanno reagito all’aggiunta del caglio
nelle condizioni sperimentali (30 min).
% campioni non reattivi
60%
49%
50%
40%
30%
28%
29%
>=200 ;<400
>=400;<800
20%
10%
7%
0%
<200
>800
Figura 10 - Percentuale di campioni di latte ovino non reattivi in funzione delle classi
di CCS
Influenza del CCS sull’indice caseinico, pH, °SH
Anche i parametri più strettamente tecnologici quali l’indice caseinico il pH e i gradi °SH
sono influenzati del CCS. Per quanto riguarda l’indice caseinico una riduzione significativa
si osserva nella classe di campioni con cellule somatiche maggiori a 800 x 103 cell./ml
(Figura 11) mentre non si osservano differenze significative nelle altre classi considerate.
79,20
78,97 A
79,00
% indice caseina
78,80
78,65 A
78,52 A
78,60
78,40
78,20
78,00
77,81 B
77,80
77,60
77,40
77,20
<200
>=200 ;<400
>=400;<800
>800
Figura 11 - Indice caseinico del latte ovino in funzione delle classi di CCS (103
cell./ml). A,B P<0.01.
29
Riguardo l’acidità attuale (pH) un aumento significativo si registra in emimammelle con
contenuti cellulari maggiori a 800 x 103 cell./ml ( 6,49 Vs 6,65) in corrispondenza l’acidità
titolabile (°SH) tende a diminuire significativamente ( 10,20 Vs 8.64) (Figura 12).
6,7
10
6,65
9,5
6,6
6,55
9
8,5
pH
°SH
10,5
6,5
8
6,45
7,5
6,4
<200
>=200 ;<400
>=400;<800
°SH
>800
pH
Figura 12 – Andametop del pH e di °SH nel latte ovino in funzione delle classi
di SCC (103 cell./ml).
Morfologia della mammella e parametri produttivi e di composizione del latte
Ad ogni controllo prima della mungitura è stata eseguita la palpazione della mammella e
valutata la morfologia come descritto nella Figura 13. Le mammelle definite come A
presentavano circonferenza in corrispondenza degli attacchi ampia, simmetria delle
emimammelle e angolazione dei capezzoli inferiore a circa 45°. Le mammelle classificate
come C presentavano attacchi medi, pendenza della mammella e angolazione dei capezzoli
maggiori a circa 45°. In ultimo le mammelle E, presentavano attacchi piccoli, asimmetria
della mammella e capezzoli con angolazione maggiore a circa 45°.
Sono stati confrontati i valori medi dei parametri produttivi e delle caratteristiche chimicofisiche e sanitarie (Tabella 17) del latte appartenente alle tre classi di mammelle. I
risultati mostrano una riduzione della produzione di latte della mammella tipo C e tipo E
rispetto alla mammella A. In particolare la mammella tipo E produce circa 0,300
Kg/mungitura in meno rispetto alla mammella tipo A, con una perdita percentuale di circa
il 34,3%.
30
Figura 13 - Classificazione della mammella in base alla morfologia
Da un punto di vista tecnologico il latte prodotto dalla mammella E presenta un minore
contenuto in lattosio, un indice caseinico inferiore, una maggiore acidità attuale (pH) e
una minore. Anche se i parametri determinati per valutare l’attitudine alla coagulazione
non presentano differenze tra le tre classi, si osserva che il 22,8% del latte di mammelle
tipo C e il 50% tipo E non coagulano dopo l’aggiunta di caglio.
Tabella 18 - Produzione, composizione e caratteristiche lattodinamografiche in funzione della
morfologia della mammella.
Classe A
Classe C
Classe E
kg/mungitura
0,874
0,684
0,574
Grasso (%)
4,35
5,08
4,84
Proteine (%)
5,35
6,05
5,96
Lattosio (%)
5,19
5,07
4,65
Caseina (%)
4,22
4,77
4,66
Ind.caseina (%)
78,95
79,09
77,68
Tempo coagulaz. (min’)
20,95
20,64
20,70
Consistenza coagulo (mm)
41,52
45,47
41,22
Velocità formaz. coag. (min’)
1,65
1,61
1,72
pH
6,50
6,53
6,60
10,04
10,20
8,68
204
295
617
% emimam. infette
21,05
22,8
45,65
% campioni non coag.
12,28
26,31
50
°SH
3
CCS m.geom. (10 cell./ml)
31
Per quanto riguarda lo stato sanitario il 45,65% delle mammelle E sono risultate positive
all’esame batteriologico facendo registrare un contento cellulare di 617 x 103 cell./ml.
Mentre la percentuale di mammelle tipo A e tipo C risultate positive all’esame
batteriologico è stato rispettivamente del 21,05% e 22,8% con contenuti cellulari di 204 x
103 cell./ml per il tipo A e 295 x 103 cell./ml per il tipo E.
2.4.4. CONCLUSIONI
I risultati ottenuti da questo studio permettono di fare le seguenti considerazioni. In prima
analisi si evidenzia che elevati contenuti cellulari sono associati ad una notevole riduzione
della produzione e ad un peggioramento delle caratteristiche chimico- fisiche e di
coagulazione del latte. La riduzione della produzione di latte si osserva in emimammelle
con contenuti cellulari superiori a 200 x 103 ( 17% al 33%). Anche il lattosio subisce una
riduzione nel latte prodotto da emimammelle con contenuti cellulari >200 x 10^3,
risultando un indicatore sensibile dello stato infiammatorio della ghiandola mammaria.
Spostando l’attenzione sui parametri più tecnologici, quali indice caseinco, pH, °SH e indici
lattodinamografici, peggioramenti della caratteristiche casearie si osservano nel latte di
emimammelle con contenuti cellulari superiori a 800 x 10³. Riguardo allo stato sanitario
della ghiandola mammaria, emerge che le forme di mastiti sub cliniche determinano un
peggioramento della qualità del latte. In questo studio risulta come valore discriminante
tra emimammella sana e infetta 200 x 10³ cell./ml, valore in linea con quanto riportato da
nostri precedenti studi (Rosati et al., 2004). Tuttavia occorre considerare che un
peggioramento della qualità tecnologica del latte si evidenzia quando i contenuti cellulari
sono superiori a 800 x 10³.
Di particolare importanza risulta essere il grado di persistenza dell’infezione, infatti
contenuti cellulari elevati si osservano in emimammelle con tre o più isolamenti
batteriologici. Inoltre sembra evidenziarsi un effetto sistemico dell’emimammella infetta
sulla corrispondente sana. Il conteggio delle cellule somatiche rappresenta anche per i
piccoli ruminanti un valido indicatore dello stato sanitario della mammella. Il fatto che
questo parametro non venga per ora contemplato da alcuna specifica normativa non ne
diminuisce a nostro avviso l’importanza alla luce della preoccupante diffusione di mastiti
subcliniche da noi e da altri autori riscontrata. Per il controllo delle forme di mastite sub
32
clinica la determinazione ripetuta del contenuto in cellule somatiche e la conformazione
della mammella può essere un valido strumento di screening per la selezione di soggetti
da campionare per l’identificazione degli agenti eziologici di infezione e per indirizzare
misure profilattiche e terapeutiche idonee.
Le applicazioni dei controlli suddetti deve andare di pari passo con un miglioramento delle
condizioni igienico-sanitarie dell’allevamento e delle operazioni di mungitura, con controlli
periodici degli impianti di mungitura e con una maggiore attenzione agli aspetti nutrizionali
e gestionali.
3. ANALISI DELLE FRAZIONI CASEINICHE DEL LATTE OVINO
4.1. Premesse
4.1.1. Il latte ovino
La sintesi delle proteine avviene nella ghiandola mammaria a partire da aminoacidi
veicolati dal torrente circolatorio. La componente proteica è costituita da due principali
frazioni con caratteristiche diverse e di fondamentale importanza sia per la caseificazione
che per il valore nutrizionale del latte: le caseine, che rappresentano circa l'80% della
proteina totale nel latte di pecora, e le sieroproteine (o proteine solubili).
Le caseine sono le proteine preponderanti nel latte di quasi tutte le specie di mammiferi e
sono quelle che, sotto l’azione dell’enzima chimosina contenuto nel caglio, si addensano
costituendo la "cagliata", complesso precipitativo che include anche i globuli lipidici. Le
caseine sono un gruppo eterogeneo di proteine fosforilate presenti nel latte come
complessi stabili fosfoproteici di calcio, denominati “micelle”. Nel caso della pecora, come
in altri ruminanti, esse si compongono di 4 diverse frazioni complesse (αs1-, αs2-, β-, k-), La
loro importanza è quindi fondamentale nel processo di caseificazione determinando la
velocità di formazione del coagulo della cagliata e la sua consistenza. Il tenore in kcaseina, in particolare, gioca un ruolo determinante nel meccanismo di coagulazione
presamica del latte; tale frazione caseinica ha un effetto marcato sulla velocità di
aggregazione della micelle. Infatti, il diametro medio delle micelle è inversamente
proporzionale alla quantità di k-caseina presente nel latte.
33
Le sieroproteine, le cosiddette proteine solubili (β-lattoglobulina, α-lattoalbumina e siero
albumina), presentano peso molecolare inferiore alle caseine, non hanno la capacità di
coagulare per azione del caglio e rimangono così in soluzione nel siero residuo. Per
provocare la coagulazione di tali proteine occorrono temperature elevate. Riscaldando il
siero, esse si separano sotto forma di flocculi che, affiorando, possono essere raccolti per
la produzione della ricotta. Le sieroproteine sono presenti nel latte di pecora in
percentuale più elevata rispetto al latte caprino e vaccino ed essendo ricche di
amminoacidi essenziali, conferiscono al latte un alto valore biologico. In generale, la
quantità della proteina risulta meno variabile rispetto al tenore in grasso, ma risente
ugualmente del periodo della lattazione seguendo dinamica simile. Con il procedere della
lattazione, il latte si osserva un arricchimento in caseina e proteine solubili (Fig. 13) a
scapito delle forme azotate non proteiche. Nel latte di pecora il rapporto tra le proteine e
la materia azotata totale è molto elevato (pari al 95%) ad indicare un contenuto in azoto
non proteico molto basso. Importanti sono i fattori genetici e ambientali, in primis
l'alimentazione.
Figura 13 – Latte di pecora. Andamento del contenuto di proteine totali e
caseine durante la lattazione (adattato da: Pugliese et al., 1998)
Tabella 19 - Composizione media percentuale (p/p) del latte di pecora.
Componenti
%
Acqua
81,75
Grasso
7,09
Proteine
5,75
Caseina
4,42
Frazioni
%
αs1 + αs2
29,60
β
55,10
34
k
γ
Proteine solubili
1,06
Azoto non proteico
0,265
8,90
6,50
β–lattoglobuline
51,40
α -lattoalbumine+sieroalbumine
proteosi-peptoni
25,10
5,60
globulina
17,90
urea
aminoacidi
44,80
15,70
creatinina
1,70
creatina
2,40
ammoniaca
0,10
ac. urico
n.d.
2,10
33,30
Tabella 20 – Dati della letteratura sulle frazioni caseiniche per varie specie da latte.
Frazione caseinica
Latte
Bovino
Bufalino
Caprinoa
Caprinob
Ovino
Minore
Caseina
αs2-cas
(%)
αs1-cas
(%)
12,1
39,5
37,2
11,2
-
-
9,3
10,1
37,6
38,6
33,4
38,7
19,7
12,7
-
85,7
84,3
7,8
38,1
44,6
9,5
-
81,6
10,5
7,1
11,9a
12,8b
17,6
12,9
13,6
11,0
19,3
14,0
38,4
37,6
38,1
29,1
30,2
31,1
18,4
21,0
1,9
10,3
0,0
36,5
41,4
37,2
39,7
33,9
27,9
54,0
48,0
58,5
63,3
60,0
12,5
8,6
11,4
16,3
15,4
6,5
12,4
15,0
14,9
8,3
20,0
-
-
1,6
5,0
5,4
6,0
-
8,0
35,0
38,0
17,0
-
-
13,7
33,1
30,1
14,3
-
-
β-cas
(%)
Riff.
κ-cas
(%)
Mora-Gutierrez et al.
(1991)
Bobe et al. (1998)
Walstra et al. (1984)
Cordeiro et al. (2001)
Bordin et al. (2001)
Zicarelli (2004)
Bramanti et al. (2003)
Mariani et al. (1993)
Zicarelli (2004)
Bramanti et al. (2003)
Tziboula & Home (1999)
Pierre et al. (1995)
Tziboula & Home (1999)
Bramanti et al. (2003)
Pierre et al. (1995)
Calavia & Burgos (1998)
Dall’Olio et al. (1990)
Papoff et al. (1993)
Bramanti et al. (2003)
a
genotipo “αs1 alta”
b
genotipo “αs1 bassa”
La differenziale presenza delle frazioni caseiniche ha diverse importanti implicazioni sulla qualità in
senso lato del latte. Infatti, a seconda della maggiore o i minore quantità di alcune frazioni rispetto
ad altre (Tabb. 19 e 20), le proprietà ci caseificazione del latte possono essere molto variabili.
35
Anche sotto il profilo dell’immunogenicità, la minore o maggiore presenza della frazione αs1-cas,
riveste un ruolo importantissimo. Tale variabilità e di origine genetica. Nella capra, infatti, è noto
che il locus genico per questa caseina è fortemente polimorfico con almeno 5 varianti alleliche cui
corrispondo diverse capacità di sintesi della frazione αs1-cas: A, B e C 100%, E ca. 44%, D ed F ca.
17%, etc.). Anche per la vacca sono riportati in letteratura dati sulla variabilità di sintesi delle
frazioni caseiniche su basi genetiche: ad es. il locus per la κ-caseina che presenta 2 varianteo
alleliche (A e B) (Mariani & Pecorari, 1991) oppure la presenza di differenti genotipi per livello (ca.
10%) di sintesi dell’αs1-cas in vacche di razza bruna (Mariani et al., 1993).
4.1.2. Metodi cromatografici per l’analisi delle proteine del latte
I metodi cromatografici, consentono la separazione e la quantificazione di composti di
varia natura. Nello specifico, la cromatografia di proteine viene di norma condotta con la
tecnica HPLC (High Pressare Liquid Chromatography) impiegando un fase stazionaria
apolare (di norma resine o silice come supporto rivestite di molecole alifatiche a 4, 8 o 18
atomi di carbonio con o senza presenza di doppi legami). Una tipica fase stazionaria
inversa è la C18 alchene legata a microsfere silicee di 5 µm di dimetro, nota anche come
Octa-Decyl-Silane 2 - ODS2). Nel caso dell’analisi delle proteine del latte, in letteratura
sono riportate altre tecniche cromatografiche d’analisi come il metodo ottimizzato da
Bramanti et al. (2003) che sfrutta la capacità separativa di particolari colonne con fase
stazionaria parzialmente idrofobia (Propyl HIC, 10 x 4,6 cm, 6,5 µm – 300 Å) e fase
mobile a forza ionica decrescente in gradiente d’eluizione (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC). Sebbene questo tipo di tecnica offra buoni risultati con minimo
pre-trattamento del campione, l’impiego di tamponi ad elevata forza ionica e ad elevata
concentrazione di urea (8,0 M), rende l’approccio problematico da un lato per la
preparazione dei tamponi (filtrazione e degasaggio) me soprattutto dall’altro per le
complicazioni che insorgono con l’impiego in HPLC di tali tamponi che richiedono
un’attenzione esecutiva piani di manutenzione particolarmente impegnativi.
D’atro canto, le tecniche a fase inversa che impiegano fasi mobili più semplici e meno
“aggressive” per le parti in movimento (valvole e pompe) e per le colonne, sono state con
successo impiegate per l’analisi delle frazioni caseiniche e per le proteine del siero. Ad
esempio Bordin e collaboratori (2001) hanno messo a punto e valicato un metodo in RP-
36
HPLC per la separazione e quantificazione delle proteine del latte a partire da campione
sgrassato sottoposto ad un trattamento minimo.
4.2. Materiali e metodi
4.2.2. Campionamento
I prelievi di latte ovino sono stati condotti mensilmente in un allevamento di pecore di
razza Sarda in Provincia di Viterbo. Sono state considerate 30 pecore primipare in buone
condizioni generali di salute senza, evidenti segni clinici di mastite. Il prelievo dei campioni
individuali d’emimammella, è stato effettuato con cadenza mensile durante la mungitura
mattutina. Il periodo di controllo ha avuto durata di 5 mesi, da Febbraio 2006 fino Giugno
2006. In totale 586 campioni di latte sono stati raccolti entro tubi da centrifuga in
polietilene da 10 ml e conservati alla temperatura di -20°C fino al memento dell’analisi.
Per l’analisi causale della variabilità del profilo caseinico sono stati considerati 107
campioni d’emimammella selezionati in base ai seguenti criteri:
Criterio di selezione
N. campioni
Emimmelle affette bilateralmente
44
Emimammelle controlaterali sane
31
Emimammelle sotto 100000 SCC /ml
9
Emimammelle oltre 500000 SCC /ml
23
4.2.3. Metodo RP-HPLC per le caseine del latte di pecora
I metodi cromatografici, consentono la separazione e la quantificazione di composti di
varia natura. Nello specifico, la cromatografia di proteine viene di norma condotta con la
tecnica HPLC (High Pressare Liquid Chromatography) impiegando un fase stazionaria
apolare (di norma resine o silice come supporto rivestite di molecole alifatiche a 4, 8 o 18
atomi di carbonio con o senza presenza di doppi legami). Una tipica fase stazionaria
inversa è la C18 alchene legata a microsfere silicee di 5 µm di dimetro, nota anche come
Octa-Decyl-Silane 2 - ODS2). Nel caso dell’analisi delle proteine del latte, in letteratura
sono riportate altre tecniche cromatografiche d’analisi come il metodo ottimizzato da
Bramanti et al. (2003) che sfrutta la capacità separativa di particolari colonne con fase
37
stazionaria parzialmente idrofobia (es. Propyl HIC, 10 x 4,6 cm, 6,5 µm – 300 Å) e fase
mobile a forza ionica decrescente in gradiente d’eluizione (Hydrophobic Interaction
Chromatography – HIC). Sebbene questo tipo di tecnica offra buoni risultati con minimo
pre-trattamento del campione, l’impiego di tamponi ad elevata forza ionica e ad elevata
concentrazione di urea (8,0 M), rende l’approccio problematico da un lato per la
preparazione dei tamponi (filtrazione e dagasaggio) e soprattutto, dall’altro, per le
complicazioni che insorgono con l’impiego in HPLC di tali tamponi che richiedono
un’attenzione esecutiva e piani di manutenzione particolarmente impegnativi e gravosi.
D’atro canto, le tecniche a fase inversa, che impiegano fasi mobili più semplici e meno
“aggressive” per le parti in movimento (valvole e pompe) e per le colonne, sono state con
successo impiegate per l’analisi delle frazioni caseiniche e per le proteine del siero.
Per la specifica applicazione al presente programma di ricerca, al fine di valutare lo studio
della variabilità delle frazioni caseiniche in campioni di latte di pecora, è stato messo a
punto un metodo con determinazione in RP-HPLC e fluorimetria, adattando il protocollo già
sviluppato da Viesser e collaboratori (1986). Nella presente sperimenatazione, pertanto, si
è preferito rivolgerci a tali tecniche per il loro grado di risoluzione e per la semplicità di
gestione del sistema pompa-colonna dell’apparato HPLC:
Il metodo prevede due fasi principali (Viesser et al., 1986):
•
preparazione delle caseine (pretarattamento del campione);
•
analisi cromatografia per RP-HPLC con rivelazion UV o fluorimetrica.
Pretrattamento del campione
Per la preparazione delle caseine, il campione di latte viene sgrassato per centrifugazione
a 3500 rpm alla temperatura di 4°C per 10 min’. Dopo lo sgrassaggio, il campione
preventivamente diluito 1:2 con acqua distillata, viene sottoposto ad acidificazione con
l’aggiunta di acido acetico glaciale al 10% v/v fino a pH 4,6 (ca. 9 ml di acido per 50 ml di
latte).
In seguito all’acidificazione si osserva la precipitazione delle caseine. Per agevolare le fasi
successive di trattamento del campione, la procedura viene eseguita entro tubi da 10 ml in
polietilene come segue:
38
1. a 3 ml di latte sgrassato vengono aggiunti 3 ml d’acqua, ca. 0,7 g di glass beds
(diametro nominale: 2 mm) e 0,5 ml di acido acetico al 10%;
2. il campione viene centrifugato a 1500 rpm per 3 min’ e, dopo aver scartato il
surnatante, vengono aggiunti 5 ml d’acqua distillata tiepida (ca. 40-50°C);
3. al vortex viene spappolato e ri-sospeso il coagulo e nuovamente centrifugato a
1500 rpm per 3 min’;
4. eliminato il surnatante si procede ad effettuare due lavaggi come sopra (punti 2 e
3) con 5 ml di etanolo, due lavaggi con 5 ml acetone e due lavaggi con 5 ml di
etere di petrolio;
5. al termine della procedura di purificazione, il campione viene essiccato sotto azoto a
40°C fino a completa eliminazione dell’etere (caseine inodori).
Per la preparazione delle caseine e l’analisi in RP-HPLC sono necessari i seguenti tamponi
e solventi:
Solventi per HPLC
MetCN (HPLC, Gradient Grade); H2O (ASTM Type I); TFA 1% in H2O
Tampone bis-tris propane
0,5646 g di BIS-TRIS-PROPANE (Sigma) vengono pesati e posti in un
matraccio da 100 ml con 24 g d’Urea e 0,24 ml di β-mercaptoetanolo. Si
porta a volume con acqua ultrapura e si aggiusta il pH a 7.0 con HCl (37%)
Tampone Urea 8 M
24 g d’Urea vengono pesati in matraccio da 50 ml portando a volume con
miscela MetCN/H2O/TFA (9,95:89,95:0,1) (90:10 + TFA 0,1%), e filtrati su
microfibra o filtri a membrana da 0,45 µm
Preparazione del campione purificato
Dieci grammi di caseine sono pesati entro tubi da 15 ml (falcon) e disciolti in 2 ml di
tampone BIS-TRIS-PROPANE, vortexando per 1-2 min’ fino a completamento dissoluzione
delle caseine. Si lascia riposare per 40-60 min’ e quindi si aggiungono 8 ml di TAMPONE
UREA 8M. Infine 5 µl vengono iniettati in HPLC e la detezione dei picchi è ottenuta per
confronto con i tempi di ritenzione di standard commerciali di α-, β- e k-caseina bovina
(Sigma-Aldrich, Germany)
39
Sistema cromatografico e settaggi
Il sistema HPLC impiegato per l’analisi delle frazioni caseiniche nel latte ovino, pretrattato
come sopra riportato, è così composto e settato come segue:
•
Dispositivo di degasaggio dei solventi per la fase mobile: Thermo Finnigan Vaccum
Degaser
•
Pompa quaternaria a gradiente: ThermoFinnigan Spectrasystem P4000
•
Colonna separativa: Vydac C18 25 cm, 5 µm, 4,6 mmID 300 Å Cod 218TP54 (con
blocco filtro precolonna da 0,2 µm)
•
Solventi: H2O, MetCN e TFA 1% (tutti di grado gradiente per HPLC o equivalenti,
Sigma, Germany)
•
Programmazione del gradiente: MetCN/H2O/TFA1% da 32:48:20 fino a 44:36:20 in
17,4 min’, poi fino a 60:20:20 in 5 min’ e quindi ritorno alla fase iniziale a in 9,5
min’. Durata della corsa: 32 min’.
•
Fluorimetro: ThermoFinnigan Spectrasystem FL3000; λex=280 nm, λem=364 nm
•
Autocampionatore con settaggi tray/forno: Ttray = 4°C; Toven = 28°C
•
Software di gestione e calcolo: ChromQuest 3.0
4.2.4 Metodo per la produzione della γ-caseina
Per la preparazione della frazione γ-caseinica si procede come delineato in Urech et al.
(1998). Il metodo prevede l’idrolisi mediata da plasmina (PL) secondo il seguente schema
di reazione:
•
α-cas: 20 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A
questo sono aggiunti 900 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino
alla parziale dissoluzione dello standard. Si aggiungono 100 µl di plasmina [1
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato
per 18 ore a 37°C.
•
β-cas: 10 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A
questo sono aggiunti 900 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino
alla parziale dissoluzione dello standard. Si aggiungono 100 µl di plasmina [1
40
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato
per 18 ore a 37°C.
•
k-cas: 3,8 mg sono posti entro microtubo da 2.0 ml con 0.5 g di glass beads. A
questo sono aggiunti 200 µl di NaCl 0,85%(p/v). Si vortexa per alcuni minuti fino
alla parziale dissoluzione dello standard. Si aggiungono 800 µl di plasmina [1
µgPL/ml in NaCl 0,85% (p/v)] e si vortexa nuovamente. Il preparato viene incubato
per 18 ore a 37°C.
Dopo l’incubazione i tre preparati per la γ-cas sono equalizzati a 3,8 mg cas equivalenti
(titolo nominale della k-cas prima dell’idrolisi) portando 190 µl e 380 µl degli idrolizzati
rispettivamente per l’α-cas e la β-cas a 1000 µl con NaCl 0,85% (p/v).
200 µl di idrolizzato della k-cas, degli idrolizzati diluiti dell’α-cas e della β-cas, 200 µl di
PL (1mg/ml) preventivamente diluita ½ con NaCl 0,85% (p/v) e 200 µl di NaCl 0,85%
(p/v) sono posti in vials da HPLC, essiccati in debole corrente d’azoto a 37°C e quindi
risospesi 200 µl di tampone bis-tri-propane. Dopo 45 min’ d’incubazione si aggiungono
800µl di tampone Urea 8 M. Il volume d’iniezione, per mantenere la comparabilità con
la normale procedura d’analisi delle caseine (compresi gli standard commerciali alla
concentrazione d’iniezione di 1mg/ml), dovrà essere pari a:
5*5/3,8= 6,6 µl
4.3. Risultati e discussioni
Sualla scorta d’informazioni relative allo stato di salute della mammella ottenuti dall’Istituto
Zooprofilattico Sperimentale per le Ragioni Lazio e Toscana – Centro Latte, sono stati
selezionati campioni di latte d’emimamella su cui effettuare lo screening cromatografico
per le frazioni caseiniche.
Per la valutazione della composizione percentuale delle frazioni caseiniche, s’è ricorso
all’analisi della risposta strumentale (fluorimetro) per le frazioni commerciali assumendo
analogo comportamento per le omonime frazioni del latte di pecora. Per tale motivo sono
41
stati analizzati standard cromatografici a titolo noto (1 mg/ml per le tre frazioni
commerciali αsx-, β- e κ-caseina) e per ogni frazione è stato determinato il valore della
risposta strumentale rispetto alla frazione con risposta maggiore (area somma dei picchi
cromatografici, valore maggiore):
β-caseina = 0,50
κ-caseina = 0,78
α-caseina = 1,00
Nella tabella successiva (Tab. 21) sono riportati, in percentuale, i contenuti per le diverse
frazioni caseiniche nei campioni di latte ovino mentre in Tabella 22 sono riportate le
statistiche di base.
In termini percentuali, le frazioni caseiniche mediamente riscontrate nella popolazione
campionaria saggiata, risultano in linea con quanto riportato in letteratura (cfr. ad es.
l’esauriente rassegna in Bramanti et al., 2003).
Tuttavia è da osservare come nei
campioni saggiati sia risultata mediamente più elevata la presenza della frazione αs2
rispetto a quanto riportato in letteratura e mediamente inferiore, invece, il contenuto in κcaseina. Per questa componente caseinica, inoltre, la variabilità (CV%= 39,5) è risultata
sensibilmente superiore alle altre frazioni a denotare probabilmente una maggiore
dipendenza di tale frazione da condizioni quali, ad esempio, lo stato fisiologico della
mammella e dell’individuo.
In relazione alla k-caseina, va detto che proprio tale frazione risulta particolarmente
suscettibile all’azione enzimatica indotta dal complesso plasmina-plaminogeno e che da
tale azione ne risulta la formazione della frazione γ-cas, la cui presenza nei
cromatogrammi acquisiti è tutt’ora in fase di accertamento. La presenza di questa
componente, in quantità variabili da campione a campione, potrebbe giustificare il
minorre contenuto medio della κ-cas rispetto a quanto rinvenuto in letteratura e
soprattutto può contribuire a definire un plausibile quadro di riferimento per la casistica
minus-variante.
42
Nel tentativo di indiduare eventuali fattori il cui effetto si esplica nel diverso assortimento
delle frazioni caseiniche, su dati è stata condotta l’analisi della varianza per testare i
seguenti fattori:
1) mese di campionamento; febbraio, marzo, aprile, maggio, giugno;
2) ordine di parto;
3) salute della mammella: positiva ai patogeni e negativa;
4) contenuto in cellule somatiche: <500.000 e >1.000.000
Nelle successive Figg. 14-16 sono riportati i grafici ottenuti attraverso l’impiego del
pacchetto Statistica 6.0 (StatSoft Inc.).
L’analisi statistica ha consentito di evidenziare una riduzione della frazione corrispondente
alla k-cas con il procedere della lattazione a vantaggio delle frazioni αs2 ed αs1. Va detto
che all’aumento della feazione αs1 (fig. 17) corrisponde, molto probabilmente, anche
l’aumento
di
prodotti
di
degradazione
43
(γ-cas
e
PP)
che
coeluiscono.
Tabella 21 - Dati dell’analisi cromatoagrafica per le frazioni caseiniche del latte di pecora. Titolo nominale del purificato all’iniezione: 1000±50 µg/ml.
Concentrazione corretta per la risposta strumentale
(µg/ml all’iniezione)
Area % (Fluorimetro)
Caso Progr.
7
13
3
6
10
19
2
4
8
15
4
8
3
5
7
14
4
7
1
2
18
35
18
36
14
27
15
29
21
42
15
30
14
28
16
31
12
23
10
20
24
47
23
46
20
39
24
48
26
51
28
55
25
49
23
45
25
50
28
56
29
58
10
19
1
2
1
1
Matricola col_odp Emim.
A097823
VERDE
sx
VG354 ROSSO
dx
A098530
BLU
sx
VG359
BLU
dx
A0144325
BLU
sx
VG313 ROSSO
dx
VG354 ROSSO
sx
A097823
VERDE
dx
VG313 ROSSO
sx
MA2261
VERDE
dx
A097678
VERDE
sx
A097678
VERDE
dx
933487 ROSSO
sx
996582 ROSSO
sx
A0191248 ROSSO
dx
996582 ROSSO
dx
933487 ROSSO
dx
MA2251
VERDE
sx
A0144267
VERDE
sx
A098530
BLU
dx
A0227634
VERDE
sx
822715 ROSSO
dx
GR113
VERDE
sx
A0227634
VERDE
dx
VG031 ROSSO
sx
A098527
BLU
sx
A0227467
BLU
sx
822715 ROSSO
sx
A0227467
BLU
dx
A098527
BLU
dx
VG465
VERDE
dx
A097678
VERDE
sx
A0227634
VERDE
dx
A0227634
VERDE
sx
κ
9,3
8,9
10,8
11,0
8,3
8,4
8,1
8,8
6,2
10,0
8,4
9,7
7,9
9,2
9,1
10,3
10,4
8,8
8,3
7,0
5,3
11,9
9,6
10,5
5,0
8,4
7,4
9,4
8,4
7,8
10,5
8,1
7,7
9,9
αs2
19,8
16,0
18,1
19,6
15,6
17,3
17,3
18,2
15,5
15,2
16,5
16,1
15,4
14,1
14,3
16,1
15,0
20,2
22,5
17,0
17,6
20,2
20,7
16,7
18,8
19,7
15,8
16,6
18,1
20,9
15,6
10,1
10,1
17,3
αs1
12,8
24,4
11,2
10,4
35,7
24,0
40,0
12,5
49,6
11,3
8,9
12,1
30,2
29,7
39,2
32,6
32,2
32,2
34,6
10,8
35,9
7,6
6,8
33,2
6,6
7,2
35,7
33,7
36,3
9,9
8,5
12,0
23,1
8,4
β
15,2
15,1
14,2
15,0
13,7
13,3
15,4
14,8
13,6
21,2
17,3
20,3
11,4
13,9
16,5
9,5
15,9
11,5
14,6
14,4
14,9
15,8
22,0
14,8
15,9
14,9
15,1
13,7
14,1
12,0
14,5
17,8
13,9
14,5
tot
57,1
64,4
54,3
56,0
73,3
63,0
80,8
54,3
84,9
57,7
51,1
58,2
64,9
66,9
79,1
68,5
73,5
72,7
80,0
49,2
73,7
55,5
59,1
75,2
46,3
50,2
74,0
73,4
76,9
50,6
49,1
48,0
54,8
50,1
44
κ
119
114
138
141
106
108
104
113
79
128
108
124
101
118
117
132
133
113
106
90
68
153
123
135
64
108
95
121
108
100
135
104
99
127
αs2
198
160
181
196
156
173
173
182
155
152
165
161
154
141
143
161
150
202
225
170
176
202
207
167
188
197
158
166
181
209
156
101
101
173
αs1
128
244
112
104
357
240
400
125
496
113
89
121
302
297
392
326
322
322
346
108
359
76
68
332
66
72
357
337
363
99
85
120
231
84
β
304
302
284
300
274
266
308
296
272
424
346
406
228
278
330
190
318
230
292
288
298
316
440
296
318
298
302
274
282
240
290
356
278
290
tot
749
820
715
741
893
787
985
716
1002
817
708
812
785
834
982
809
923
867
969
656
901
747
838
930
636
675
912
898
934
648
666
681
709
674
Concentrazione relativa %
κ
16%
14%
19%
19%
12%
14%
11%
16%
8%
16%
15%
15%
13%
14%
12%
16%
14%
13%
11%
14%
8%
20%
15%
14%
10%
16%
10%
13%
12%
15%
20%
15%
14%
19%
αs2
26%
20%
25%
26%
17%
22%
18%
25%
15%
19%
23%
20%
20%
17%
15%
20%
16%
23%
23%
26%
20%
27%
25%
18%
30%
29%
17%
18%
19%
32%
23%
15%
14%
26%
αs1
17%
30%
16%
14%
40%
31%
41%
17%
49%
14%
13%
15%
38%
36%
40%
40%
35%
37%
36%
16%
40%
10%
8%
36%
10%
11%
39%
38%
39%
15%
13%
18%
33%
12%
β
41%
37%
40%
40%
31%
34%
31%
41%
27%
52%
49%
50%
29%
33%
34%
23%
34%
27%
30%
44%
33%
42%
53%
32%
50%
44%
33%
31%
30%
37%
44%
52%
39%
43%
2
8
9
8
22
22
10
3
29
28
27
27
13
17
15
13
30
27
22
22
14
15
17
1
1
2
24
27
21
3
24
25
2
3
9
29
13
2
4
15
17
16
43
44
20
6
57
56
54
53
26
33
30
25
60
54
43
44
27
29
34
2
1
3
47
53
41
6
48
49
3
5
18
58
26
4
A098530
MA2251
A098636
MA2251
A098527
A098527
A097678
A0144311
A0227382
A098522
A0227467
A0227467
VG354
A097823
A0191248
VG354
A098527
933526
822715
822715
A097678
A0191248
A097823
VG313
VG313
VG359
VG031
A098527
A0191388
VG359
VG031
A098522
VG465
VG359
MA2251
VG313
MA2254
VG465
BLU
VERDE
ROSSO
VERDE
BLU
BLU
VERDE
BLU
BLU
BLU
BLU
BLU
ROSSO
VERDE
ROSSO
ROSSO
BLU
ROSSO
ROSSO
ROSSO
VERDE
ROSSO
VERDE
ROSSO
ROSSO
BLU
ROSSO
BLU
BLU
BLU
ROSSO
BLU
VERDE
BLU
VERDE
ROSSO
VERDE
VERDE
dx
sx
sx
dx
sx
dx
dx
dx
sx
dx
dx
sx
dx
sx
dx
sx
dx
dx
sx
dx
sx
sx
dx
dx
sx
sx
sx
sx
sx
dx
dx
sx
sx
sx
dx
dx
dx
dx
10,4
7,1
6,5
8,9
5,8
8,8
7,8
7,0
7,0
6,6
7,7
5,3
6,4
7,3
5,8
6,7
5,0
9,0
8,2
9,0
7,6
8,3
8,5
7,5
6,8
7,6
6,5
6,6
6,5
6,4
8,6
10,3
8,0
5,3
8,4
3,4
7,0
6,9
13,0
9,9
12,2
23,8
11,1
13,4
13,6
9,1
9,5
8,6
15,5
7,5
8,0
10,2
9,2
7,5
14,0
15,5
13,1
14,6
11,4
10,3
10,3
11,3
11,2
12,6
22,0
22,8
24,1
21,5
20,7
17,5
25,1
23,4
25,5
23,8
21,5
24,2
9,9
6,3
28,5
34,7
29,0
27,7
28,7
25,0
20,5
20,5
27,1
8,3
21,0
21,4
27,2
17,4
27,1
20,2
20,5
22,4
22,8
22,3
21,9
22,7
21,2
18,8
31,7
38,0
27,9
29,2
36,4
32,1
33,6
31,7
34,6
31,8
33,3
34,5
32,4
46,0
16,4
18,0
16,4
34,5
19,9
20,3
17,5
14,6
15,4
12,0
16,6
17,1
15,0
15,0
15,0
16,6
24,3
17,5
18,0
17,4
16,2
15,0
14,7
16,1
17,9
18,2
10,6
16,9
15,1
14,8
18,8
19,0
16,8
14,8
22,2
20,7
65,7
69,3
63,6
85,4
62,3
84,4
70,0
61,4
54,5
50,3
65,7
33,1
52,0
56,0
42,2
46,6
61,1
44,7
66,1
46,0
59,8
58,3
56,9
41,5
53,9
55,1
78,1
85,6
69,1
74,0
80,8
74,7
85,5
79,4
85,3
73,8
84,0
86,3
45
133
91
83
114
74
113
100
90
90
85
99
68
82
94
74
86
64
115
105
115
97
106
109
96
87
97
83
85
83
82
110
132
103
68
108
44
90
88
130
99
122
238
111
134
136
91
95
86
155
75
80
102
92
75
140
155
131
146
114
103
103
113
112
126
220
228
241
215
207
175
251
234
255
238
215
242
99
63
285
347
290
277
287
250
205
205
271
83
210
214
272
174
271
202
205
224
228
223
219
227
212
188
317
380
279
292
364
321
336
317
346
318
333
345
648
920
328
360
328
690
398
406
350
292
308
240
332
342
300
300
300
332
486
350
360
348
324
300
294
322
358
364
212
338
302
296
376
380
336
296
444
414
1010
1173
818
1059
803
1214
921
837
740
668
833
466
704
752
438
635
775
472
927
485
799
780
755
436
705
733
978
1057
815
927
983
924
1066
999
1045
896
1082
1089
13%
8%
10%
11%
9%
9%
11%
11%
12%
13%
12%
15%
12%
12%
17%
14%
8%
24%
11%
24%
12%
14%
14%
22%
12%
13%
9%
8%
10%
9%
11%
14%
10%
7%
10%
5%
8%
8%
13%
8%
15%
22%
14%
11%
15%
11%
13%
13%
19%
16%
11%
14%
21%
12%
18%
33%
14%
30%
14%
13%
14%
26%
16%
17%
22%
22%
30%
23%
21%
19%
24%
23%
24%
27%
20%
22%
10%
5%
35%
33%
36%
23%
31%
30%
28%
31%
33%
18%
30%
28%
62%
27%
35%
43%
22%
46%
29%
29%
29%
52%
30%
26%
32%
36%
34%
31%
37%
35%
32%
32%
33%
36%
31%
32%
64%
78%
40%
34%
41%
57%
43%
49%
47%
44%
37%
52%
47%
46%
0%
47%
39%
0%
52%
0%
45%
45%
43%
0%
42%
44%
37%
34%
26%
36%
31%
32%
35%
38%
32%
33%
41%
38%
18
4
18
19
10
29
14
13
27
1
22
16
3
26
12
29
29
26
10
1
10
27
16
12
27
14
20
28
22
5
5
36
7
35
37
20
57
28
25
54
2
43
31
5
52
24
57
58
51
20
1
19
53
32
23
54
27
40
56
44
10
9
933487
A0191248
933487
MA2290
822715
VG313
A0143509
MA2253
A098527
VG465
VG313
A098530
MA2251
VG359
A0191388
933526
933526
VG359
VG354
VG465
VG354
A0227634
A098530
A0191388
A0227634
A0191248
822715
A098527
VG313
996582
996582
ROSSO
ROSSO
ROSSO
VERDE
ROSSO
ROSSO
BLU
VERDE
BLU
VERDE
ROSSO
BLU
VERDE
BLU
BLU
ROSSO
ROSSO
BLU
ROSSO
VERDE
ROSSO
VERDE
BLU
BLU
VERDE
ROSSO
ROSSO
BLU
ROSSO
ROSSO
ROSSO
dx
sx
sx
sx
dx
sx
dx
sx
dx
dx
sx
sx
sx
dx
dx
sx
dx
sx
dx
sx
sx
sx
dx
sx
dx
sx
dx
dx
dx
dx
sx
6,0
7,6
2,6
6,3
6,6
6,8
7,5
8,0
9,6
10,6
5,1
5,3
6,0
7,7
3,7
6,1
9,4
5,2
4,8
4,8
3,4
5,3
6,1
3,8
5,1
1,2
5,6
3,6
3,2
4,2
3,3
23,1
22,3
25,0
24,4
23,8
24,4
23,5
22,3
25,0
19,5
20,8
24,3
21,7
24,6
24,3
29,0
25,5
27,3
21,7
23,8
22,8
18,4
26,6
23,5
20,7
19,1
27,3
24,7
19,9
21,8
30,5
33,3
33,0
22,5
34,6
31,8
18,8
31,8
34,3
35,5
41,9
28,9
43,8
40,2
31,2
44,5
33,1
32,1
35,6
44,2
35,5
42,8
37,9
37,9
44,2
38,5
47,7
33,1
36,2
42,3
41,8
34,6
18,0
18,8
16,2
21,3
3,6
16,4
13,3
17,5
19,0
18,0
19,1
14,0
15,8
16,2
15,1
16,5
2,4
16,8
19,0
13,9
18,9
21,0
13,7
17,8
21,7
19,1
18,3
18,9
16,6
16,0
15,0
80,4
81,7
66,3
86,6
65,8
66,4
76,1
82,1
89,1
90,0
73,9
87,4
83,7
79,7
87,6
84,7
69,4
84,9
89,7
78,0
87,9
82,6
84,3
89,3
86,0
87,1
84,3
83,4
82,0
83,8
83,4
46
77
97
33
81
85
87
96
103
123
136
65
68
77
99
47
78
121
67
62
62
44
68
78
49
65
15
72
46
41
54
42
231
223
250
244
238
244
235
223
250
195
208
243
217
246
243
290
255
273
217
238
228
184
266
235
207
191
273
247
199
218
305
333
330
225
346
318
188
318
343
355
419
289
438
402
312
445
331
321
356
442
355
428
379
379
442
385
477
331
362
423
418
346
360
376
324
426
72
328
266
350
380
360
382
280
316
324
302
330
48
336
380
278
378
420
274
356
434
382
366
378
332
320
300
1001
1026
832
1097
713
847
915
1019
1108
1110
944
1029
1012
981
1037
1029
745
1032
1101
933
1078
1051
997
1082
1091
1065
1042
1033
995
1010
993
8%
9%
4%
7%
12%
10%
11%
10%
11%
12%
7%
7%
8%
10%
5%
8%
16%
6%
6%
7%
4%
6%
8%
5%
6%
1%
7%
4%
4%
5%
4%
23%
22%
30%
22%
33%
29%
26%
22%
23%
18%
22%
24%
21%
25%
23%
28%
34%
26%
20%
26%
21%
18%
27%
22%
19%
18%
26%
24%
20%
22%
31%
33%
32%
27%
32%
45%
22%
35%
34%
32%
38%
31%
43%
40%
32%
43%
32%
43%
35%
40%
38%
40%
36%
38%
41%
35%
45%
32%
35%
43%
41%
35%
36%
37%
39%
39%
10%
39%
29%
34%
34%
32%
40%
27%
31%
33%
29%
32%
6%
33%
35%
30%
35%
40%
27%
33%
40%
36%
35%
37%
33%
32%
30%
Tabella 22 – Statistiche di base delle frazioni caseiniche dei campioni di emimammella saggiati
Concentrazione corretta per la risposta
strumentale (µg/ml all’iniezione)
κ
αs2
αs1
Concentrazione relativa (%)
β
Tot.
κ
αs2
αs1
β
Media
93,3
183,3 276,8
322,0
875,4
11,3%
21,1%
31,3%
36,3%
DS
26,8
54,7
109,0
117,7
169,4
4,5%
5,6%
10,4%
11,8%
SDR%
29%
30%
39%
37%
19%
39,5%
26,3%
33,3%
32,5%
63,0
Min
15,4
75,0
0,0
436,2
1,4%
8,4%
5,4%
0,0%
Max
152,6
305,0 496,0
920,0
1213,8
24,4%
34,3%
62,0%
78,4%
Mediana
96,2
184,0 312,0
320,0
900,9
11,1%
21,6%
32,6%
36,5%
25* p.le
76,9
144,5 207,5
290
747,9
7,9%
17,4%
28,1%
31,9%
75° p.le
112,8
229,5
360
1011,1
14,0%
25,2%
37,9%
42,6%
351
Figura 14 – Effetto del mese di campinamento e dell’ordine di parto sul valore della k:caseina nel latte ovino
P<0,05 ABC P<0,01.
MESE; LS Means
Current effect: F(4, 96)=30,428, p=,00000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,16
0,15
0,14
aA
abA
0,13
k-cas%
0,12
bA
0,11
0,10
C
0,09
0,08
0,07
0,06
D
0,05
0,04
feb
marzo
aprile
maggio
giugno
MESE
ODP; LS Means
Current effect: F(2, 96)=1,9005, p=,15507
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,130
0,125
0,120
a
0,115
k-cas%
abc
0,110
a
0,105
a
0,100
0,095
0,090
0,085
I
II-III
ODP
47
>III
Figura 15 – Effetto del mese di campionamento e dell’Ordine di Parto sulla percentuale di αs2 caseina nel latte ovino
P<0,05 ABC P<0,01.
MESE; LS Means
Current effect: F(4, 96)=22,710, p=,00000
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,28
0,26
aA
aA
0,24
as2-cas %
0,22
aA
0,20
0,18
bB
0,16
0,14
bB
0,12
0,10
feb
marzo
aprile
maggio
giugno
MESE
ODP; LS Means
Current effect: F(2, 96)=,88542, p=,41588
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,23
0,22
0,21
as2-cas %
abc
aA
0,20
aA
aA
0,19
0,18
0,17
I
II-III
ODP
48
>III
Figura 16 – Effetto del mese di campionamento e dell’Ordine di Parto sulla percentuale di αs2 caseina nel latte ovino
abc
P<0,05 ABC P<0,01.
MESE; LS Means
0,44
0,42
0,40
0,38
0,36
A
as1-cas %
0,34
AB
0,32
0,30
C
BC
0,28
C
0,26
0,24
0,22
0,20
0,18
feb
marzo
aprile
maggio
giugno
MESE
ODP; LS Means
Current effect: F(2, 96)=2,1888, p=,11761
Effective hypothesis decomposition
Vertical bars denote 0,95 confidence intervals
0,36
0,34
as1-cas %
0,32
A
B
B
0,30
0,28
0,26
0,24
0,22
I
II-III
>III
ODP
L’analisi elettroforetica delle singole frazioni HPLC raccolte è illustrata nella successiva Fig.
17.
49
Figura 17 – analisi elettroforetica dell frazioni caseiniche isolate per HPLC effettuata su due campioni di latte ovino
relativa ai mesi di marzo (cromatogramma a sinistra) e giugno (cromatogramma a destra).
Dei due campioni saggiati, il cromatogramma del primo campione (marzo) è risultato
nettamente migliore rispetto al secondo (mese di giugno) nel quale i picchi risultano poco
risolti rispetto alla linea di base.
Per quanto riguarda la frazione f1 (tempo d’eluizione
caratteristico della κ-cas nelle condizioni cromatografiche utilizzate) l’elettroforesi mostra
una sola banda evidente per entrambi i campioni (B17 e B19) con, tuttavia, differenze per
quanto riguarda il peso molecolare. Per quanto riguarda invece le due frazioni f2 ed f3
(corrispondenti rispettivamente alle frazioni αs2 ed αs1-cas) i pattern elettroforetici appaio
relativamente differenti solo per la frazione αs2 che presenta due bande ravvicinate ma
comunque con peso molecolare superiore a 30 kDa per il campione B17 e due bande
caratterizzate da una migrazione elettroforetica nettamente differente per il campione B19
dove compare una banda a meno di 20,1 kDa che potrebbe rappresentare un prodotto di
50
degradazione (ad es. γ1-cas). Stessa valutazione può essere fatta per la quarta frazione
(fl4) che analizzata elettroforeticamente produce nel campione B17 due bande distinte di
cui una a meno di 14,4 kDa (peso molecolare compatibile con i proteoso peptoni) mentre
nel campione B19 si osserva una sola banda attorno a 30 kDa.
In conclusione si può affermare che una certa variabilità nella composizione in frazioni
caseiniche è osservabile nel latte ovino in base al periodo della lattazione ed all’ordine di
parte. Tali variazioni tendono a ridurre percentualmente soprattutto la frazione k-caseinica
con un aumento dell’alfa caseina, con prbabili effetti diretti ed indiretti sulle caratteristiche
reologiche. E’ probabile che diversi fattori concorrano a tale variazione, alcuni dei quali (ad
esempio il management aziendale) dovranno essere attentamente valutati in occasione di
ulteriori studi.
51
4.
VALUTAZIONE DELLA QUALITA’ DEL LATTE DI BUFALA
3.1. Messa a punto conta differenziata cellule somatiche
E’ stata affinata la messa a punto di metodi già in uso presso il laboratorio (conta
differenziata delle cellule somatiche) confrontando i risultati dell’utilizzo di diversi tipi di
colorazione. Inoltre, è stata curata la messa a punto di nuovi metodi (attività genetica).
3.1.1. Metodo conta differenziata cellule somatiche
Le diverse classi di cellule somatiche nel latte si evidenziano mediante osservazione
microscopica di strisci sottili, colorati, comunemente , secondo la metodica di MayGrunwald
o di Wright. Si tratta di colorazioni
“panottiche”, basate, entrambe,
sulla
reazione di Sali di Eosina/Blu di Metilene con i vari costituenti acidi e basici delle cellule
stesse (detti pertanto acidofili, basofili, policromatofili). Dette colorazioni consentono di
distinguere con chiarezza sia le diverse classi di granulociti (cellule polinucleate), sia i
linfociti (cellule mononucleate). Inequivocabili e oramai universalmente accettati, infatti,
sono i parametri per il loro riconoscimento, basati su caratteristiche tintoriali e morfologiche
ben evidenziabili con le metodiche di colorazione suddette. D’altro canto, tali cellule del
bufalo non si differenziano molto da quelle analoghe, presenti nel sangue umano, per le
quali la conoscenza e la pratica di laboratorio sono consolidate da anni.
Granulociti Neutrofili
Nucleo plurilobato, citoplasma rosato con granulazioni rosa-lilla. Il nome è dato dal fatto che i
granuli hanno affinità per i Sali neutri (esempio eosinato di blu di metilene, Fig. 18).
Figura 18 – Granulociti neutrofili. Immagini acquisite presso i laboratori del CRA-ISZ.
52
Granulociti Eosinofili
Polinucleati, con granuli citoplasmatici giallo-arancione ( affinità per l’eosina, Fig. 19).
Figura 19 – Granulociti eosinofili. Immagine
acquisita presso i laboratori del CRA-ISZ.
Linfociti
Cellule rotonde, dimetro 7-9-micron, nucleo intensamente colorato, con cromatina a volte a zolle,
citoplasma scarsissimo (Fig. 20).
Figura 20 – Linfociti. Immagini acquisite presso i laboratori del CRA-ISZ.
Diverso è il caso, invece delle ultime due classi di cellule somatiche del latte bufalino: il macrofagi e
le cellule epiteli. I dati esistenti in bibliografia per queste due ultime linee cellulari nel bufalo sono
molto contraddittori e la loro morfologia è scarsamente descritta in letteratura. Nel nostro lavoro
abbiamo fatto riferimento alla pubblicazione che ci è sembrata più completa in ordine alla
descrizione morfologica delle cellule: Guarino et al. (1994), Valutazione quali-quantitativa delle
cellule presenti nel latte di bufala, Atti della Società italiana delle scienze veterinarie , Volume XLVI
In essa si afferma che i macrofagi rappresentano la grande maggioranza delle cellule somatiche del
latte sano di bufala nelle diverse fasi della lattazione. Essi sono descritti come cellule di diversi
aspetti morfologici, soprattutto del citoplasma:
53
•
aspetto schiumoso : molteplici goccioline di grasso nel citoplasma;
•
aspetto ad anelo con castone: i globuli di grasso confluiscono in una cavità unica: il
citoplasma è molto ridotto ed anche il nucleo di distingue difficilmente;
•
aspetto semplice: cellule prive di inclusioni lipidiche, con nucleo reniforme e
citoplasma di colore azzurro chiaro.
Figura 21 – Macrofagi nel latte. Immagini acquisite presso i laboratori del CRA-ISZ.
Per quanto riguarda le cellule epiteliali, esse sono descritte di forma ovale, circolare o poligonale, a
limiti netti; citoplasma rosato, diametro 14-18 µm. Isolate o in gruppi di 2 o 3, nucleo centrale e
sferico. Si esclude, quindi, la presenza di vacuoli nel citoplasma.
L’evidenza scaturita dalle analisi effettuate, tuttavia, non concorda perfettamente con quella
sopradescritta. Si rilevano infatti, quali cellule epiteliali, cellule analoghe a quelle descritte nel lavoro
suddetto, ma con citoplasma vacuolato, nucleo non centrale, sempre isoalte e mai in gruppi.
Cellule di tale specie, inoltre, si presentano in quantità assolutamente ridotta.
Le loro caratteristiche non sono spiccatamente dissimili da quelle dei macrofagi, con possibilità di
essere classificate facilmente come tali. In Figuta 22 è riportata un’immagine “tipo” di probabile
cellula epiteliale, rilevata nei nostri strisci di latte.
Figura 22 – Cellula epiteliale di bufala. Immagine
acquisita presso i laboratori del CRA-ISZ.
54
Per tale motivo s’è proceduto ad effettuare una colorazione citochimica, che si basa
sull’evidenziazione di esterasi specifiche presenti nel citoplasma dei macrofagi, ma non in quello
delle cellule epiteliali del latte. La colorazione utilizzata è quella che evidenzia l”α-naftil acetato
esterasi”, enzima presente in prevalenza nel citoplasma dei macrofagi. Il principio consiste nel
fornire il substrato specifico per l’esterasi (naftil-acetato) e un sale di diazonio; l’azione dell’esterasi
sul substrato libera naftolo, che, in presenza di sali di diazonio, precipita sotto forma di granuli neri.
L’intento era di verificare la presenza o l’assenza di granuli neri nelle cellule di tipologia dubbia.
La tecnica sperimentata ha dato risultati insufficienti alla risoluzione del problema (Fig. 23). La
colorazione, infatti, evidenzia con chiarezza la presenza di macrofagi per le granulazioni nere del
citoplasma; tuttavia (forse a causa di un trattamento che risulta più aggressivo) le restanti cellule
sono deformate, rotte, a volte con solo piccoli lembi di citoplasma, con difficoltà ad evidenziarne
l’esatta morfologia.
Figura 23 – Macrofagi nel latte alla colorazione selettiva per l’α-naftil acetato esterasi. Immagini acquisite presso i
laboratori del CRA-ISZ.
Per questo motivo, macrofagi e cellule epiteliali costituiscono un unico gruppo nelle nostre analisi.
Sulla tipologia delle cellule somatiche in bibliografia sono riportati dati contraddittori. Il tipo cellulare
dominante nel latte di bufala proveniente da mammelle sane sembra essere rappresentato dalle
cellule epiteliali per Dhakal & Kapur (1991) o dai neutrofili per Silva & Silva (1994) o dai macrofagi
secondo Guarino et al. (1994) o ancora dai linfociti seguiti immediatamente dai neutrofili (Piccinini
et al., 2006). In caso di mastite, invece, è stato sempre osservato un aumento della percentuale dei
neutrofili (Ranucci et al., 1988; Dhakal & Kapur, 1991; Guarino et al., 1994; Piccinini et al., 2006).
I risultati ottenuti, come illustrato nelle tabelle riportate successivamente confermano i risultati
ottenuti da Piccinini et al. (2006) e vale a dire che in caso di bufale non affette da mastite i linfociti
sono il gruppo più numeroso, seguito a poca distanza dai neutrofili. Se le mammelle sono ammalate
prevalgono i neutrofili.
55
3.2. Analisi di qualità del latte bufalino
3.2.1. Materiali e metodi
Individuazione allevamenti bufalini
Sono stati individuati gli allevamenti di bufali rispondenti alle esigenze della sperimentazione:
distribuzione delle aziende scelte su tutto il territorio della regione, per rispondere alla richiesta
d’elevata variabilità genetica e presenza di un elevato numero di bufale partorite nello stesso
periodo dell’anno.
Allo scopo, sono state scelte quattro aziende bufaline localizzate nelle province di Latina, Frosinone,
Viterbo e Rieti. I gruppi d’animali individuati per la prova, omogenei per stadio di lattazione e ordine
di parto, sono stati sottoposti a prelievo di sangue per l’estrazione del DNA (attività genetica) e a a
prelievi di latte a partire da 30±10 giorni di lattazione.
Tabella 23 – Parametri e metodiche impiegate per la valuta\zione del qualità del latte bufalino
Parametri
Metodiche
Grasso, proteina e lattosio
Infrarosso
Caseina
Kjeldhal
Urea
pHmetria differenziale
Acidità
pHmetria
Attitudine alla coagulazione
Lattodinamografia
Conta totale cellule somatiche
Metodo microscopico, citometria di flusso optofluoroelettronica e
metodo CCD camera
Conta
somatiche
differenziale
cellule
Metodo microscopico
Esame batteriologico
Metodo microbiologico e tipizzazione fenotipica
Cloruri
Metodo titrimetrico
Carica batterica totale
Citometria di flusso optofluoroelettronica
Piano sperimentale per la valutazione della qualità del latte bufalino
L’ndagine condotta presso quattro aziende bufaline (province di Frosinone, Latina, Rieti e Viterbo)
su gruppi di animali partoriti nell’arco di 38 giorni ha previsto:
tre controlli durante la lattazione di cui il primo a 30±9 giorni di lattazione, il secondo a a 113±9
giorni di lattazione ed il terzo controllo a 174±9 giorni dall’inizio della lattazione. Il prelievo è stato
effettuato durante la mungitura de del mattino ed è stata misurata la quantità di latte prodotto.
56
Analisi effettuate
Sui campioni di latte bufalino sono state effettute le seguenti determinazioni (Tab. 23) sono
indicati anche i metodi)
Le analisi chimico-fisiche, la carica batterica e la lattodinamografia sono state eseguite dall’ISZ in
collaborazione con il Laboratorio Standard Latte (LSL) dell’AIA, come previsto, la conta delle cellule
somatiche con il metodo optofluorometrico è stata effettuata dal LSL, mentre la conta microscopica
totale e quella differenziata sono state eseguite dall’ISZ. L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale
(IZS) ha effettuato l’analisi batteriologica per la ricerca dei microrganismi responsabili di patologie
della mammella.
3.2.2. Risultati
Nelle Tabelle 24 - 39, riportate di seguito, si possono osservare i risultati delle analisi effettuate.
Di seguito vengono riassunti sinteticamente i risultati ottenuti.
Stadio di lattazione
A fine lattazione, oltre alla diminuzione della produzione ed all’incremento del contenuto di grasso e
proteina, sono da evidenziare:
•
•
•
•
•
•
•
Diminuzione dell’indice di caseina, ma aumento del contenuto totale di caseina
Diminuzione del pH
Aumento della consistenza del coagulo
Incremento delle cellule somatiche
Non varia il contenuto di neutrofili
Leggero decremento del contenuto di lattosio
La positività agli agenti mastitogeni non è elevata (11%) e prevalgono i patogeni
Aziende
Elevata variabilità del contenuto di cellule somatiche che si ripercuote sulle caratteristiche del latte;
i tempi di coagulazione e di rassodamento del coagulo si allungano quando il contenuto di cellule
somatiche è elevato
In concomitanza del maggior numero di cellule somatiche si osserva anche la più elevata % di
neutrofili e la maggiore presenza di patogeni
57
Tabella 24 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).
Prelievo
N.
Giorni di
lattazione
Produzione
(mungitura
mattina, l)
Grasso (%)
Proteina (%)
Caseina (%)
Indice caseina
(%)
Lattosio (%)
resa stimata
mozzarella
( kg)
1°,2°,3°
140
102 ± 60
5,4 ± 2,0
7,47 ± 1,54
4,51 ± 0,42
3,62 ± 0,43
81,43 ± 4,31
4,78 ± 0,31
1,27 ± 0,42
1°
50
30 ± 9
6,5 ± 2,2
6,57 ± 1,10
4,47 ± 0,47
3,52 ± 0,58
81,16 ± 2,84
4,85 ± 0,23
1,45 ± 0,44
2°
46
113 ± 9
5,6 ± 1,6
7,53 ± 1,44
4,31 ± 0,32
3,58 ± 0,29
83,14 ± 2,99
4,88 ± 0,20
1,28 ± 0,43
3°
44
174 ± 9
3,9 ± 1,1
8,44 ± 1,50
4,74 ± 0,35
3,77 ± 0,38
79,54 ± 5,74
4,62 ± 0,40
1,03 ± 0,30
Tabella 25 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).
Esame
batteriologico
Prelievo
Cellule somatiche
(*103/ml)
(citometria di
flusso)
Cellule
somatiche
(*103/ml)
(microscopia)
Neutrofili (%)
Linfociti (%)
Macrofagi (%)
1°, 2°, 3°
259 ± 666
314 ± 717
49 ± 20
38 ± 18
13 ± 12
22
409 ± 646
1°
135 ± 345
218 ± 276
48 ± 22
38 ± 20
15 ± 12
34*
326 ± 397
2°
206 ± 426
195 ± 223
52 ± 20
37 ± 18
11 ± 9
18**
237 ± 298
3°
449 ± 1016
516 ±1143
46 ±19
39 ± 18
15 ± 13
11**
677 ± 972
*nel primo prelievo prevalgono gli agenti mastitogeni ambientali (~ 90%).
**nel secondo e terzo prelievo prevalgono gli agenti mastitogeni patogeni (~ 80%).
58
(% campioni
analizzati)
Carica batterica
totale
(ufc*103/ml)
Tabella 26 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Stadio di lattazione (medie ± deviazione standard).
Prelievo
pH
Tempo di
coagulazione
Tempo di
rassodamento
Consistenza
coagulo a 30'
Consistenza coagulo
al doppio di r
r (min)
k20 (min)
A30 (mm)
A2r (mm)
Urea
(mg/dl)
Indice
crioscopico (°C)
1°, 2°, 3°
6,67 ± 0,10
20,64 ± 6,01
2, 26 ± 1, 25
41,49 ± 10,85
50,163 ± 7,83
40,04 ± 9,73
-0,523 ± 0,027
1°
6,73 ± 0,10
19,71 ± 5,33
2,51 ± 0,87
38,82 ± 9,17
46,04 ± 5,78
37,47 ±
10,52
-0,509 ± 0,074
2°
6,68 ± 0,08
20,97 ± 5,56
2,36 ± 1,43
39,72 ± 10,95
48,50 ± 6,40
40,03 ± 9,76
-0,526 ± 0,006
3°
6,61 ± 0,10
21,05 ± 7,04
1,92 ± 1,25
45,51 ± 11,05
55,364 ± 8,04
41,99 ± 8,81
-0,524 ± 0,006
Tabella 27- Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).
Azienda
N.
Produzione
mungitura
mattina (l)
Grasso
(%)
Proteina
(%)
Caseina
(%)
Indice caseina
Resa stimata
(%)
Lattosio
(%)
mozzarella
( kg)
1
25
6,2 ± 1,9
7,35 ± 1,32
4,28 ± 0,32
3,52 ± 0,31
82,88 ± 3,37
4,88 ± 0,21
1,35 ± 0,46
2
36
5,2 ± 2,0
7,19 ± 1,13
4,56 ± 0,55
3,65 ± 0,63
83,05 ± 3,04
4,90 ± 0,23
1,21 ± 0,41
3
43
5,1 ± 1,3
8,25 ± 1,22
4,62 ± 0,30
3,77 ± 0,22
80,99 ± 3,55
4,77 ± 0,12
1,28 ± 0,27
4
36
5,3 ± 2,6
6,92 ± 2,01
4,46 ± 0,42
3,55 ± 0,40
79,53 ± 5,44
4,60 ± 0,44
1,22 ± 0,57
59
Tabella 28 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).
Azienda
Cellule
somatiche
(*103/ml)
(citometria di
flusso)
Cellule somatiche
(*103/ml)
(microscopia)
Neutrofili
(%)
Linfociti
(%)
1
175 ± 172
204 ± 193
52 ± 18
2
68 ± 119
142 ± 118
3
56 ± 72
4
761 ± 1175
Macrofagi
(%)
Esame
batteriologico
(% campioni
analizzati)
Cloruri
(mg/ml)
Carica batterica
totale
(ufc*103/ml)
32 ± 15
16 ± 13
8*
0,695 ± 0,158
1065 ± 1205
36 ± 17
53 ± 17
12 ± 8
30*
0,613 ± 0,135
155 ± 245
128 ± 66
43 ± 17
41 ± 14
16 ± 18
19*
0,585 ± 0,107
278 ± 310
708 ± 1245
61 ± 18
29 ± 16
11 ± 6
31**
1,066 ± 0,421
401 ± 412
* nelle prime tre aziende sono presenti solo agenti mastitogeni ambientali.
** nella quarta azienda sono presenti solo agenti mastitogeni patogeni.
Tabella 29 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala. Aziende (medie ± deviazione standard).
Tempo di
rassodamento
k20 (min)
Consistenza
coagulo a 30'
A30 (mm)
Consistenza
coagulo al
doppio di r
A2r (mm)
Urea (mg/dl)
Indice
crioscopico (°C)
Azienda
pH
Tempo di
coagulazione
r (min)
1
6,66 ± 0,13
17,84 ± 5,61
2,12 ± 0, 51
40,08 ± 9,48
44,14 ± 4,40
32,44 ± 8,18
-0,524 ± 0,005
2
6,64 ± 0,11
18,94 ± 3,29
2,14 ± 0,73
44,40 ± 7,79
49,10 ± 5,91
44,83 ± 11,98
-0,525 ± 0,009
3
6,67 ± 0,05
21,66 ± 2,55
1,75 ± 0,53
44,21 ± 10,43
57,70 ± 5,20
39,81 ± 5,27
-0,525 ± 0,006
4
6,71 ± 0,10
23,74 ± 8,70
2,94 ± 2,06
36,33 ± 13,67
49,07 ± 8,84
40,29 ± 7,84
-0,518 ± 0,052
60
Tabella 30 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).
Classi di
cellule
somatiche
(*103/ml)
< 200
Giorni di
lattazione
N. (%)
71
Produzione
mungitura
mattina (l)
99
Grasso
(%)
5,5
Proteina
(%)
7,49
Caseina
(%)
4,54
Indice caseina
(%)
3,66
81,79
Lattosio
(%)
4,87
Resa stimata
mozzarella
( kg)
1,31
200 ÷ 399
15
111
5,5
7,43
4,35
3,52
81,39
4,73
1,27
≥ 400
14
109
4,3
7,42
4,49
3,58
79,90
4,39
1,00
Tabella 31 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).
Classi di
cellule
somatiche
(*103/ml)
Cellule
somatiche
(*103/ml)
(citometria di
flusso)
Cellule somatiche
(*103/ml)
(microscopia)
Neutrofili
(%)
Linfociti
(%)
Macrofagi
%)
Esame
batteriologico
(% campioni
analizzati)
Cloruri
(mg/ml)
Carica batterica
Totale
(ufc*103/ml)
< 200
48
119
41
45
14
22*
0,611
307
200 ÷ 399
300
304
58
30
11
26**
0,760
648
≥ 400
1524
1210
71
16
13
28**
1,154
734
* nelle prima classe sono presenti circa il 5% di agenti mastitogeni patogeni.
** nelle seconda e terza classe sono presenti il 100% di agenti mastitogeni patogeni.
61
Tabella 32 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 3 classi di cellule somatiche (medie).
pH
Tempo di
coagulazione
r (min)
Tempo di
rassodamento
k20 (min)
Consistenza
coagulo a 30'
A30 (mm)
Consistenza
coagulo al
doppio di r
A2r (mm)
Urea
(mg/dl)
Indice
crioscopico
(°C)
< 200
6,66
19,81
2,03
43,56
50,99
39,73
-0,524
200 ÷ 399
6,66
21,32
2,80
36,13
46,34
41,15
-0,527
≥ 400
6,72
24,25
2,84
36,05
50,16
40,31
-0,530
Classi di
cellule
somatiche
(*103/ml)
Tabella 33 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).
Classi di carica
atterica totale
ufc*103/ml)
N. (%)
Giorni di
lattazione
produzione
mungitura
mattina (l)
Grasso
(%)
Proteina
(%)
Caseina
(%)
Indice
caseina
(%)
Lattosio
(%)
Resa stimata
mozzarella
( kg)
< 100
31
103
5,9
7,22
4,47
3,67
82,31
4,90
1,36
100 ÷ 199
22
102
5,4
7,60
4,51
3,95
89,33
4,83
1,27
200 ÷ 499
24
87
5,0
7,42
4,53
3,60
81,98
4,78
1,15
≥ 500
22
118
5,0
7,78
4,53
3,62
80,18
4,53
1,23
62
Tabella 34 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).
Classi di carica
batterica totale
(ufc*103/ml)
Cellule somatiche
(*103/ml)
(citometria di
flusso)
Neutrofili
(%)
Linfociti
(%)
Macrofagi
(%)
Cloruri
(mg/ml)
Carica batterica totale
(ufc*103/ml)
< 100
158
42
45
14
0,629
48
100 ÷ 199
110
50
41
9
0,626
137
200 ÷ 499
143
53
32
15
0,611
324
≥ 500
725
56
29
15
0,830
1382
Tabella 35 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala secondo 4 classi di carica batterica totale (medie).
pH
Tempo di
coagulazione
r (min)
Tempo di
rassodamento
k20 (min)
Consistenza
coagulo a 30'
A30 (mm)
Consistenza
coagulo al
doppio di r
A2r (mm)
Urea
(mg/dl)
< 100
6,66
19,06
2,17
43,53
49,73
41,17
100 ÷ 199
6,68
20,93
2,16
41,43
52,10
39,83
200 ÷ 499
6,70
22,85
2,68
37,39
50,59
38,95
≥ 500
6,64
20,61
2,04
42,35
48,02
39,52
Classi di carica
atterica totale
ufc*103/ml)
63
Indice
crioscopico °C
-0,526
-0,524
-0,525
-0,526
Tabella 36 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie ±
deviazione standard).
N. (%)
Giorni di
lattazione
Produzione
mungitura
mattina (l)
Grasso
(%)
Proteina
(%)
Caseina
(%)
Indice caseina
(%)
Lattosio
(%)
Negativi
78
108 ± 63
5,3 ± 1,9
7,64 ± 1,54
4,55 ± 0,40
3,66 ± 0,42
81,79 ± 3,93
4,79 ± 0,24
Ambientali (S.
uberis, S. coag.
13
43 ± 32
5,6 ± 2,0
6,78 ± 1,18
4,44 ± 0,54
3,57 ± 0,53
81,03 ± 2,95
4,84 ± 0,28
9
122 ± 56
4,9 ± 3,0
7,51 ± 2,45
4,43 ± 0,51
3,43 ± 0,49
76,90 ± 7,13
4,32 ± 0,54
Agenti
mastitogeni
neg.)
Patogeni (S. aureus,
S. agalactiae)
Tabella 37 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie
± deviazione standard).
cellule somatiche
(*103/ml)
(citometria di flusso)
Neutrofili
(%)
Linfociti
(%)
Macrofagi
(%)
Cloruri
mg/ml)
Carica batterica
Totale
(ufc*103/ml)
204 ± 435
49 ± 20
37 ± 17
14 ± 13
0,678 ± 0,206
448 ± 717
Ambientali (S. uberis, S. coag. neg. )
25 ± 25
33 ± 12
54 ± 10
14 ± 12
0,608 ± 0,129
3701 ± 404
Patogeni (St. aureus, Str. agalactiae)
1279 ± 1705
65 ± 11
24 ± 10
10 ± 4
1,226 ± 0,476
601 ± 510
Agenti mastitogeni
Negativi
64
Tabella 38 - Caratteristiche chimico-fisiche, igienico-sanitarie e tecnologiche del latte di bufala in base alla positività ad agenti mastitogeni ambientali e patogeni (medie ±
deviazione standard).
pH
Tempo di
Coagulazione
r (min’)
Tempo di
assodamento
k20 (min)
Consistenza
coagulo a 30'
A30 (mm)
Consistenza
coagulo al
doppio di r
A2r (mm)
Urea
(mg/dl)
Indice
rioscopico °C
6,66 ± 0,10
20,38 ± 5,37
2,18 ± 1,24
42,02 ± 11,54
51,09 ± 7,52
38,78 ± 8,59
-0,521 ± 0,031
6,71 ± 0,11
19,73 ± 3,50
2,37 ± 0,64
39,46 ± 7,34
48,00 ± 7,57
42,30 ± 15,15
-0,528 ± 0,008
6,73 ± 0,12
27,89 ± 11,64
3,14 ± 2,09
34,89 ± 11,62
48,16 ± 14,07
40,24 ± 7,45
-0,529 ± 0,005
Agenti mastitogeni
Negativi
Ambientali (S. uberis, S.
coag. neg.)
Patogeni (S. aureus, S.
agalactiae)
Tabella 39 - Produzione, caratteristiche chimico-fisiche e tempo di coagulazione del latte di bufala a fine lattazione e con diversi contenuti di cellule somatiche.
Produzione
mungitura
mattina (l)
Lattosio
(%)
Indice caseina
(%)
pH
tempo di
coagulazione
r (min)
Neutrofili
(%)
Cloruri
(mg/ml)
Positività
3° prelievo
3,9 ± 1,1
4,62 ± 0,40
79,54 ± 5,74
6,61 ± 0,10
21,05 ± 7,04
46 ±19
0,832 ± 0,332
11*
Cellule somatiche
200 ÷ 399 (*103/ml)
5,5
4,73
81,39
6,66
21,32
58
0,760
26**
Cellule somatiche
≥ 400 (*103/ml)
4,3
4,39
79,90
6,72
24,25
71
1,154
28**
* 80% di agenti mastitogeni patogeni.
**100% di agenti mastitogeni patogeni.
65
Cellule somatiche
Quando le cellule somatiche sono tra 200.000 e 400.000/ml (15% dei campioni) non ci sono
effetti rilevanti sulla produzione e sulla qualità del latte
Indicatori
•
Gli agenti mastitogeni presenti (26% dei campioni) sono tutti patogeni
•
La % di neutrofili è superiore al 50%
•
Il contenuto di lattosio e cloruri varia rispetto ai campioni contenenti meno di 200.000
cellule somatiche/ml
Quando le cellule somatiche sono superiori a 400.000/ml (14% dei campioni) si hanno i
seguenti effetti sulla produzione e qualità del latte:
•
•
•
•
La produzione di latte diminuisce di circa un quarto rispetto a quella osservata per contenuti
di cellule somatiche inferiori
La resa giornaliera stimata in mozzarella è inferiore di circa un quarto
L’indice di caseina è inferiore all’80%
Il tempo di coagulazione si allunga di circa quattro minuti
Indicatori
•
•
•
•
•
Gli agenti mastitogeni presenti (28% dei campioni) sono tutti patogeni
Il pH è maggiore di 6,7
Il lattosio è inferiore a 4,5%
Il contenuto di cloruri è superiore a 1 mg/ml
Il contenuto di neutrofili è superiore al 60%
Esame batteriologico
In presenza di agenti mastitogeni patogeni si osserva che:
•
•
•
•
•
•
•
La produzione di latte è inferiore
L’indice di caseina è inferiore all’80%
Il tempo di coagulazione è più elevato
Il pH è maggiore di 6,7
Il lattosio è inferiore a 4,5%
Il contenuto di cloruri è superiore a 1 mg/ml
Il contenuto di neutrofili è superiore al 60%
66
In concomitanza di un’elevata carica batterica (> 500.000/ml) si osserva anche un elevato
numero di cellule somatiche (725.000/ml). Il numero medio di giorni di lattazione è più elevato
e quindi si tratta prevalentemente dei campioni del terzo prelievo, che è stato effettuato in
estate, quando le temperature elevate concorrono all’innalzamento della carica batterica.
3.2.3. Conclusioni
Le caratteristiche igienico-sanitarie del latte di bufala variano, come atteso, in funzione dello
stadio di lattazione e dell’azienda. Il contenuto di cellule somatiche si conferma come indicatore
attendibile per valutare la presenza di mastiti subcliniche nel latte di bufala.
Sono state individuate due soglie di criticità per le cellule somatiche: >200.000/ml e
>400.000/ml
>200.000/ml
•
Alcuni indicatori di mastite sono positivi
•
Produzione e qualità del latte non variano
>400.000/ml
•
Tutti gli indicatori sono positivi
•
Produzione e qualità del latte variano
Tali risultati suggeriscono come sia auspicabile effettuare controlli più accurati sulla mammella
quando il contenuto di cellule somatiche del latte supera 200.000/ml, mentre, per il pagamento
secondo qualità, dagli effetti osservati sulla produzione e sulle caratteristiche del latte, è
consigliabile adottare una franchigia di 400.000/ml
3.3. Analisi genetica
L’identificazione il genotipo delle bufale della prova è stato effettuao in due regioni del gene
NRAMP1 - (natural-resistance-associated macrophage protein), gene che condiziona la fase
iniziale delle infezioni cellulari batteriche, in quanto controlla la proliferazione microbica negli
organi reticolo-endoteliali attraverso una serie di effetti pleiotropici che regolano l'attivazione dei
macrofagi e quindi la suscettibilità alle malattie infettive.
67
Il gene è stato sequenziato da autori
diversi nel cervo, nella pecora, nel bovino e nella bufala. Nella regione 3’ non codificante la
proteina (cioè trascritta nell’mRNA ma non tradotta) il gene ha una particolarità: è presente una
sequenza microsatellite ripetuta (GT)n altamente polimorfa e informativa che è stata
evidenziata nella pecora e nel cervo. Nel bovino e nel bufalo, nella stessa regione, i microsatelliti
(GT)n sono tre, lontani l’uno dall’altro rispettivamente di 63 e di 24 nucleotidi. Un recente
lavoro di Borriello & Iannelli (2006) afferma che i bufali per presentano nel genoma un numero
maggiore di ripetizioni (GT)n sono resistenti alla brucellosi.
Approfondimento della struttura genomica della regione 3’ contenente i
microsatelliti.
Questa regione è stata sequenziata in 12 buufale. Si è evidenziato che il primo microsatellite
(MIC-1) contiene una seqeunza di (GT)12 oppure (GT)16; il secondo di (GT) 6; il terzo (MIC2) di (GT)14 oppure (GT)15. Prima di avere a disposizione i campioni di DNA delle bufale del
PRAL, poichè il sequenziamento diretto comporta un’ analisi lunga e costosa, e poichè il
sequenziatore del nostro laboratorio è dotato di una procedura veloce (GeneScan) per
determinare la dimensione di ogni frammento, prima di sequenziarlo, abbiamo analizzato con
quest’ultima 76 bufale di Tor Mancina ai due microsatelliti che si erano mostrati polimorfi al
punto 1, cioè MIC-1 e MIC-2. E’ risultato che:
•
gli animali omozigoti con (GT)16 al MIC-1 erano sempre omozigoti (GT)14 al MIC-2;
•
gli animali omozigoti con (GT)12 al MIC-1 erano sempre omozigoti (GT)15 al MIC-2;
•
gli animali eterozigoti
(GT)12 (GT)16
al MIC-1 erano sempre eterozigoti
(GT)14
(GT)15 al MIC-2.
Di tre soggetti (uno per ogni genotipo MIC-1 MIC-2) sono stati sequenziati tutti gli esoni (15) e
parte delle rispettive regioni fiancheggianti (circa 5400 nucleotidi sequenziati) fino alla regione
promotrice 5’. Sono state evidenziate le seguenti 8 mutazioni puntiformi:
Tabella 40 – mutazioni evidenziate per bufale di genotipo MIC-1 e MIC-2
Porzione del gene
N. mutazioni
Posizione nel gene
regione 5’ (promotore)
2
87 nt a monte dell’ATG.
introne 1
3
esone 3
1
non cambia aa
esone 4
1
non cambia aa
introne 6
1
introne 7
1
68
Le sequenze del gene NRAMP1 nella bufala sono state pubblicate su GeneBank (NCBI) con i
seguenti numeri di accessione:
•
DQ390205S1 (esoni 1 e 2 e parziale cds)
•
DQ441408 (esoni 7 e 8 e parziale cds)
•
DQ390205S2 (esoni 14 e 15 e parziale cds)
Si è deciso quindi di genotipizzare tutte le bufale della prova PRAL per la mutazione della
regione 5’ in quanto le altre mutazioni trovate sono localizzate negli introni oppure in posizioni
nell’esone che non comportano la codifica di un diverso amino acido. Sono state sequenziate
tutte le bufale della prova, con l’obiettivo di fare un’analisi statistica di associazione tra i
polimorfismi individuati nel promotore del gene e la conta delle cellule somatiche, nonché
l'insorgere di patologie (mastiti in particolare) e gli altri parametri fenotipici rilevati. Tutte le
bufale della prova PRAL sono state tipizzate anche al microsatellite MIC1 al fine di procedere
come sopra, correlando i genotipi trovati con i parametri fenotipici. E’ stata messa a punto una
procedura veloce sul DHPLC per identificare i genotipi al MIC-1, senza così dovere ricorrere al
sequenziamento diretto. Questo sistema utilizza una tecnica separativa in grado di risolvere,
separandoli, i componenti di una miscela (nel caso specifico molecole di DNA). La separazione si
basa sulle diverse velocità che le molecole hanno in una specifica colonna cromatografica: tale
velocità è data dall’effetto combinato di temperatura, tamponi e tipo di sequenza. Il DHPLC
permette di avere una grande precisione analitica – cioè di evidenziare, in una sequenza anche
sconosciuta, la presenza di almeno un allele allo stato eterozigote. Abbiamo disegnato i primer
per amplificare le due regioni del gene NRAMP1 contenenti i due polimorfismi già da noi
identificati nella specie bufalina: 1. polimorfismo A/G nella regione 5’ del gene; 2. dimensione
del microsatellite MIC1 nella regione 3’ del gene. Di seguito sono riportati i profili dei diversi
genotipo ottenuti da analisi in DHPLC.
Figura 24 – Regione 5’, omozigote AA (bufala 2507, azienda Tor mancina)
69
Figura 25 – Regione 5’, omozigote GG (bufala 3001, azienda Tor mancina)
Figura 26 – Regione 5’, eterozigote AG (bufala 2777, azienda Tor mancina)
Gli omozigoti AA e GG hanno un picco d’eluizione identico. Per tipizzare tutti i soggetti
omozigoti, l’analisi è stata ripetuta mescolando i prodotti di PCR di ciascun omozigote con
ciascuno dei due omozigoti noti; in questo modo si otteneva un profilo uguale a quello
dell’omozigote quando i due campioni avevano lo stesso genotipo, uguale a quello
dell’eterozigote quando i campioni avevano genitipo diverso.
Figura 27 – Regione 3’, microsatelliti con 12 ripetizioni o 16 ripetizioni (alleli 12 e 16) allo stato omozigote
I due alleli, allo stato omozigote, sono distinguibili dal diverso tempo di eluizione in quanto il
70
frammento più corto eluisce prima del frammento lungo.
Figura 28 – Regione 3’, campione eterozigote al microsatellite (genotipo 1216)
Figura 29 – Regione 3’, campione eterozigote al microsatellite (genotipo 912)
Di tutte le bufale della prova PRAL è stato individuato il genotipo ai due loci indicati: gtyp-5'
egtyp-mic1 con la tecnica DHPLC sopra descritta, e con conferma del genotipo di una parte dei
campioni tramite sequenziamento diretto; i genotipi sono riportati nella seguente Tabella 37.
Sono state fatte analisi di associazione utilizzando un’ analisi di regressione per stimare l’effetto
di ciascun allele sulla conta di cellule somatiche risultate dai due controlli del latte effettuati
sulle bufale della prova. L’analisi è stata fatta per i due loci separatamente.
Nel caso del
genotipo al locus 3’ (microsatellite), l’effetto dell’allele 9, non potendo essere stimato da solo
per la bassa numerosità rilevata e perchè sempre solo presente allo stato eterozigote, è stato
equiparato all’allele 12, come indicato da Borriello et al. (2006) che attribuiscono un diverso
effetto immunitario alla dimensone del locus nel suo complesso.
71
Tabella 41 – Genotipi delle bufale impiegate per la sperimentazione
Matricola
azienda
1190
5090
5964
6517
6542
32617
34830
42627
12310
23919
35786
44147
44163
44164
75037
75044
85939
85941
85954
85961
21956
80352
13
19
63
gtyp-5'
gtyp-mic1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
gg
gg
ag
gg
gg
gg
ag
ag
ag
gg
ag
ag
gg
ag
ag
ag
ag
gg
ag
gg
gg
gg
ag
ag
gg
Matricola
azienda
83
89
110
113
137
141
146
157
41816
41830
83414
140
5061
5117
5141
5179
5203
5204
5207
5211
5215
5221
5228
5148
5348
1616
1216
1216
912
1616
912
1212
1212
912
1216
1216
912
1212
1212
1216
1216
1212
1212
1212
1216
1216
1212
1212
1212
1212
gtyp-5'
gtyp-mic1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
gg
gg
gg
gg
gg
gg
ag
gg
ag
gg
gg
ag
ag
ag
ag
ag
gg
ag
ag
gg
gg
gg
1216
1216
1216
1216
1616
1216
1216
1212
916
1212
1616
1216
1216
1212
1212
1212
1216
1216
1216
1212
1212
1616
1216
Dalla tabella risulta evidente che i due loci, distanti oltre 8000 bp l’uno dall’altro, non sono in
disequilibio di linkage, pertanto l’analisi è stata fatta separatamente per ciascun locus.
Non è risultato un effetto significativo del genotipo al locus del promotore (regione 5’) sulle
cellule somatiche del latte. E’ risultato un effetto negativo significativo dell’allele 16 del
microsatellite sulle cellule somatiche sia al primo controllo che al secondo controllo, e molto più
accentuato al secondo controllo; precisamente,
l’aumento di cellule somatiche dovuto alla
presenza dell’allele 16 è risultato +10.710 (P=0.07) al primo controllo e +223.640 (P=0.03) al
secondo controllo. Non si sono trovati in letteratura lavori in cui viene associato il genotipo al
microsatellite alle cellule somatiche del latte; questo allele viene invece associato generalmente
alle suscettibilità alle malattie causate da batteri. Ci sembra interessante approfondire la
questione, anzitutto perchè l’allele 16 è risultato molto meno frequente dell’allele 12, non solo
nella popolazione oggetto di sperimentazione dell’ambito del programma PRAL, ma anche nelle
76 bufale dell’azienda di Tor Mancina che erano state tipizzate precedentemente. Si potrebbe
72
ipotizzare quindi che le bufale portatrici dell’allele 16 vengano più facilmente eliminate a causa
di mastiti. Riteniamo pertanto che sarebbe utile, prima di produrre risultati definitivi, analizzare
una popolazione più numerosa. Stiamo cercando di individuare altri soggetti, nelle stesse
aziende o in altre aziende, che abbiano genotipo omozigote per l’allele 16.
Per verificare la diversa espressione del gene NRAMP1 nei soggetti con l’allele 16 e 12, oppure
nei soggetti con genotipi diverso nella regione 5’ UTR,
è già messa a punto la tecnica di
estrazione di RNA da sangue ed è stata fatta una analisi di espressione semiquantitativa,
tramite PCR e analisi dell’amplificato sul gel con densitometro. Sono stati analizzati inizialmente
3 animali con differente genotipo:
matricola Bufala
5’UTR
microsatellite
3651
gg
12/12
3662
aa
12/12
137
gg
16/16
L’RNA totale è stato estratto da sangue usando il kit.PureLink Total RNA Blood purification Kit.
(INVITROGEN), la concentrazione e la qualità dell’RNA è stata determinata determinata sia
mediante caricamento su gel di agarosio all’ 1% che con il fluorimetro: Qubit Quantitation
INVITROGEN), utilizzando il Quant-iT RNA Assay Kit (INVITROGEN)
L’RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando il ImProm-IITM Riverse Transcription
System per RT-PCR (Promega) in un volume di reazione di 20µl. La qualità dell’ cDNA prodotto
è stato valutata tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1%.. E’ stata poi fatta
un’amplificazione mediante PCR semiquantitativa (capace di valutare una differente quantità di
amplificato fra animali di diverso genotipo) di una partre del gene di NRAMP, e per normalizzare
i risultati attesi sono stati usati quattro housekeeping bovino (geni che si esprimono con la
stessa intensità in tutti gli individui, indipendentemente dal genotipo): Glyceraldehyde-3Phosphate Dehydrogenase, GAPDH; ribosomal protein large P0, RPLPO; β-Actin e 18S ribosomal
RNA component. I primer per amplificare il cDNA del gene NRAMP1 sono stati disegnati tra gli
esoni 1 e 4. Con gli stessi primer è stata fatta anche un’amplificazione su DNA genomico per
verificare che l’amplificato era di diversa grandezza rispetto all’amplificato ottenuto con il cDNA.
73
PCR Semiquantitativa
Il cDNA è stato amplificato ottimizzando le condizioni PCR in modo tale da trovare il giusto
numero di cicli che ci permettesse di evidenziare differenze quantitative dell’amplificato. La foto
mostra l’amplificato dopo 30 cicli di PCR per NRAMP e 20 per il 18 S dove il genotipo 16/16-GG
esprime di più rispetto al 12/12-GG, che a sua volta esprime di più rispetto al 12/12 AA.
NRAMP
MARKER
12/12-GG 12/12-AA
18S
16/16-GG 12/12-GG 12/12-AA
16/16-GG
Figura 30 – Amplificati di NRAMP e 18s per tre genotipi differenti.
I risultati preliminari ottenuti con la PCR semiquantitativa dovranno essere confermati dalla
analisi dell’espressione quantitativa dell’RNA con PCR Real Time, ma già ad una prima analisi
visiva si può notare come ci siano differenze di espressione tra i vari genotipi.
opportuno effettuare l’analisi dell’espressione quantitativa dell’RNA
Inoltre è
con PCR Real Time, in
quanto la conferma dell’effetto negativo dell’allele 16 sulla resistenza alle mastiti necessita di
essere giustificata scientificamente da una differenza di espressione nell’RNA tra i due genotipi .
74
4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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ewes’ and goats’ milk mixtures and cheeses. J Chrom. A; 994: 59-74.
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Atti della Società italiana delle scienze veterinarie, Volume XLVI
Mariani P., Pecorari M., 1991. Il ruolo delle varianti genetiche della κ-caseina nella
produzione del formaggio. Sci. Tecn. Latt.-Cas.; 42:255-258.
Mariani P., Anghiretti A., Seventi P., Fossa E., 1993. Frazionamento della caseina mediante
RP-HPLC: sulla osservazione di alcuni latti individuali caratterizzati da una bassa
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75
Allegato 1
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International Symposium of The International Dairy Federation (IDF) “Challenge to Sheep
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B. Moioli, L. Orrù, G. DeMatteis, M.C. Scatà, M.C. Savarese, F.Napolitano, 2007. Studio dei
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del latte bufalino, ovino e caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”.
Viterbo - 5 Ottobre 2007.
S.
Orlandini,
M.
Catta,
M.
Miarelli,
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Lattanzi,
2007.
Metodi
di
routine
per la determinazione delle cellule somatiche nel latte di bufala. Citometria di flusso & CCD
camera. Convegno “Caratteristiche igienico – sanitarie del latte bufalino, ovino e caprino Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5 Ottobre 2007.
U. Bernabucci, G. Giacinti, B. Ronchi, 2007. Studio dei fattori che influenzano le
caratteristiche del alatte di capra. Convegno “Caratteristiche igienico – sanitarie del latte
bufalino, ovino e caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5
Ottobre 2007.
C. Tripaldi, G. Paolocci, M. Miarelli, M. Catta, S. Orlandini, S. Amatiste, G. Giacinti, A.
Tammaro, 2007. Aspetti igienico-sanitari e loro effetti sulla produzione quanti-qualitativa
del alatte di bufala. Convegno “Caratteristiche igienico – sanitarie del latte bufalino, ovino e
caprino - Risultati di ricerche condotte nella Regione Lazio”. Viterbo - 5 Ottobre 2007.
76