Immunosoppressori su sangue intero in LC-MS – Cod. LC75110
(Acido Micofenolico, Tacrolimus, Sirolimus, Everolimus, Ciclosporina A)
INTRODUZIONE
Gli immunosoppressori sono farmaci usati per il controllo di gravi manifestazioni allergiche, malattie
autoimmuni e malattie correlate ai trapianti. Alcuni farmaci presentano un effetto diffuso sul sistema
immunitario, mentre altri agiscono su uno specifico bersaglio.
I principali farmaci immunosoppressori utilizzati sono l’acido Micofenolico, la Ciclosporina A, il
Tacrolimus, il Sirolimus e l’Everolimus.
L’Acido Micofenolico ( Mofetil o MPA ) è un potente immunosoppressore che inibisce in modo
reversibile l’enzima Inosina-monofosfato deidrogenasi Tipo 2 coinvolto nella sintesi della guanosina.
Poiché il modo d’azione dell’MPA differisce dalla Ciclosporina, dal Tacrolimus e dal Sirolimus, può
essere co-prescritto come parte di un pannello farmacologico.
L’ MPA è metabolizzato tramite glucuronazione per formare un metabolita inattivo (MPAglucuronide) e anche un metabolita minore (MPA-acil-glucoronide).
La Ciclosporina A è il principio attivo che influenza la risposta immunitaria dell’individuo. Come gli
altri, tale farmaco immunosoppressore è il prodotto naturale di alcuni miceti, ed è il principale agente
terapeutico impiegato per bloccare il rigetto di trapianto allogenico; esplica la sua funzione
essenzialmente bloccando la trascrizione dei geni delle citochine nei linfociti T.
Anche il Tacrolimus (anche noto come FK-506) è un farmaco immunosoppressore utilizzato
soprattutto nei trapianti d'organo per ridurre l'attività del sistema immunitario del paziente e di
conseguenza il rischio di rigetto.
Ha caratteristiche simili alla Ciclosporina, ma è molto più potente a parità di volume. Come la
Ciclosporina ha un ampio spettro di interazioni contrarie, fra cui quella con il pompelmo che
aumenta la concentrazione del farmaco nel plasma sanguigno.
È stato anche usato in preparazioni topiche per il trattamento di gravi dermatiti.
Sirolimus ed Everolimus stanno raccogliendo sempre maggiori consensi nella gestione del
trapianto renale in quanto rappresentano una strategia ideale per ridurre l’utilizzo di inibitori della
calcineurina nei pazienti a basso rischio immunologico.
1
Tali farmaci sembrano essere associati ad un minor rischio di ipertensione e intolleranza al glucosio.
Nonostante siano caratterizzati da una minore nefrotossicità rispetto agli inibitori della calcineurina,
essi potrebbero potenziare la tossicità renale della Ciclosporina e richiedono dunque un
monitoraggio costante della funzionalità renale.
L’uso del Sirolimus e dell’Everolimus deve essere evitato nel periodo perioperatorio in quanto la loro
somministrazione
potrebbe
causare
un
grave
ritardo
nella
cicatrizzazione
delle
ferite.
Il bilancio rischio/beneficio di una terapia continuativa con questi farmaci, nei pazienti che
sviluppano
un’iperlipidemia
refrattaria
al
trattamento,
andrebbe
attentamente
rivalutato.
Il monitoraggio terapeutico di tali farmaci è essenziale a causa del rischio di effetti tossici quali
anemia, leucopenia e trombocitopenia.
EUREKA srl – LAB DIVISION
VAT N° 01547310423
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www.eurekaone.com
Head Quarter:
Via Enrico Fermi 25
60033 Chiaravalle (AN) ITALY
Tel. +39 071 7450790
Fax + 39 071 7496579
Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La
dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta.
Release N° 005
Immunosoppressori su sangue intero in LC/MS
2
Febbraio 2013
CARATTERISTICHE DEL KIT
Principio del metodo :
Il presente metodo consente di determinare gli Immunosoppressori su sangue intero dopo una semplice
deproteinizzazione e lettura in LC-MS.
Recupero del Metodo :
> 98 %
Sensibilità del Metodo :
Acido Micofenolico
0,1 mg/l
Tacrolimus
0,1 ng/ml
Sirolimus
0,1 ng/ml
Everolimus
0,1 ng/ml
Ciclosporina A
1,0 ng/ml
CV% :
Acido Micofenolico
5.38%
Tacrolimus
5.92%
Sirolimus
5.50%
Everolimus
5.85%
Ciclosporina A
5.08%
Range dinamico del Metodo :
Acido Micofenolico
0,1 – 50 mg/l
Tacrolimus
0,5 – 5.000 ng/ml
Sirolimus
0,5 – 5.000 ng/ml
Everolimus
0,5 – 5.000 ng/ml
Ciclosporina A
1 – 50.000 ng/ml
Range terapeutico:
Acido Micofenolico
4 – 15 mg/l
Tacrolimus
1 – 50 ng/ml
Sirolimus
1 – 50 ng/ml
Everolimus
1 – 50 ng/ml
Ciclosporina A
10 – 2000 ng/ml
Tutti i reagenti sono pronti all’uso e stabili 3 anni a 2 –
Contenuto della Confezione :
8 °C, eccetto il Reagente A ed il Reagente B che
vanno stoccati a – 20 °C.
Reagente A – Soluzione Deproteinizzante + Standard Interno, 1 x 40 ml
Reagente B - Standard Interno, 1 x 500 µl
Stabile 6 mesi a –20°C
Reagente B1 – Deproteinizzante ricostituito, 1 x 10 ml
Reagente C1 – Calibratore liofilo su sangue intero – Livello 1, 1 x 1 ml
E’ un flaconcino vuoto nel quale
ricostituire il Deproteinizzante
come sotto riportato.
Vedi Avvertenze
Reagente C2 – Calibratore liofilo su sangue intero – Livello 2, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente C3 – Calibratore liofilo su sangue intero – Livello 3, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente C4 – Calibratore liofilo su sangue intero – Livello 4, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente C5 – Calibratore liofilo su sangue intero – Livello 5, 1 x 1 ml
Vedi Avvertenze
Reagente M1 – Fase Mobile M1 (per SPE online), 2 x 500 ml
Reagente M2 – Fase Mobile M2 (per colonna analitica), 1 x 500 ml
Dotazione strumentale minima richiesta :
Strumento LC-MS triplo quadrupolo (modalità MRM)
Valvola Divert a 6 vie
Interfaccia ESI (+)
Pompa binaria
Loop 100 µl
Computer gestionale
Provetta con anticoagulante EDTA
Stabile per circa 4 settimane a 2 – 8 °C o 4 mesi a –
20 °C.
Modalità di prelievo ematico :
3
PROCEDURA ANALITICA:
FASE 1 : Preparazione dei campioni
Dispensare 10 µl di Reagente B – Standard Interno e 5 ml di Reagente A – Sol. Deproteinizzante + Standard
Interno nel flacone vuoto del Reagente B1 – Deproteinizzante ricostituito.
N.B.: il flaconcino vuoto (Reagente B1) va utilizzato per le successive dispensazioni del Reagente A +
Reagente B.
Una volta preparata la Soluzione Deproteinizzante (Reagente B1) è stabile 1 mese a –20 °C e 14 giorni a 2-8
°C.
Vortex per 5 secondi
In provette tipo eppendorf dispensare in sequenza.
Calibratore
Reagente C – Calibratore liofilo
Campione
Controlli
Reagente B1 (come preparato in
precedenza)
Campione
Controlli
100 µl
100 µl
300 µl
300 µl
100 µl
300 µl
Al vortex per 30 secondi
FASE 2 : Centrifugare a 14.000 rpm per 10 minuti
FASE 3 : Prelevare il surnatante
INIEZIONE :
•
Iniettare 100 µl della soluzione nel sistema LC
Release N° 005
Immunosoppressori su sangue intero in LC/MS
4
Febbraio 2013
Immunosoppressori su sangue intero - Avvertenze
REAGENTE C1-C2-C3-C4-C5 : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 007
LIVELLI 1
Acido Micofenolico (ug/mL)
Tacrolimus (ng/mL)
Sirolimus(ng/mL)
Everolimus(ng/mL)
Ciclosporina A(ng/mL)
Modalità d’uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per
calibrare il sistema LC. Aggiungere esattamente 1 ml di H2O di grado
HPLC e agitare delicatamente per 30 min. fino a quando tutto il materiale
non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per
assicurarne l’omogeneità.
Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se
conservati a - 20 °C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 – 8
°C e 1 mese a – 20 °C. Non usarli dopo la data di scadenza.
Confezionamento : 5 x 1 ml
Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato
con cura e considerato come potenzialmente infettivo.
0
0
0
0
0
2
3
4
5
1.9
2.0
2.8
2.3
52.6
3.3
4.5
6.5
5.1
71.6
6.4
9.9
15.8
11.0
179.0
9.0
18.2
30.6
22.6
362.7
CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA
Installare la colonna analitica nuova PURSUIT XRs C18 2 mm x 30 mm termostatata a 60 °C. Disconnettere
il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H2O : Metanolo ( 20 : 80 v/v ) al flusso di 300 µl / minuto.
Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile M2 al flusso di 400 µl / minuto
e scaricare i primi 30 ml.
NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase.
Se la T Amb del Laboratorio è > 25°C si consiglia di conservate a 2-8°C la Fase Mobile fra una seduta
analitica e l’altra.
Il sistema lavora in SPE ONLINE (colonna monolitica RP C18 2,5 cm x 4,6mm) con la Fase Mobile M1.
PULIZIA DELLA COLONNA
Disconnettere il detector. Flussare una soluzione di H2O : Metanolo ( 20 : 80 v/v )
scaricandola.
per 30 minuti
LAVAGGIO SIRINGA AUTOCAMPIONATORE
Lavare la siringa e dell’ago del campionatore, prima e durante di ogni seduta analitica, con Metanolo.
PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE
SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE
PARAMETRI LC
500 µl/minuto
400 µl/minuto
Flusso di lavoro consigliato SPE online (Fase Mobile M1)
Flusso di lavoro consigliato colonna analitica (fase Mobile M2)
ANALITA
PARENT ION
+
Acido Micofenolico
321.0 (H )
+
+
+
+
+
+
Tacrolimus
826.4 (Na ) 821.4 (NH4 )
Sirolimus
936.4 (Na ) 931.4 (NH4 )
Everolimus
980.4 (Na ) 975.4 (NH4 )
+
Ciclosporina A
+
1224.7 (Na ) 1219.7 (NH4 )
5
Divert Valve
SPE ONLINE
Tempo (min)
Posizione Valvola
0-1
Load
1-4
Inject
4-5
Load
6
Immunosoppressori su sangue intero
(Cromatogrammi/Spettri di riferimento LC-MS)
S p e c tru m 1 A
B P : 1 1 1 2 ,8
C y A S _ 1 0 0 .x m s 1 1 1 3 .0 (1 2 2 4 .7 > 1 1 1 2 .8 [-4 6 .5 V ]) F ilte r e d
1 2 2 4 .7 > 1 1 1 2 . 8 [ 1
- 4A6 .5 V ]
k C o u n ts
1 75
100%
3 .0 1 8 m in , S c a n : 4 3 9 5 , 1 2 2 4 .7 > 1 1 1 2 . 8 [ - 4 6 . 5 V ] , R IC : 6 0 7 5 4
1 1 1 2 .8
60754
1 50
75%
3.406min
CyA
11273 RF
1 25
1 00
50%
75
50
25%
25
0
0%
1
Fig. 1 :
2
3
Campione su sangue intero
R.T. 3.40 CICLOSPORINA A
4
5
1112
m i n u te s
Fig. 2 :
100 ng/ml
7
11 1 3
Spettro di Massa della Ciclosporina A
Transizione 1224.7 > 1112.8
m /z
Immunosoppressori su sangue intero
(Cromatogrammi/Spettri di riferimento LC-MS)
M P A S _ 1 0 0 .x m s 3 0 2 .9 (3 2 1 .0 > 3 0 2 .9 [- 1 0 .5 V ]) F ilte r e d
3 2 1 .0 > 3 0 2 .9 [-1 0 .5 V ]
M C o u n ts
1A
1 0 0%
S p e c tru m 1 A
B P : 3 0 2 ,9
3 . 1 0 8 m i n , S c a n : 4 5 2 4 , 3 2 1 .0 > 3 0 2 . 9 [- 1 0 . 5 V ] , R I C : 1 , 4 1 0 e + 7
3 0 2 .9
1 ,4 1 0 e + 7
30
3.089 min
MPA
2,497e+6 RF
7 5%
20
5 0%
10
2 5%
0
0%
1
Fig. 3 :
2
3
4
Campione su sangue intero
R.T. 3.09 ACIDO MICOFENOLICO
5
30 2
m i n u te s
Fig. 4 :
100 ng/ml
8
303
Spettro di Massa dell’Acido Micofenolico
Transizione 321.0 > 302.9
m /z
Immunosoppressori su sangue intero
(Cromatogrammi/Spettri di riferimento LC-MS)
R A D _ 2 S _ 1 0 0 .x m s 3 8 9 .1 (9 8 0 .4 > 3 8 9 .1 [- 4 6 .5 V ]) F ilte r e d
9 8 0 . 4 > 3 8 9 . 1 [ -14A6 . 5 V ]
M C o u n ts
3 .0
10 0%
S p e c tru m 1 A
B P : 3 8 9 ,1
3 . 2 4 4 m i n , S c a n : 4 7 2 6 , 9 8 0 .4 > 3 8 9 . 1 [- 4 6 . 5 V ] , R I C : 2 , 5 3 8 e + 6
3 8 9 .1
2 ,5 3 8 e + 6
3.229min
RAD_2
287963 RF
2 .5
7 5%
2 .0
1 .5
5 0%
1 .0
2 5%
0 .5
0 .0
0%
1
Fig. 5 :
2
3
Campione su sangue intero
R.T. 3.23
EVEROLIMUS
4
5
388
m i n u te s
Fig. 6 :
100 ng/ml
9
38 9
Spettro di Massa dell’Everolimus
Transizione 980.4 > 389.1
390
m /z
Immunosoppressori su sangue intero
(Cromatogrammi/Spettri di riferimento LC-MS)
S R L S _ 1 0 0 .x m s 4 0 9 .0 (9 3 6 .4 > 4 0 9 .0 [- 4 6 .5 V ]) F ilte r e d
9 3 6 . 4 > 4 0 9 . 0 [ -14A6 . 5 V ]
M C o u n ts
S p e c tru m 1 A
B P : 4 0 9 ,1
10 0%
3 . 2 3 9 m i n , S c a n : 4 7 2 3 , 9 3 6 .4 > 4 0 9 . 0 [- 4 6 . 5 V ] , R I C : 2 0 5 8 0 5
4 0 9 .1
205 805
3.238min
SRL
201873 RF
1 .5
7 5%
1 .0
5 0%
0 .5
2 5%
0 .0
0%
1
Fig. 7 :
2
3
Campione su sangue intero
R.T. 3.24
SIROLIMUS
4
5
408
m i n u te s
Fig. 8 :
100 ng/ml
10
409
Spettro di Massa del Sirolimus
Transizione 936.4 > 409.0
410
m /z
Immunosoppressori su sangue intero
(Cromatogrammi/Spettri di riferimento LC-MS)
T R L S _ 1 0 0 .x m s 6 1 6 .2 (8 2 6 .4 > 6 1 6 .2 [-3 4 .0 V ]) F ilte r e d
8 2 6 . 4 > 6 1 6 . 2 [ -13A4 . 0 V ]
M C o u n ts
80
1 0 0%
S p e ctru m 1 A
B P : 6 1 6 ,2
3 . 2 4 1 m i n , S c a n : 4 7 2 1 , 8 2 6 .4 > 6 1 6 . 2 [- 3 4 . 0 V ] , R I C : 6 , 3 8 5 e + 7
6 1 6 .2
6 ,3 8 5 e + 7
3.241 min
TRL
7,388e+6 RF
70
60
7 5%
50
40
5 0%
30
20
2 5%
10
0
0%
1
Fig. 9 :
2
3
Campione su sangue intero
R.T. 3.24 TACROLIMUS
4
5
616
m i n u te s
Fig. 10 :
100 ng/ml
11
Spettro di Massa del Tacrolimus
Transizione 826.4 > 616.2
617
m /z