GLUCOCORTICOIDI PLASMATICI in LC/MS – Codice LC71010
(Pregnenolone, 17-OH-Pregnenolone, 17-OH-Progesterone, 11-Deossicortisolo, Cortisolo)
INTRODUZIONE
Ormoni e meccanismi dell'azione ormonale
Il termine “ormone” indica una sostanza che, prodotta da una cellula endocrina, cioè a secrezione interna,
viene liberata nel circolo sanguigno, provocando risposte funzionali in cellule localizzate a varia distanza
dalla sua sede di produzione. Per l'espletamento dell'azione ormonale sono necessari, oltre alla sintesi e alla
secrezione, il trasporto nel circolo sanguigno e la destinazione nei tessuti bersaglio dove sono presenti i
recettori, strutture specializzate che riconoscono lo stimolo specifico e ne traducono il messaggio.
I recettori possono essere sulla membrana della cellula o all'interno di essa; l'ormone che non può
attraversare la membrana (per es., un peptide) si lega a recettori localizzati sulla membrana plasmatica,
mentre quello che diffonde attraverso la membrana plasmatica all'interno della cellula (steroidi, iodotironine)
si lega a recettori intracellulari (in genere situati nel nucleo). Indipendentemente dalla struttura e dal tipo di
ormone, i recettori hanno caratteristiche comuni: tutti presentano una regione in grado di riconoscere e
legare l'ormone e un'altra deputata alla generazione di un segnale intracellulare che traduce il messaggio
ormonale in risposte funzionali della cellula bersaglio; anche le proprietà che regolano il legame dell'ormone
(affinità, specificità, saturabilità, capacità di trasduzione, cioè di evocare effetti specifici) sono comuni per tutti
i recettori.
La comunicazione affidata agli ormoni avviene per la maggior parte attraverso il circolo ematico (azione
endocrina), ma, in parte minore, anche mediante altre modalità. Alcuni ormoni agiscono infatti sulle cellule
immediatamente circostanti la cellula che li produce (azione paracrina); in altre evenienze, invece,
interagiscono con la stessa cellula secretrice (azione autocrina); altri ormoni, infine, vengono prodotti dai
neuroni del sistema nervoso (azione neurocrina, che in realtà rappresenta una forma specializzata di azione
paracrina). Sono stati identificati più di cinquanta ormoni, le cui caratteristiche funzionali vengono
determinate dalla diversa struttura molecolare. In base a questa, essi vengono suddivisi in quattro grandi
categorie: proteine e peptidi; steroidi; derivati dagli amminoacidi; derivati dagli acidi grassi polinsaturi.
Gli ormoni, interagendo con i recettori localizzati a livello dei tessuti bersaglio, evocano risposte specifiche:
regolano le attività enzimatiche, l'espressione genica e la sintesi delle proteine.
Classificazione ormoni steroidei
Sono liposolubili, diffondono liberamente all'interno della cellula ed esercitano la loro azione dopo essersi
legati a recettori localizzati nel nucleo. La loro struttura chimica, che è policiclica, deriva dal colesterolo.
Sono suddivisi, in base alla sede di produzione, in steroidi gonadici e surrenalici; vengono inclusi in questa
categoria anche la vitamina D e i suoi analoghi. Gli ormoni steroidei prodotti dal surrene e dalle gonadi si
dividono in sottogruppi in base al numero di atomi di carbonio del nucleo steroideo: il progesterone, i
glucocorticoidi e i mineralcorticoidi derivano per sintesi successive dal pregnano, una sostanza semplice che
contiene 21 atomi di carbonio, mentre gli estrogeni provengono dal nucleo dell'estrano che ha 18 atomi di
carbonio, e gli androgeni dal nucleo dell'androstano, che contiene 19 atomi di carbonio.
La sintesi degli ormoni steroidei segue tappe biosintetiche identiche sia nel surrene sia nell'ovaio o nel
testicolo e la differenziazione nelle tre ghiandole endocrine dipende da una diversa distribuzione tessutospecifica degli enzimi di sintesi. La steroidogenesi passa attraverso una serie di tappe enzimatiche, in
1
massima parte catalizzate dagli enzimi citocromo P450 (cP450) localizzati all'interno delle cellule, e inizia
dalla trasformazione del colesterolo in pregnenolone. Questa tappa enzimatica è la più importante in quanto
controlla la sintesi di tutti gli ormoni steroidei; anche in presenza di notevoli quantità di colesterolo, la
possibilità di proseguimento della via biosintetica appare limitata, poiché dipende dall'attività dagli enzimi
cP450. Il pregnenolone formato fuoriesce dal mitocondrio e viene trasferito sul reticolo endoplasmatico, dove
subisce le successive modificazioni enzimatiche da parte dei cP450. Il pregnenolone è quindi il precursore
comune dei principali ormoni steroidei.
I glucocorticoidi vengono sintetizzati nella zona fascicolata e, in minor misura, nella zona reticolare del
surrene. L'ormone più importante del gruppo è rappresentato dal cortisolo che si forma attraverso successivi
passaggi: dapprima il pregnenolone viene trasformato in progesterone e 17-idrossipregnenolone, quindi in
17-idrossiprogesterone, successivamente in 11-desossicortisolo e infine in cortisolo. Il cortisone, che è il
prodotto commercialmente più noto, è un deidrocortisolo; perché possa agire è necessario che avvenga la
sua trasformazione in cortisolo.
Al contrario degli ormoni peptidici, la secrezione degli steroidi in circolo non procede attraverso un loro
immagazzinamento all'interno delle cellule ma segue immediatamente la sintesi. Essi viaggiano nel plasma
legati a proteine di trasporto specifiche, dotate di alta affinità, quali la globulina legante il cortisolo (CBG,
Cortisol binding protein), le globuline leganti gli steroidi sessuali (SHBG, Sex hormone binding protein) e la
proteina legante la vitamina D (DBP, Vitamin D binding protein). La CBG è una glicoproteina in grado di
legare con uguale affinità cortisolo e progesterone. Le SHGB sono globuline che legano con elevata affinità
il testosterone, mentre l'estradiolo è legato in prevalenza all'albumina. Il 98% degli steroidi gonadici, il 95%
del cortisolo e il 50% dell'aldosterone circolano legati alle rispettive proteine di trasporto. Poiché solo
l'ormone libero è in grado d'interagire con i recettori, e quindi di esprimere l'attività biologica, il legame
plasmatico costituisce un'importante fase di riserva nel metabolismo di questi ormoni. Gli steroidi sintetici
impiegati in terapia solitamente non contraggono legame con le proteine di trasporto e sono quindi in grado
di esercitare effetti biologici immediati. I glucocorticoidi e i mineralcorticoidi vengono metabolizzati attraverso
reazioni enzimatiche che determinano la perdita della loro attività ormonale oppure attraverso coniugazione
con gruppi chimici che li rendono idrosolubili e ne determinano l'eliminazione con le urine. L'unica reazione
metabolica che non si traduce in una perdita dell'attività biologica è rappresentata dalla conversione del
testosterone in diidrotestosterone nelle cellule bersaglio. *
*Bibliografia
Enciclopedia della Scienza e della Tecnica (2007)
Andreani, Cassano 1977: Andreani, Domenico - Cassano, Cataldo, Trattato italiano di endocrinologia, Roma, SEU,
1977.
Becker 1995: Becker, Kenneth L., Principles and practice of endocrinology and metabolism, 2. ed., Philadelphia,
Lippincott, 1995 (1. ed.: 1990).
Faglia 1998: Faglia, Giovanni, Malattie del sistema endocrino e del metabolismo, 2. ed., Milano, McGraw-Hill, 1998
(1. ed.: 1993).
Felig 1995: Felig, Philip - Baxter, John D. - Frohman, Lawrence A., Endocrinology and metabolism, 3. ed., New York,
McGraw-Hill, 1995 (1. ed.: 1981).
Giusti, Serio 1988: Giusti, Giorgio - Serio, Mario, Endocrinologia, fisiopatologia e clinica, Firenze, USES, 1988.
Pinchera 1991: Pinchera, Aldo e altri, Endocrinologia e metabolismo. Fisiopatologia e clinica, Milano, Ambrosiana,
1991.
Williams 1998: Williams, Robert H., Williams textbook of endocrinology, 9. ed., edited by Jean D. Wilson e altri,
Philadelphia-London, Saunders, 1998 (1. ed.: 1950).
2
Schema della via biosintetica
PROFILI ORMONI STEROIDEI
Gli ormoni steroidei sono stati organizzati e suddivisi in 4 profili in modo da evidenziare a livello surrenalico
le quattro vie di biosintesi principali che sfociano nell’ormone che determina l’effetto finale a livello dei tessuti
bersaglio.
I profili primari sono i seguenti:
1.
Profilo Glucocorticoidi
2.
Profilo MineralCorticoidi
3.
Profilo Ormoni Sessuali 1° Livello
4.
Profilo Ormoni Sessuali 2° Livello
In questo modo si riesce a coprire tutte le necessità dell’endocrinologia delle ghiandole surrenaliche con un
dettaglio che sarebbe stato impensabile fino a poco tempo fa.
Il profilo 3 contiene anche due ormoni sessuali di prevalente origine extra-surrenalica: Testosterone ed
Estradiolo che possono dare una informazione rapida a seconda dell’età e del sesso del soggetto
esaminato.
In un certo qual modo fungono da cartina di tornasole della sintesi centrale degli ormoni sessuali rispetto ad
una disfunzione di tipo periferico ossia tissutale che dopo quello gonadico è maggiormente responsabile
della sintesi di molecole analoghe.
3
Questo profilo può essere integrato da quello di 2° livello sia maschile che femminile. Il primo sicuramente
ha una enorme importanza per tutte quelle manifestazioni che interessano l’utilizzo periferico degli ormoni
sessuali, specialmente androgeni nelle donne ed estradiolo nel maschio. Disfunzioni a questo livello danno
origine a tutta una serie di segni quali, irsutismo, alopecia, acne, seborrea ecc. Un tale profilo avrebbe
sicuramente una grande importanza sia per i pediatri, ginecologi, andrologi, ma anche i dermatologi che
disporrebbero di uno strumento biochimico in grado di differenziare il tipo di risposta del bulbo pilifero
rispetto alla ghiandola sebacea nelle manifestazioni sopracitate.
Il Profilo di 2° livello femminile, se portato a livelli di sensibilità adeguate, potrebbe essere utile nel definire il
grado di trasformazione del testosterone in estradiolo da parte del tessuto adiposo e rendere conto per
esempio della comparsa di ginecomastia nei pazienti maschi affetti da obesità come pure monitorarne la
terapia.
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Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE del 27/10/1998 e del Dl.ivo n.332 del 08/09/2000 sui
dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta.
Release N° 002
Glucocorticoidi plasmatici in LC/MS
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Novembre 2013
CARATTERISTICHE DEL METODO
Principio del Metodo:
I Glucocorticoidi vengono deproteinizzati con un opportuno reagente contenente lo standard interno,
centrifugati, diluiti e iniettati in LC/MS.
100%
Recupero del Metodo :
Sensibilità del Metodo (LLOD) :
11-Deossicortisolo
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Cortisolo
Pregnenolone
0,020 ng/ml
0,010 ng/ml
0,005 ng/ml
0,10 ng/ml
0,010 ng/ml
Sensibilità del Metodo (LLOQ) :
11-Deossicortisolo
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Cortisolo
Pregnenolone
0,050 ng/ml
0,035 ng/ml
0,015 ng/ml
0,30 ng/ml
0,025 ng/ml
Range Dinamico :
11-Deossicortisolo
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Cortisolo
Pregnenolone
0,05 - 200 ng/ml
0,035 - 100 ng/ml
0,015 - 125 ng/ml
0,30 - 6000 ng/ml
0,025 - 30 ng/ml
ANALITA
11-Deossicortisolo
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Cortisolo
Pregnenolone
Accuratezza intra-giorno Precisione intra-giorno
CV% inter-giorno
(Errore %)
(CV%)
(Errore %)
Calibratore
Calibratore
Calibratore
Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore Inferiore Medio Superiore
9,1%
8,5%
4,3%
5,6%
8,3%
ANALITA
11-Deossicortisolo
17-OH-Pregnenolone
17-OH-Progesterone
Cortisolo
Pregnenolone
7,7%
7,4%
1,6%
3,0%
4,7%
6,0%
1,7%
4,9%
2,7%
5,3%
11,6%
12,3%
5,7%
7,6%
10,5%
11,5%
9,0%
2,3%
3,6%
6,3%
8,2%
2,1%
6,7%
3,3%
4,3%
15,2%
14,1%
9,1%
7,7%
11,4%
12,8%
9,9%
2,6%
3,7%
6,8%
8,6%
2,4%
6,9%
3,4%
4,8%
Concentrazioni utilizzate per calcolare Precisione e Accuratezza
Calibratore
Inferiore
Medio
Superiore
0,1
0,125
0,125
6,25
0,025
0,8
1,0
1,0
50,0
0,2
5
10
12,5
12,5
625,0
2,5
Contenuto della confezione (50 tests) :
Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a 2–8 °C.
Reagente A – Soluzione Deproteinizzante, 5 x 5 ml
Reagente B – Soluzione Standard Interno, 1 x 250 µl
Stoccare a -20
Reagente C – Soluzione Diluente, 1 x 3 ml
Reagente D1 – Calibratore liofilo plasmatico – Livello 1, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D2 – Calibratore liofilo plasmatico – Livello 2, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D3 – Calibratore liofilo plasmatico – Livello 3, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D4 – Calibratore liofilo plasmatico – Livello 4, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente D5 – Calibratore liofilo plasmatico – Livello 5, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente M1 – Fase Mobile M1, 1 x 500 ml
Reagente M2 – Fase Mobile M2, 1 x 500 ml
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento LC-MS triplo quadrupolo medio-alto livello (S/N
di almeno 10.000/1 per 1 pg di Reserpina iniettato)
Modalità di lavoro MRM, APCI positivo
Evaporatore a centrifuga
Modalità per il prelievo ematico :
Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta con EDTA
come anticoagulante. Centrifugare a 4000 rpm per 5
minuti. Separare il plasma e stoccarlo a – 20 °C. Stabile 4
settimane.
6
PROCEDURA ANALITICA
IMPORTANTE: NON VANNO USATE PROVETTE O VIALS DI VETRO DURANTE NESSUNO
STEP PREPARATIVO.
FASE 1 : Ricostituzione del Reagente Deproteinizzante
•
Aggiungere al Reagente A – Sol. Deproteinizzante 50 µl di Reagente B – Sol. Standard interno
(Stabile 6 mesi a - 20 °C)
FASE 2 : Preparazione dei campioni e dei calibratori e controlli
In provette eppendorf dispensare in sequenza:
Calibratore
Reagente D1-D5 –
Calibratore
Campione
Controlli
Reagente A – Soluzione
Deproteinizzante (dopo
ricostituzione come alla
FASE 1)
Campione
Controlli
200 µl
200 µl
500 µl
500 µl
200 µl
500 µl
Deproteinizzare direttamente sul vortex per 20 secondi
FASE 3 : Centrifugare a 14.000 giri per 10 minuti.
FASE 4 : Prelevare 500 µl di surnatante e portare a secco (stabile1 mese a – 20 °C)
FASE 5 : Aggiungere 50 µl di Reagente C – Soluzione Diluente
Vortex per 1 minuto
FASE 6 : Centrifugare a 14.000 giri per 10 minuti.
Trasferire tutto il surnatante in vials con insert in polipropilene
INIEZIONE :
•
Iniettare 10-20 µl della soluzione nel sistema LC
N.B: il campione è stabile 2 giorni a 2-8 °C.
Release N° 002
Glucocorticoidi plasmatici in LC/MS
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Novembre 2013
GLUCOCORTICOIDI - Avvertenze
REAGENTE D1-D2-D3-D4-D5 : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 004
PREGNENOLONE
17-OH-PREGNENOLONE
17-OH-PROGESTERONE
11-DEOSSICORTISOLO
CORTISOLO
Modalità d’uso e Ricostituzione: i
Calibratori devono essere usati per
calibrare il sistema LC. Aggiungere
esattamente 1 ml di H2O di grado HPLC e
agitare delicatamente per 30 min. fino a
quando tutto il materiale non è dissolto.
Prima del campionamento rimescolare
gentilmente per assicurarne l’omogeneità.
Conservazione e stabilità: i Calibratori
sono stabili 36 mesi se conservati a 2-8
°C. Una volta ricostituiti 7 giorni se
conservati a 2 – 8 °C e 6 mesi a – 20 °C.
Non usarli dopo la data di scadenza.
Confezionamento : 5 x 1 ml
Precauzioni: questo calibratore in
matrice umana deve essere trattato con
cura e considerato come potenzialmente
infettivo.
LIV. 1
(ng/ml)
0,04
0,06
0,06
0,06
2,7
LIV. 2
(ng/ml)
0,2
0,7
0,7
0,5
31,5
LIV. 3
(ng/ml)
0,24
0,9
0,8
0,7
42,0
LIV. 4
(ng/ml)
1,3
4,7
4,6
3,7
221,3
LIV. 5
(ng/ml)
2,6
12,9
10,3
7,3
536,1
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova RRHD Eclipse Plus C18 (50 x 2,1 mm, 1,8 um), termostatata a 50
°C Disconnettere il detector e far passare una soluzione di Metanolo : Acqua (80 : 20 v/v) al flusso di
300 ul / minuto per 20 minuti. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con una
soluzione di Fase Mobile M1 : Fase Mobile 2 (50 : 50 v/v) al flusso di 400 ul / minuto per 30 minuti.
Effettuare due iniezioni di Acqua di grado HPLC prima di procedere con la serie analitica.
NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è > 25°C si consiglia di conservare a 2-8°C la Fase Mobile fra una seduta
analitica e l’altra.
PULIZIA DELLA COLONNA
Lavare con una soluzione contenente Metanolo : Acqua (80 : 20 v/v) al flusso di 300 ul / minuto per 10
minuti. La colonna va stoccata in una soluzione contenente Metanolo : Acqua (80 : 20 v/v).
LAVAGGIO AGO DI INIEZIONE
Lavare con una soluzione contenente Metanolo : Acqua (80 : 20 v/v).
8
SETTAGGIO DEI FLUSSI
GRADIENTE
Tempo (min)
% M1 (POMPA A)
% M2 (POMPA B)
Flusso (µl/min)
0
75
25
600
0.38
75
25
600
5.50
0
100
600
5.90
0
100
600
6.00
75
25
600
7.50
75
25
600
Frammentazioni (ottimizzate su AB SCIEX QTRAP® 4500)
Analita
ENERGIA DI
COLLISIONE
Q1
Q3
11-Deossicortisolo
347,1
97
27
17-OH-Pregnenolone
297,2
105
50
17-OH-Progesterone
331
109
27
Cortisolo
363,1
121
30
Pregnenolone
299,1
159,2
27
ACCESSORI E CONSUMABILI
CODICE
DESCRIZIONE
CONFEZIONE
LC71016
Calibratore plasmatico per Glucocorticoidi
LC72317
Controllo plasmatico per Ormoni steroidei – Livello 1
LC72318
Controllo plasmatico per Ormoni steroidei – Livello 2
LC72319
Controllo plasmatico per Ormoni steroidei – Livelli 1 e 2
SK71010
Starter kit Glucocorticoidi
Colonna analitica RRHD Eclipse Plus C 18 (50 x 2.1 mm. 1.8
um)
Vial di vetro da 2 ml con tappo a vite
1 x 100 Pz
Riduttori di volume in polipropilene per vials da 2 ml
1 x 100 Pz
Z959757902
S29057U
S24722
9
5 x 2 x 1 ml
5 x 1 ml
5 x 1 ml
2 x 5 x 1 ml
1 Pz
1 Pz
BIBLIOGRAFIA:
Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography-thermospray mass
spectrometry using stable isotope dilution
Hiromi Shibasaki, Takashi Furuta, Yasuji Kasuya
Steroid Hormone Analysis by Tandem Mass Spectrometry
Steven J. Soldin and Offie P.Soldin
Quantification of anabolic hormones and their metabolites in bovine serum and urine by liquid
chromatography-tandem mass spectroscophy
R. Draisci, L. Palleschi, E. Ferretti, L.Lucentini, P. Cammarata
Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionspray mass
spectrometry
V. Cirimele, P.Kintz, J.P. Goullè, B. Ludes
A Confirmatory HPLC-MS/MS Method for Ten Synthetic Corticosteroids in Bovine Urines, JOURNAL
OF MASS SPECTROMETRY
S. Rhea Savu, L. Silvestro, A. Haag and F. Sorgel, VOL. 31, 1351-1363 (1996).
Automated solid-phase extraction for concentration and clean-up of female steroid hormones prior
to liquid chromatography–electrospray ionization–tandem mass spectrometry.
B. Alvarez Sanchez, F. Priego Capote, J. Ruiz Jimenez, M.D. Luque de Castro. An approach to lipidomics,
Journal of Chromatography A, 1207 (2008) 46–54.
Detection, quantification and confirmation of anabolic steroids in equine plasma by liquid
chromatography and tandem mass spectrometry
Fuyu Guan, Cornelius E. Uboh, Lawrence R. Soma, Yi Luo, Jeffery Rudy, Thomas Tobin., Journal of
Chromatography B, 829 (2005) 56–68.
Liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat
plasma using selected ion monitoring,
Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy. Journal of Chromatography B, 757 (2001) 333–342.
Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography–thermospray mass
spectrometry using stable isotope dilution,
Ashok Marwah, Padma Marwah, Henry Lardy, Journal of Chromatography B, 692 (1997) 7–14
10
GLUCOCORTICOIDI PLASMATICI
( Cromatogrammi di Riferimento )
.
.
3.
3.
3.
2.
2.
2.
2.
2.
1.
1.
1.
1.
1.
80
60
40
20
0
3.
3.
3.
3.
2.
2.
2.
2.
2.
1.
1.
1.
1.
1.
8.
6.
4.
2.
0
Fig. 1 :
1
1
2
2
3
Time
3
4
4
5
Calibratore Livello 1
R.T. 2.86 CORTISOLO
R.T. 3.27 DEOSSICORTISOLO
R.T. 3.77 17-OH-PROGESTERONE
R.T. 3.8 17-OH-PREGNENOLONE
R.T. 4.37 PREGNENOLONE
5
6
0
0
Fig. 2 :
11
1
1
2
2
3
Time
3
4
4
5
Calibratore Livello 5
R.T. 2.86 CORTISOLO
R.T. 3.27 DEOSSICORTISOLO
R.T. 3.77 17-OH-PROGESTERONE
R.T. 3.8 17-OH-PREGNENOLONE
R.T. 4.37 PREGNENOLONE
5
6