Sensibilità agli antibiotici in vitro e ricerca dei geni responsabili dell’ antibioticoresistenza in ceppi di Salmonella isolati da alimenti, mangimi e animali
Maria Rosaria Carullo, Anna Giannina Perugini, Giovannina Giuliano, Mario Bartoli,
Vincenzo Caligiuri, Federico Capuano
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute, 80055 Portici (Napoli)
Introduzione
La diffusione della resistenza agli antibiotici negli ultimi anni è diventata un
fenomeno di interesse sanitario mondiale. Tale resistenza ai farmaci, spesso
dovuta a elementi genetici presenti nel DNA cromosomico, è gran parte delle
volte mediata anche dal DNA extracromosomico (es. i plasmidi), pertanto
risulta anche facilmente trasferibile.
La possibile diffusione di ceppi con un sempre maggior numero di geni di
resistenza ai farmaci potrebbe costituire uno dei principali problemi sanitari
nel prossimo futuro, considerando anche il potenziale (e in alcuni casi,
dimostrato) passaggio dei geni di resistenza dagli isolati di origine animale a
quelli di origine umana.
La Salmonella, in particolare, rappresenta ancora uno dei principali agenti
patogeni di origine alimentare per l’uomo.
Nel presente studio, ceppi di Salmonella isolati da alimenti, mangimi e
animali sono stati analizzati sia per valutare la loro sensibilità in vitro agli
antibiotici, sia per determinare la presenza di alcuni dei geni responsabili della
resistenza alle molecole più usate in medicina veterinaria e umana ma anche
per valutare la possibile differenza nel ‘profilo’ di resistenza tra i ceppi di
diversa origine.
PCR
3-5 colonie isolate su agar sono state risospese in 0.2 ml di acqua deionizzata
DNAse-Rnase free (MP Biomedicals, Germany), quindi lisate mediante bollitura,
infine centrifugate per 5’ a 13000 rpm; il surnatante recuperato è stato sottoposto
ad analisi spettrofotometrica a 260 e 280 nm.
Quattro coppie di primers (Yang S.J. et al., 2002) sono state usate per
l’amplificazione di 4 geni target simultaneamente (mtPCR, mutiplex PCR), uno dei
quali specifico per Salmonella spp., usando un GeneAmp PCR System 7700
(Applied Biosystems, USA) alle seguenti condizioni: dopo l’attivazione della Taq
di tipo Hotstart a 95° C per 10’, sono stati eseguiti 40 cicli di amplificazione (95° C
per 1’, 48°C per 30’’, 72°C per 30’’), seguiti da una extention finale di 3’ a 72°C.
Sono state, poi, eseguite altre 3 PCR (simplex-PCR) per valutare la presenza dei
geni responsabili della resistenza ai sulfamidici (Enne V et al.,2001; Perreten and
Boerlin, 2003). Al termine delle PCR, gli amplificati della mtPCR e quelli delle
simplex sono stati analizzati mediante elettroforesi rispettivamente su gel di
agarosio al 3% e al 1% (w/v) preparati in TBE 1X (Invitrogen, USA). I prodotti di
amplificazione sono stati visualizzati mediante colorazione con etidio bromuro
mediante esposizione agli UV (foto 1, foto 2).
I risultati delle analisi condotte sui ceppi isolati sono stati elaborati con il software
SPSS12.0.
Risultati
Materiale e metodi
Isolamento
Gli 89 ceppi analizzati sono stati isolati da carni fresche e lavorate, mangimi
(sfarinati e mangimi composti integrati) e da organi vari.
L’identificazione dei ceppi isolati è stata confermata mediante BBL Crystal
(Becton, Dickinson, NJ, USA), quindi gli isolati sono stati sottoposti sia ad
agglutinazione rapida su vetrino per gli antigeni somatici (O) sia ad
agglutinazione lenta in provetta per gli antigeni flagellari (H) (Difco Co.,
USA).
Sensibilità a gli antimicrobici
La sensibilità agli antibiotici è stata valutata attraverso il metodo Kirby-Bauer
su agar per: acido nalidixico, ampicillina, cefotaxime, ciprofloxacina,
gentamicina, neomicina, colistina solfato, kanamicina, streptomicima,
sulfamidici, cloramfenicolo, tetraciclina, sulfametoxazolo-trimetoprim,
amoxicillina, enrofloxacina, cefalotina.
Le zone di inibizione della crescita sono state misurate e interpretate in base
ai criteri stabiliti dal National committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M
291 bp
232 bp
Degli 89 ceppi analizzati, 87 appartengono alla sottospecie Enterica e di questi il
35.6% risultano essere Typhimurium, il 5.75% Derby e, rispettivamente, il 4.6%
London, Livingstone, Anatum, Enteritidis, Infantis.
La percentuale di isolati resistenti ai differenti antibiotici testati è riportata nella
tabella 1.
Tra gli isolati è stato possibile rilevare la presenza di numerosi ceppi caratterizzati
da resistenze multiple, infatti dei 19 isolati da organi 8 risultano resistenti ad almeno
6 delle molecole testate, dei 51 ceppi isolati da alimenti destinati al consumo
umano, 20 ad almeno 6, e dei 6 ceppi isolati da mangimi 5 risultano resistenti a
almeno due antimicrobici.
Tutti gli isolati analizzati amplificano il target specifico per Salmonella spp.(sipB/C,
232 bp). Dei ceppi isolati da animali 8 risultano resistenti all’ampicillina e di questi
4 sono positivi per uno dei due geni di resistenza cercati (PSE-1 o TEM, 132 e 291
bp rispettivamente), mentre un solo ceppo li presenta entrambi. Tra tali ceppi,
inoltre, 15 risultano resistenti ai sulfamidici, di cui 3 per sul1 e 4 per sul2.
Tra i ceppi isolati da matrici alimentari, 17 sono resistenti in vitro all’ampicillina; di
questi 2 risultano portatori di entrambi i geni di resistenza, 6 solo per PSE-1 e 13
solo per TEM. Dei ceppi suddetti, inoltre, 41 risultano resistenti ai sulfamidici, e tra
questi oltre ad essere presenti dei positivi per sul1 (9) o sul2 (9), sono stati
identificati anche tre ceppi positivi per il gene sul3.
Tra gli isolati ben 13 mostrano resistenza multipla di tipo ACSSuT; di questi 12
appartengono al sierotipo typhimurium che causa, insieme al sierotipo enteritidis, il
maggior numero di casi di salmonellosi nell’uomo. Anche tra gli isolati ACSSuT,
infine, è evidente la diffusione dei markers sul1 (11), sempre associato a cmlA/tetR
(260 bp), PSE-1 (7) e TEM (3), questi ultimi presenti anche simultaneamente (3).
N 1 2 3 L 4 5 6 N 7 8 9 L
260 bp
Numero (% ) di isolati
132 bp
Foto 1: elettroforesi (3%, agarosio/TBE 1X)
per mPCR. Tutti gli isolati sono positivi per
sipB/C (232 bp). 1,3,6: positivi per TEM(291
bp); 7,10,13: posotivi per cmlA/tetR (260 bp)
e PSE-1 (132 bp). M: 25 bp DNA step ladder
(Promega)
Foto 2: elettroforesi (1%, agarosio/TBE 1X)
della PCR per sul 1. 2, 5, 8: isolati positivi. N:
100 bp ladder (Fermentas); L: 50 bp DNA
step ladder (Promega)
MOLECOLA TESTATA
resistenti in vitro
ACIDO NALIDIXICO
41 (46,1)
AMPICILLINA
30 (33,7)
CEFOTAXIME
1(1,1)
CIPROFLOXACINA
1 (1,1)
GENTAMICINA
48 (53,9)
NEOMICINA
86 (96,6)
COLISTINA SOLFATO
89 (100)
KANAMICINA
80 (89,9)
STREPTOMICINA
89 (100)
SULFONAMIDE
68 (76)
CLORAMFENICOLO
22 (24,7)
TETRACICLINA
68 (76,4)
TRIMETOPRIM
20(22,5)
AMOXICILLINA
19 (21,3)
ENROFLOXACINA
13 (14,6)
CEFALOTINA
62 (69,7)
Tabella 1: isolati resistenti in vitro
Conclusioni
L’analisi condotta sui ceppi isolati evidenzia la diffusione di isolati di Salmonella che mostrano resistenze multiple, aventi pattern di geni di resistenza differenti.
La mPCR usata in questo studio, in particolar modo, ha permesso di valutare rapidamente la distribuzione di due dei geni responsabili della resistenza agli antibiotici β-lattamici
(TEM e PSE) in Salmonella.
Lo studio dell’evoluzione e della diffusione dei geni di resistenza, qui preliminarmente condotto, potrebbe aiutare a comprendere l’origine dei ceppi resistenti e la modalità di
trasmissione dagli alimenti di origine animale all’uomo.
Bibliografia
Enne V.I., Livermore D.M., Stephens P., Hall L.M.C., 2001. The Lancet, 357: 1325-1328; Grape M., Sundstrom L., and Kronvall G., 2003. J. Antimicrob. Chem., 52:1022-1024; National Committee for Clinical Laboratory Standards,
1999. Approved standards M7-A5: methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. NCCLS, Wayne, Pa.; Perreten V. and Boerkin P., 2003. Antimicrob. Agents Chemother., 47(3): 1169-1172;
Yang S.J., Park K.Y., Kim S.H., No K.M., Besser T.E., Yoo H.S.,Kim S.H., Lee B.K., Park Y.H., 2002. Vet. Microbiol., 86: 295-301.