MONITORAGGIO EPIDEMIOLOGICO
DELLE INFEZIONI POLMONARI
IN PAZIENTI FC
Silvia Campana
Centro Fibrosi Cistica, Dipartimento di Pediatria
Università di Firenze
PROTOCOLLI PER IL CONTROLLO
DELLE INFEZIONI NEI CENTRI FC
Raccomandazioni del Cystic Fibrosis Trust’s Control of Infection Group, UK
(J.W. Govan 2001)
•Protocollo delle infezioni nel Day Hospital del Centro FC della Toscana
(F. Festini, G. Taccetti, S. Campana, G. Mergni)
•Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis:
Microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent
patient-to-patient transmission. (Saiman et al. 2003 Am J Infect Control)
PROTOCOLLO PER IL
CONTROLLO DELLE INFEZIONI
NEL CENTRO FC DI FIRENZE
1) Sommario delle evidenze disponibili al momento
2) Raccomandazioni per:
sorveglianza epidemiologica
limitare la diffusione delle infezioni
limitare le diffusioni crociate
3)Misure di segregazione
(misure dirette ad impedire il contatto tra pazienti colonizzati e non)
PROTOCOLLO PER IL CONTROLLO
DELLE INFEZIONI
NEL CENTRO FC Di FIRENZE
4)Misure di disinfezione :
eliminazione della contaminazione batterica da locali
dispositivi per spirometria e aerosol terapia
5) Misure di diluizione:
aereazione locali
limitare l’affollamento
lavaggio delle mani
6) Norme comportamentali
norme da osservare strettamente per i pazienti durante la loro permanenza al centro
MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI
RESPIRATORIE IN FIBROSI CISTICA
• analisi microbiologica di campioni respiratori (ogni tre mesi)
• valutazione della presenza di specifici anticorpi circolanti
anti-P. aeruginosa o anti-B. cepacia per evidenziare il
passaggio da colonizzazione superficiale a cronica
Anticorpi anti-P. aeruginosa
• esecuzione di controlli sull’ambiente e sul personale ospedaliero
• monitoraggio delle infezioni con tipizzazione molecolare di intraspecifica tutti
i ceppi batterici isolati
MONITORAGGIO DELLE INFEZIONI
OSPEDALIERE: METODI DI
TIPIZZAZIONE INTRASPECIFICA
Tipizzazioni fenotipiche (basate su caratteristiche esterne):
sierotipizzazione
sierotipo 1
tipizzazione fagica
P. aeruginosa
tipizzazione piocinica
sierotipo 2
Tipizzazione genomica
random amplification of polimorphic DNA (RAPD)
elettroforesi a campo pulsato (PFGE)
Multilocus restriction typing (MRLT)
BOX-PCR Fingerprinting
indispensabile nel caso di batteri altamente adattabili e variabili
quali quelli isolati da pazienti FC
TIPIZZAZIONE GENOMICA
INTRASPECIFICA
•L’analisi con endonucleasi di restrizione (REA) permette lo studio dell’intero
genoma di un organismo
•Permette di evidenziare piccolissime differenze genetiche fra organismi anche
quando non si esprimono a livello del fenotipo
•con tale metodica si riesce all’interno della stessa specie (tipizzazione
intraspecifica) a distinguere i singoli microrganismi
P. aeruginosa
(diversi per virulenza, patogenicità, etc)
DNA
DNA
TIPIZZAZIONE BATTERICA
INTRASPECIFICA CON PFGE
•I frammenti di DNA prodotti dagli enzimi di restrizione (15-20) vengono separati
tramite elettroforesi
•Data la grandezza dei frammenti di DNA così generati (da 0,2 a 9000 kb ) si
utilizza una particolare tecnica elettroforetica: elettroforesi a campo pulsato
(PFGE) in cui gli impulsi elettrici generati sono variabili in intensità e direzione
TIPIZZAZIONE BATTERICA
INTRASPECIFICA CON PFGE
•Tale tecnica induce i frammenti di DNA a riorientarsi più volte
nella migrazione verso una carica positiva che varia di posizione.
•La risoluzione delle bande risulta notevolmente aumentata così
da rendere più semplice il confronto.
•Si possono separare frammenti di DNA da 10 a 100 volte maggiori
di quelli separabili con l’elettroforesi convenzionale
DNA
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER P. AERUGINOSA
Fonti ambientali:
diffuso in natura, nel suolo, nell’acqua le piante
Portatori:
colonizza la cute, l’orecchio esterno, l’intestino crasso di soggetti sani,
infezioni gravi negli immunocompromessi e pazienti con fibrosi cistica.
Fonti nosocomiali:
soluzioni di lavaggio, disinfettanti, lavandini, endoscopi, piscine per
fisioterapia, spirometri.
La maggior parte dei serbatoi è associata all’UMIDITA’.
Ceppi epidemici di P. aeruginosa
in FC
• 55 bambini Liverpool
(Lancet 1996; 348: 639-42)
• 22 adulti Manchester
(Lancet 2001; 358: 557-58)
• 5 pazienti Liverpool
(Lancet 2001; 358: 558-60)
1 2 3 4 5 6
Profilo genetico di ceppi di
P. aeruginosa isolati da
pazienti FC
IMPORTANZA DI UNA
SORVEGLIANZA
BATTERIOLOGICA CON PFGE
Sono stati analizzati ceppi di P. aeruginosa provenienti da 80 pazienti che si sono
dimostrati genotipicamente diversi eccetto per 5 coppie di pazienti che a due a due
mostrano ceppi con lo stesso profilo genetico.
ANALISI CON PFGE DI P.AERUGINOSA
a b a b a b a b
1
2
3
4
a
b
5
a
b a
6
b
7
8
•Ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti FC (1-7) analizzati con
elettroforesi a campo pulsato (PFGE). Fenotipi diversi delle colonie:
mucoidi e rugose (a e b) sono isolati dallo stesso paziente. N° 8 mostra un
ceppo di isolamento ambientale.
P. aeruginosa: crescita dello stesso ceppo o ricolonizzazione?
* marker
* A B C B DA * A A A B
A B A C B B * DB AB AB
Analisi con PFGE di ceppi di P. aeruginosa ottenuti da episodi isolati di
colonizzazione in 16 pazienti FC
%
100%
90%
80%
70%
60%
ricolonizzazione
ricrescita
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Lillquist
Munck
Gibson
Taccetti
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER S. AUREUS
•Attualmente tutti i ceppi di S. aureus producono ß-lattamasi
•Negli anni 60 in seguito all’uso di meticillina è stato isolato il primo ceppo di MRSA
•La prevalenza di isolamento di MRSA è progressivamente aumentata in abito
nosocomiale (terapie intensive) ed anche nei pazienti con FC
•la trasmissione avviene per contatto diretto paziente-paziente o indiretto attraverso
individui sani compreso il personale ospedaliero.
ANALISI CON PFGE DI MRSA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ceppi di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti analizzati con PFGE
isolati da 9 pazienti FC
Campana S., et al J of Cystic Fibrosis. 2004.
B. cepacia complex e genomovars :
concetti in espansione
Genomovars
I (B.cepacia)
•
II (B. multivorans)
III (B. cenocepacia)
IV (B. stabilis)
V (B. vietnamiensis)
VI (B. dolosa)
VII (B. ambifaria)
VIII (B. anthina)
IX (B. pyrrocinia)
• almeno 9 specie geneticamente
diverse
• all’interno del “complex”, se i test
biochimici consentono
l’identificazione, si attribuisce al
genomovar un nome specifico (ad
es. genomovar II --> B. multivorans),
altrimenti viene usato il termine
genomovar seguito da numerazione
romana.
The present species concept
(Wayne et al. 1987, Ursing et al. 1995)
•"... The phylogenetic definition of a species generally would
include strains with at least 50 - 70% DNA-DNA relatedness ...”
•“...It is recommended that a distinct genospecies that cannot
be differentiated from another genospecies on the basis of any
known phenotypic property not be named until they can be
differentiated by some phenotypic property...”
•La definizione filogenetica di specie prevede che si
possano includere nella stessa specie organismi
che abbiano almeno il 70% di omologia del DNA
•I vari genomovar di B. cepacia hanno un grado di
omologia inferiore al 70% pertanto appartengono a
specie diverse
POTENZIALI FONTI DI INFEZIONI
PER B. CEPACIA
•Gli ultimi studi tassonomici identificano 9 genomovar o specie genomiche
(omologia genetica maggiore del 70% analizzata con studi di ibridazione del
DNA)
•Genomovar VI si isola solo da pazienti FC
•I genomovar I, II, III, IV, VII, VIII e IX sono isolati da fonti umane ed
ambientali (isolamento prevalente dal suolo, campi di cipolle, rizosfera del
mais)
•Uso in agricoltura quale biopesticida e fertilizzante.
ANALISI CON PFGE DI B. CEPACIA
PAZIENTI FC
PAZIENTI ONCOLOGICI
Profilo genetico di ceppi di B. cepacia isolati da pazienti
FC(1-6) e da pazienti oncologici (7-8-9) eseguita con PFGE
PREVALENZA DI B. CEPACIA
COMPLEX (%)
Genomovar
I (B.cepacia)
II (B. multivorans)
III (B. cenocepacia)
IV (B. stabilis)
V (B. vietnamiensis)
VI (B. dolosa)
VII (B. ambifaria)
VIII (B. anthina)
IX (B. pyrrocinia)
Canada*
USA *
(n = 445) (n = 606)
0.2
9.7
82.9
3.8
1.6
-
* Speert et al (2002), LiPuma et al (2001),
Campana et al Pediatr. Pulmonol (2003)
2.6
37.8
50.0
0.2
5.1
2.0
0.7
-
Italy
(n = 178)
12.3
5.6
63
7.8
0.6
0.6
0.6
4.5
RISULTATI DELL’ANALISI CON PFGE
( 133 ceppi di B. CEPACIA ISOLATI DA
18 Centri FC Italiani )
57 (43%) degli isolati producono un profilo genetico
singolo
76 (57%) degli isolati sono divisi in 19 gruppi
6 gruppi contengono 2 ceppi– ogni coppia proviene dallo stesso Centro FC
8 gruppi contengono da 3 a 8 ceppi provenienti dallo stesso centro
5 gruppi contengono isolati provenienti da più di un centro
Scelta della tecniche di
tipizzazione genetica
studi epidemiologici su bassa scala
random amplification of polimorphic DNA (RAPD)
elettroforesi a campo pulsato (PFGE)
studi epidemiologici su larga scala
Multilocus restriction typing (MRLT)
BOX-PCR Fingerprinting
Tecniche di tipizzazione genetica
Symilarity %
Ceppi di B. cepacia
T. Coenye et al. J Clin Microbiol 2002
COME SI EVIDENZIA UN CLONE EPIDEMICO?
•In base al tipo di approccio metodologico si può arrivare a
conclusioni diverse
•importanza della scelta del metodo di genotipizzazione
in base al tipo di studio