1. Aggiungere a 3ml di sangue 6ml di soluzione per la lisi dei globuli
rossi (NH4Cl,NaHCO3) in una falcon da 15 ml; incubare per 5’a
temperatura ambiente e centrifugare a 6000 rpm per 5’;
2. Buttare il surnatante, recuperare il pellet di globuli bianchi, e
ripetere il lavaggio con la stessa soluzione di lisi; centrifugare
immediatamente come al punto precedente;
3. Aggiungere al pellet di globuli bianchi 500 µl di Extraction Buffer.
Vortexare per 10-15 secondi;
Reagente
Tris-HCL 1M pH 8
NaCl 2,5 M
EDTA 0,5 M pH 8
SDS 10% pH 7,2
β-mercaptoetanolo
H2 O
Q.tà in 40 ml
8 ml
4 ml
2 ml
7 ml
27,8 µl
19 ml
Funzione
Stabilizza il DNA
Precipita le proteine
Chela gli ioni Mg2+
Rompe membrane cellulari
Denatura le proteine
-
4. Centrifugare per 5’ a 13000 rpm;
5. Trasferire il surnatante in una provetta eppendorf;
6. Aggiungere un ugual volume di isopropanolo ed invertire più volte
la eppendorf fino a che non si evidenzia il flocculo di DNA;
7. A questo punto il DNA dovrà essere “uncinato” con una pipetta
Pasteur, lavato in etanolo al 70% e trasferito in una nuova
Eppendorf contenente 200 µl di acqua.