LA CITOGENETICA
ZOOTECNICA
E’ una scienza ibrida tra la Genetica e la Citologia
che studia i cromosomi da diversi punti di vista:
 clinico: anomalie numeriche e strutturali, non
sempre legate a particolari fenotipi;
 evolutivo: relazioni
specie affini;
citotassonomiche
tra
 molecolare:
mappe
genetiche
fisiche
(localizzazione dei geni sui cromosomi).
I CROMOSOMI
Il materiale genetico è organizzato in strutture
filiformi
chiamate
cromosomi
composti
dalla
cromatina, un complesso di DNA, RNA e proteine.
Sono facilmente visibili durante la mitosi.
Il cromosoma replicato è costituito da due
cromatidi fratelli uniti da un centromero.
Le
estremità
telomeri.
dei
cromosomi
sono
chiamate
In base alla posizione del centromero sono classificati:
a. metacentrici
c.acrocentrici
b.
d.
submetacentrici
telocentrici
Per convenzione il braccio corto è detto braccio p ed è al
di sopra del centromero, mentre il braccio lungo è detto
braccio q ed è al di sotto del centromero.
telomeri
centromero
braccio q
cromatidi fratelli
braccio p
SPECIE
Numero cromosomi
(2n)
Suino e gatto
38
Uomo
46
Bufalo di palude
48
Bufalo di fiume
50
Pecora
54
Bovino e capra
60
Asino
62
Cavallo
64
Cane
78
ISOLAMENTO DEI
CROMOSOMI
1) COLTURE CELLULARI
I cromosomi possono essere isolati da colture di
cellule che crescono, in terreni nutritivi completi, in
sospensione (linfociti) o su strato (fibroblasti).
Nel caso delle colture linfocitarie è necessario
l’impiego
di
sostanze
mitogene
(pokeweed,
fitoemoagglutinina, concavalina A) che stimolano la
moltiplicazione
cellulare,
normalmente per i fibroblasti.
che
invece
avviene
La coltura dei linfociti (0.7 – 1 ml di sangue periferico
in 10 ml di terreno nutritivo) necessita di pochi giorni
(in genere 3 giorni).
La coltura dei fibroblasti richiede alcune settimane
ma ha il vantaggio di poter essere portata avanti per
mesi e le cellule possono essere congelate (a –70° C
per mesi, in azoto liquido per anni) e riutilizzate al
momento desiderato.
2) COLCHICINA
Al terzo giorno di coltura si aggiunge la colchicina ad
opportune dosi in relazione alla specie ed alla tecnica
colturale, per un tempo variabile dai 30 ai 60 minuti.
La colchicina ha la proprietà di bloccare il ciclo
cellulare impedendo il disfacimento delle fibre del
fuso mitotico, per cui la cellula resta in metafase.
3) TRATTAMENTO IPOTONICO
Segue un trattamento con soluzione ipotonica (0.5%
KCl) per 20-30 minuti al fine di aumentare il volume
delle cellule e quindi di distanziare quanto più è
possibile i cromosomi che si trovano nella piastra
equatoriale attaccati al fuso.
4) FISSAZIONE
Le cellule sono sottoposte a fissazione in
metanolo/acido acetico 1:3 per n volte consecutive
fino a quando il supernatante non diventa chiaro (al
termine di ogni trattamento la sospensione cellulare è
sottoposta a centrifugazione al fine di eliminare il
supernatante
e
predisporla
al
trattamento
successivo).
Alla fine, eliminato il supernatante, si otterrà una
sospensione opalescente (circa 1 ml).
5) ALLESTIMENTO DEI VETRINI
Una goccia di sospensione è fatta cadere, su un
vetrino precedentemente sgrassato, freddo e
bagnato, inclinato di 45°; in tal modo i nuclei in
metafase si rompono ed i cromosomi si fissano sul
vetrino, successivamente asciugato all’aria.
I nuclei in interfase saranno visibili come grossi corpi
sferici.
I preparati cromosomici, così ottenuti, possono
essere colorati o trattati con varie tecniche.
Piastre metafasiche con nuclei in interfase
Piastra metafasica di bovino 2n= 60, XX, acquisita in contrasto di
fase, 100x
X
Y
Piastra metafasica di bovino 2n = 60, XY; GIEMSA
X
X
Piastra metafasica di bovino 2n = 60, XX; Arancio d’acridina
IL BANDEGGIO
CROMOSOMICO
E’ una tecnica per la colorazione differenziale dei
cromosomi, che produce un caratteristico pattern
di bande o la colorazione selettiva di specifiche
regioni
(quali
i
centromeri,
le
regioni
dell’organizzazione nucleolare o le regioni ricche
in AT e GC).
N.B. :
Ogni
qualvolta
si
ha
una
colorazione positiva (banda) per una
qualsivoglia tecnica, significa che il DNA,
in quelle particolari regioni, è nativo = non
denaturato e/o senza incorporazione di
analoghi di base.
Le
bande
eucromatiche
R
corrispondono
ossia
le
regioni
alle
regioni
cromosomiche
contenenti la maggior parte dei geni strutturali,
ricche in basi G-C, che replicano precocemente
nella
fase
S1
e
che
sono
relativamente
decondensate durante l’interfase.
Le bande G e Q colorano, invece, le regioni
eterocromatiche cioè le regioni cromosomiche,
ricche in basi A-T, che replicano tardivamente
nella fase S2 e che si mostrano fortemente
condensate in interfase.
Piastra metafasica di pecora 2n = 54, XX; tecnica RBA
Piastra metafasica di bufalo 2n = 50, XX; tecnica RBA
IDEOGRAMMI
braccio p
centromero
braccio q
bande positive G (sx)
ed R (dx)
bande negative G (sx)
ed R (dx)
Le bande C colorano solo l’eterocromatina
costitutiva (HC) che corrisponde a quella
parte
di
eterocromatina
altamente
condensata, con sequenze di DNA altamente
ripetitive,
a
replicazione
tardiva
e
localizzata, per la maggior parte, presso i
centromeri dei cromosomi.
X
X
Piastra metafasica di bufalo 2n = 50, XX; tecnica CBA
X
X
Piastra metafasica di pecora 2n = 54, XX; tecnica CBA
X
X
Piastra metafasica di cavallo 2n=64, XX, tecnica CBA
X
Y
Piastra metafasica di cavallo 2n=64, XY, tecnica CBA
IL CARIOTIPO
Consiste nel disporre, per coppie omologhe, i cromosomi
metafasici ottenuti da una singola cellula, ordinati per:
 lunghezza (dai più grandi ai più piccoli)
 forma (metacentrici, submetacentrici,acrocentrici,
telocentrici)
 bandeggio (alternanza di zone colorate e non)
Il numero diploide (2n) è tipico per ogni specie per cui il
numero delle coppie cromosomiche sarà numerato da 1 a
N, inclusi i due cromosomi sessuali che, al posto del
numero, saranno indicati con XX (femmina) oppure XY
(maschio).
Cariotipo di capra (Capra Hircus) 2n=60, XY, tecnica RBG
APPLICAZIONI DELLA
CITOGENETICA ZOOTECNICA
 Clinica:
diagnosi
mutazioni
cromosomiche
(numeriche e strutturali) causa di sindromi o
malattie genetiche.
 Mutagenesi ambientale: biomonitoraggio delle
popolazioni animali
FREE-MARTIN O
MOSAICISMO ERITROCITARIO (XX/XY)
Il Free-Martin o mosaicismo eritrocitario (XX/XY) è
un esempio di intersesso che si verifica soprattutto
nella specie bovina (raramente nelle specie ovina e
suina), nel 92% delle gravidanze gemellari quando i due
feti gemelli sono di sesso opposto. I maschi sono
generalmente normali e fertili mentre le femmine sono
sterili. Fenotipicamente presentano i genitali esterni,
ma in genere l’utero non è sviluppato e le ovaie possono
presentare contemporaneamente tessuto ovarico e
testicolare.
Negli stadi iniziali dello sviluppo si verifica una fusione
delle membrane fetali, con conseguente anastomosi
dei vasi placentari, in tal modo si verifica uno scambio
degli ormoni prodotti nei due feti di sesso diverso e
dei linfociti e delle altre cellule del sangue.
Gli ormoni maschili sono secreti dal testicolo del
vitello
prima
che
l’ovaio
della
gemella
sia
completamente sviluppato e impediscono il normale
accrescimento sia dell’ovaio che delle vie genitali.
Due piastre metafasiche di una manza di razza Agerolese,
2n = 60, XX/2n=60, XY, Free-martin
LA TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA
Definita
anche
fusione
centrica,
è
l’aberrazione
cromosomica più studiata e diffusa (nei bovini è
presente soprattutto nelle razze da carne).
Consiste nella fusione di due cromosomi acrocentrici ai
centromeri con la conseguente formazione di un
cromosoma metacentrico o submetacentrico e di un
piccolo elemento eterocromatico che presumibilmente
si perde nelle susseguenti divisioni.
TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA
Rottura e
fusione
+
Frammenti
perduti
+
Cromosomi acrocentrici
non omologhi
Cromosoma
traslocato
Questo tipo di aberrazione cromosomica fu scoperta
da Gustavsson nel 1964, nel corso di un’indagine
cariologica condotta su 2045 animali appartenenti alle
razze: Bianca e Rossa Svedese (SRB) e Frisona
Svedese (SLB).
Furono evidenziati tre diversi assetti cromosomici: 2n
= 60, 2n = 59 (portatori eterozigoti) e 2n = 58
(portatori omozigoti).
Affinate le tecniche di bandeggio fu scoperto che i
cromosomi coinvolti nella fusione centrica erano l’1 ed
il 29.
Nei
portatori
eterozigoti
della
traslocazione
Robertsoniana, teoricamente, si ha la formazione di
gameti normali o bilanciati e, attraverso la non
disgiunzione
meiotica,
alla
formazione
di
gameti
aneuploidi.
Nei gameti bilanciati si conta un corredo cromosomico
aploide 2n=59, ma il numero fondamentale (numero di
braccia) resta quello del cariotipo normale aploide
(l’informazione genetica è totalmente trasmessa, ad
eccezione del corredo cromomerico).
Nei
gameti
aneuploidi,
formatisi
attraverso
una
segregazione non disgiuntiva, si ha una perdita di
informazione genetica o la presenza di cromosomi in più.
La partecipazione di gameti aneuploidi alla fecondazione
porta alla formazione di zigoti monosomici o trisomici
che
muoiono
durante
la
gestazione
cromosomico incompatibile con la vita).
(corredo
Pertanto, individui eterozigoti per una traslocazione
Robertsoniana presentano una riduzione di fertilità,
percentuali di aborto superiore alla media ed un certo
numero
di
congenite.
progenie
aneuploide
con
anormalità
Y
rob(1;29)
X
Piastra metafasica di bovino di razza Agerolese 2n = 60, XY;
rob (1;29)