Corso di interpretazione clinica degli esami ematochimici di base
Studio delle proteine plasmatiche e protidogramma
Dott.ssa C.Conticello
Catania, 11/06/2013
PROTEINE PLASMATICHE
Le proteine del plasma costituiscono un gruppo eterogeneo di proteine, con funzione specifica o
diverse funzioni e la cui concentrazione (da pochi microgrammi ad alcuni grammi per litro) è
soggetta a specifiche variazioni di concentrazione in svariate condizioni fisiologiche e patologiche.
Gli intervalli di riferimento normali per le proteine del siero sono tra 63 e 84g/L.
Tali valori non sono costanti ma differiscono per età, sesso, momento della giornata, stato di
veglia o di sonno, esercizio fisico, stagioni calde e stagioni fredde.
I livelli plasmatici fisiologici dipendono dalla sintesi, dal catabolismo, dalla diminuzione delle
proteine nei vari compartimenti corporei e da perdite esterne.
Le plasmaproteine vengono sintetizzate principalmente dal fegato, in particolare l’albumina, il
fibrinogeno e le globuline, ad eccezione delle immunoglobuline che vengono prodotte dal sistema
immunitario (plasmacellule). Contribuiscono alla sintesi anche l’intestino per le lipoproteine ed il
sistema monocito/macrofagico per alcuni fattori del complemento.
Il metabolismo delle proteine è rapido ed intenso: viene giornalmente rinnovato, in condizioni
fisiologiche, il 9% di tutte le proteine sintetizzate dal fegato ed il 10-25% di quelle circolanti.
Anche nel catabolismo gioca un ruolo fondamentale il fegato.
In condizioni fisiologiche le perdite (esterne) avvengono attraverso l’apparato gastroenterico
(tutte le proteine), il rene (selettivo), le ghiandole esocrine, l’apparato respiratorio e gli organi
genitali.
O’Connel et al, aafp 2005
PROTEINE PLASMATICHE
Vengono classificate:
in base alla funzione:
- trasporto di nutrienti (albumina, lipoproteine),
di ioni metallici (trasferrina, ceruloplasmina),
di ormoni (TBG, transcortina, RBP),
altro… (aptoglobina).
- difesa (complemento, immunoglobuline, inibitori enzimatici,
della fase acuta).
- emostasi e coagulazione ( fibrinogeno, plasmina).
Sono queste funzioni specifiche cui si associano gli effetti sull’
Equilibrio idrico (attraverso il mantenimento della pressione oncotica),
Effetto tampone (anfotere),
Funzione catalitica,
Riserva proteine corporee.
….in base alla migrazione elettroforetica (albumina, alfa1, alfa2, beta1,beta2, gamma)
proteine
PROTEINE PLASMATICHE
-in base alla migrazione elettroforetica (albumina, alfa1, alfa2, beta, gamma)
Poiché i metodi di separazione e di misurazione impiegati rispecchiano in prevalenza
aspetti molecolari, chimici, fisici o la loro funzione, un’identica sostanza viene molte volte,
a seconda delle circostanze e del metodo impiegato, denominata in diversi modi:
macroglobulina, immunoglobulina M, -globulina, glicoproteina.
E’ quindi importante lo studio delle caratteristiche strutturali, metaboliche e funzionali delle
numerose proteine del plasma e delle loro variazione genetiche.
A) Caratteristiche chimiche: proteine semplici, glicoproteine, lipoproteine
Frazionamento
Per ultracentrifugazione
(precipitazione frazionata
(massa, forma, densità,
con sali o solventi organici)
coefficiente di frizione)
Tecniche immunochimiche (nef-turb)
Immunofissazione
Metodi qualitativi
Metodi quantitativi
B) Caratteristiche chimico-fisiche: solubilità, sedimentazione, carica elettrica
Migrazione elettroforetica
Immunoelettroforesi
e. bidimensionale
Metodi quantitativi
Nella precipitazione frazionata mediante aggiunta di solfato di ammonio, si
esprime la concentrazione del sale come % DI SATURAZIONE
Le proteine del plasma possono essere così suddivise:
a) GLOBULINE (33%)
b) ALBUMINA (60%)
c) FIBRINOGENO. Presente in quantità inferiori alle prime due ed è meno
solubile. Nel siero presente solo in tracce
Frazionamento secondo Chon, ottenuto con alcool etilico a bassa
temperatura. Variando la concentrazione di etanolo e la temperatura, le
diverse proteine possono essere precipitate in differenti frazioni
Frazione I
Frazione V
fibrinogeno 60%
globulina antiemofilica (fattore VIII)
globuline insolubili a freddo
protrombina
componente C1q, C1r, C1s
Frazione II
Frazione III
gammaglobuline 95%
betaglobuline 60% (e betalipoproteine)
isoagglutinine, immunoglobuline M, alfa2 macroglobulina
protrombina e plasminogeno
Frazione IV transferrina
aptoglobina
ceruloplasmina
globulina legante gli ormoni tiroidei
alfa1antitripsina
alfa1glicoproteina
antitrombina III
componenti del Complemento
albumina 95%
alfa1glicoproteina
alfa e beta globuline
Metodi quantitativi
Immunofissazione
Tecnica di DOSAGGIO IN SITU
Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ (lastrine di agarosio)
mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte le altre bande non
fissate, permettendo l’identificazione di una banda. Si esegue su siero e su urine.
G
A
M
k
Immunofissazione su siero
λ
MIGRAZIONE ELETTROFORETICA
Le proteine sono sostanze anfotere,
cioè si possono comportare da acido, liberando
ioni H+ , o da base liberando anioni OH-.
Inoltre modificano le cariche elettriche dei loro
residui chimici ionizzabili a secondo del mezzo
in cui sono sciolte.
In soluzione sono facilmente ionizzabili e si
dissociano in ioni R-COO- (Asp, Glu) o ioni
R-NH3+ (Lys, Arg).
L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente
cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al
fluido stesso. Le particelle con carica positive si spostano verso il catodo e quelle con carica negativa verso
l'anodo.
Può essere di diversi tipi:
-libera: in un mezzo liquido
-zonale: su un supporto solido (carta, cellulosa, poliacrilamide, agarosio)
MIGRAZIONE ELETTROFORETICA
anodo
-
catodo
*
le proteine sono evidenziate mediante una colorazione specifica, e la loro
composizione percentuale è misurata mediante densitometria.
+
MIGRAZIONE ELETTROFORETICA
Da ricordare che:
•L’intensità del picco non corrisponde alla quantità delle proteine perché ogni colorante
possiede affinità diversa per le diverse proteine
•La proteina che principalmente contribuisce ad una data frazione non è la sola che migra
in quella zona, ad eccezione dell’albumina, che può essere considerata unica.
L’elettroforesi delle proteine del siero, su acetato di
cellulosa o su agarosio, e’caratterizzata da una
ottimale separazione e risoluzione di 7 bande
elettroforetiche.
CLASSIFICAZIONE DELLE PROTEINE
SELEZIONATE IN BASE ALLA MOBILITA’
ELETTROFORETICA
O’Connel et al, aafp 2005
1. banda della prealbumina
2. banda dell’albumina
3. banda 1
1-antitripsina
1-glicoproteina acida
1-antichimotripsina
1-lipoproteina (HDL)
1-fetoproteina4.
4. banda 2
2-macroglobulina (anodica)
aptoglobina (catodica)
ceruloplasmina
proteina legante la vit.D (globulina GC)
5. banda 1
transferrina
1-lipoproteine (LDL)
6. banda 2
C3
2-microglobulina
emopessina
fibrinogeno (talvolta in zona )
7. zona 
immunoglobuline
(IgM ed IgA talvolta in zona 2)
globuline
prealbumina
Proteine totali
Albumina
Globuline
α1
α2
β1
β2
γ1
γ
2
Concentrazione
35-50
0.6-1.5
0.4-3.4
2.1-4.9
2.1-4.9
2.5-7.1
50-64
2.1-4.6
6.1-12
6-10.1
2.7-6.5
11.7-19.90
α1globuline
AT-III
Fibrinogeno
Transcortina
Fattore IX
β2 microglobulina
Fattori della
coagulazione II, VII,
X
Aptoglobina
Plasminogeno
Immunoglo
buline
ceruloplasmina
Fattore V
Fattore XI
Transferrina
C8, C1q
g/L
Percentuale
Proteine
Emopessina
C3, C6, C7
Proteina C
reattiva
PROTEINE PLASMATICHE
Gli intervalli di riferimento normali per le proteine del siero sono tra 63 e 84g/L.
Valori> 90: iperproteinemia, valori < 60 : ipoproteinemia
Aumento :
emoconcentrazione, gammopatie mono e policlonali.
Diminuzione :
Insufficiente apporto
Digiuno prolungato,dieta ipoproteica.
Ridotto assorbimento
Vomito, diarrea, s.da malassorbimento
Perdita
S.nefrosica, enteropatie, ustioni estese, emorragie
Ridotta sintesi
Epatopatie acute e croniche
Ipercatabolismo
Ipertiroidismo, febbre,infezioni acute, traumi, interventi chirugici, neoplasie
Emodiluizione
Emorragie profuse, scompenso cardiaco congestizio, terapie idratanti
Condizioni
patologiche e
modifiche delle
proteine sieriche
Albumina
Globuline
α1
Sindrome nefrosica
↓
Epatopatia cronica
↓
Infiammazione
↑
Anemia
sideropenica
α2
β
γ
↑
↑
↓
↓
↑
↑
↓
↑
Malattie
autoimmuni
(policlonali)
↑
Gammopatie
monoclonali
↑
AIDS (policlonali)
↑
Enteropatia
essudativa
↓
↓
Proteine della fase acuta
Positive
Α1-antitripsina, -chimotripsina, -GP acida;
Ceruloplasmina; aptoglobina, C3 e C4, ATIII, Ig
Negative
Albumina;
Transferrina;
Pre-albumina
Indicazioni cliniche:
Presenza di malattie infiammatorie
Diagnosi differenziale tra patologie infiammatorie
croniche
Follow-up post-chirurgico nei pazienti a rischio post
operatorio infettivo
Follow-up dei pazienti onologici
SINGOLE FRAZIONI PROTEICHE
PREALBUMINA o TRANSTIRETINA: sintesi in parte nel fegato, in parte anche nella
retina ed in altri tessuti. E’ il vettore sia per la tiroxina che per la proteina legante il
retinolo. E’ una proteina negativa della fase acuta.
ALBUMINA:
MW 66,5 kDa. Il dosaggio dell’albumina è un ottimo indice della
funzionalità epatica. E’ una proteina di trasporto (bassa specificità ed affinità, farmaci, bilirubina,
acidi grassi, metalli ed ormoni). Contribuisce alla pressione osmotica. La concentrazione plasmatica
dell’albumina diminuisce nei processi infiammatori, ustioni, epatopatie e nefropatie, malassorbimento,
enteropatie protido-dispersive.
Edema, ipocalcemia, alterazione nei livelli di sostanze trasportate
BANDA  1  1-ANTITRIPSINA: GP. In circolo costituisce la maggiore componente delle
proteasi circolanti. E’ sintetizzata dagli epatociti in forma immatura, dai macrofagi
ma anche in altri tessuti (rene, pancreas, stomaco, intestino, milza, surrene).
 1-ANTICHIMOTRIPSINA: GP. Inibisce la chimotripsina pancreatica. Protegge
l’organismo dai processi infiammatori (polmoni e bronchi) e dai danni tessutali,
modula la risposta immune proteggendo da reazioni allergiche.
Uno sdoppiamento raro della banda può essere dovuto ad
elevati livelli di 1-fetoproteina, i quali, dopo il secondo anno
di vita, sono indicatori di epatiti evolutive, carcinoma epatico
BANDA  2
2-MACROGLOBULINA:
GP. Sintetizzata dal fegato. Modulatore dell’attività delle
citochine. Aumenta fisiologicamente nel 3°
trimestre
della
gravidanza,
nell’infanzia e nell’età avanzata. Aumenti patologici si hanno nell’infiammazione acuta,
nelle epatopatie, nel diabete.
APTOGLOBINA: GP. Lega l’emoglobina libera (in modo forte ed irreversibile).La sua
concentrazione aumenta dalla nascita fino all’età adulta. Diminuisce per iperconsumo in
tutti i casi di emolisi intravascolare e per difetto di sintesi in condizione di riduzione del
numero di epatociti. Può diminuire anche in seguito a sport prolungati, che comportano
distruzione di eritrociti. E’ una proteina della fase acuta.
CERULOPLASMINA: GP. Maggiore proteina di trasporto plasmatico del rame. La sua
sintesi avviene nel fegato. Diminuisce nel morbo di Wilson.
PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA D
BANDA  1
TRANSFERRINA: GP. Lega e trasporta in modo reversibile lo ione ferrico.
Aumenta nelle sideropenie e diminuisce negli accumuli di ferro. Le funzioni
principali della transferrina sono:-trasporto di ferro assorbito dall’intestino alle
cellule che lo richiedono; -fattore protettivo contro cellule batteriche e
neoplastiche in quanto compete con esse per l’utilizzo di ferro.
BANDA  2
C3:
proteina della fase acuta che si eleva molto lentamente e richiede 2-10 giorni
per raggiungere il massimo livello dopo un’infiammazione.
EMOPESSINA: GP. Lega il gruppo eme libero in rapporto 1:1 e lo trasporta al fegato,
dove l’eme entra nella cellula e libera il ferro che è riutilizzato.
 2-MICROGLOBULINA: costituisce la catena leggera degli antigeni del complesso
maggiore di istocompatibilità (MHC) e si trova sulla superficie di tutte le cellule che
esprimono questo antigene.
ZONA 
E’ costituita dalle diverse classi delle immunoglobuline. A causa della loro eterogeneità, le
immunoglobuline si estendono dalla regione  a quella  e talvolta occupano anche la zona .
Le Ig sono l’espressione dell’attività
secretoria di diversi cloni plasmacellulari
Riduzione:
IPOGAMMAGLOBULINEMIA
AGAMMAGLOBULINEMIA
Legata al sesso
Più frequenti quelle acquisite. Negli adulti e negli anziani
deve far
sospettare
una malattia
Immunoproliferativa
(linfoma)
ZONA 
Aumento:
IPERGAMMAGLOBULINEMIA POLICLONALE
Tutte le malattie croniche infettive, collagenopatie, malattie
autoimmuni. Utile seguire il decorso delle epatiti acute virali e
di alcune malattie autoimmuni tipo LES e artrite reumatoide
GAMMAPATIA MONOCLONALE
comparsa in zona -  di una banda stretta,
che può essere rilevata come picco al
Albumina
Globuline
α1
α2
β1
β2
densitogramma quando presente al di
γ
sopra di 1g/L.
LE GAMMAPATIE MONOCLONALI
La proliferazione di un singolo clone plasmacellulare con produzione di un’unica classe,
sottoclasse, idiotipo di immunoglobulina, detta monoclonale.
La presenza di Ig patologiche si mette in evidenza all’elettroforesi del siero come una
banda netta che nella maggior parte dei casi si trova in zona , da qui il nome di
gammapatia monoclonale alla malattia e di componente monoclonale della proteina
(CM).
Il termine CM si riferisce quindi a qualunque banda immunoglobulinica che presenti le
caratteristiche d’una mobilità elettroforetica e sia costituita da un solo tipo di catena
pesante e da un solo tipo di catena leggera.
La frequenza è 1-2% nella popolazione al di sopra dei 25 anni ed aumenta al 3-7% negli
ultrasettantenni. Il rischio di progressione in mieloma è dell’1% all’anno
la presenza di un picco a banda stretta nella regione gamma indica una gammapatia
monoclonale. La gammapatia monoclonale è associata ad una proliferazione clonale
maligna o potenzialmente tale che rientra nella diagnosi di MM, macroglobulinemia di
Waldenström, plasmacitoma solitario, MM smoldering, MGUS, PCL, HCD, LCDD, AL.
L’ELETTROFORESI su acetato di cellulosa e su gel di agarosio è la tecnica essenziale
per il riconoscimento di una CM.
E’ possibile effettuare una quantificazione e la tipizzazione delle Ig e delle catene
leggere della CM.
Per il DOSAGGIO IN FASE LIQUIDA si possono usare la nefelometria (reazione Ag-Ab
con deviazione del fascio di luce del nefelometro (scatter) tanto maggiore quanto più
numerosi e più grandi sono i complessi e quindi la concentrazione della proteina) o la
turbidimetria (tecnica in assorbimento che utilizza un normale spettrofotometro).
Per il DOSAGGIO IN SITU si utilizza l’IMMUNOFISSAZIONE
Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ (lastrine di agarosio)
mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte le altre bande non
fissate, permettendo l’identificazione di una banda
Una volta sorto il sospetto di gammapatia monoclonale bisogna quantificare la proteina
M con IFE siero ed urine.
Le immunoglobuline
sintetizzate dalle plasmacellule
maligne in ordine di frequenza
nel siero sono:
•IgG (70%)
• IgA(20%)
•IgM (1%)
•λ
• IgD
• IgE
MGUS,
MM,
macroglobulinemia di Waldenström,
plasmacitoma solitario,
MM smoldering,
PCL,
HCD,
LCDD,
AL.
MIELOMA MULTIPLO
Il mieloma multiplo è la forma più comune di neoplasia plasmacellulare nell’uomo.
Produce in genere un’immunoglobulina monoclonale ed un eccesso di catene leggere libere.
Le Ig possono appartenere a tutte le classi di Ig con frequenza corrispondente al loro normale
contenuto serico (mieloma secernente, oligosecernente)
La maggior parte dei pazienti hanno una proteina M rilevabile ma l’ 1-3% ha
un mieloma non secernente
Circa il 20% dei pazienti produce solo catene leggere non rilevabili nel siero poiché passano
attraverso i glomeruli e vengono escrete con le urine. Si parla in tal caso di mieloma
Micromolecolare o mieloma di Bence Jones in cui la componente sierica è costituita da sole catene
leggere in forma di monomeri, dimeri o trimeri.
Beetham et al, ann clin biochem 2000
Le plasmacellule normalmente producono un eccesso di catene
leggere che non si legano alle catene pesanti per formare una
molecola Ig completa e si ritrovano nel sangue come catene leggere
libere (sFLC).
Ciò avviene anche per le PC maligne.
Il monitoraggio delle sFLC è parte integrante della diagnostica e
del decorso delle discrasie plasmacellulari.
Tosi et al, tah 2013
The International Myeloma Working Group (IMWG) recommends:
- a complete history taking and physical examination;
- routine laboratory testing including serum protein electrophoresis (SPEP),
serum immunofixation electrophoresis (SIFE), nephelometric quantitation of immunoglobulins,
and measurement of serum FLCs (SFLCs);
- bone marrow aspiration and biopsy with immunophenotyping, conventional cytogenetics,
and fluorescence in situ hybridization;
-and imaging.
Il nuovo test Freelite™ della Binding Site (USA),
utilizzato con il nefelometro BN™ II, permette
un’ accurata e rapida quantificazione delle flc nel siero,
nell’ urina e nel liquor. Il nefelometro è in grado di
quantificare solo le flc senza determinare anche le catene
leggere legate alla catena pesante dell’Ab.
Ciò è reso possibile grazie alla presenza di Ab specifici
che legano esclusivamente le flc (Ag).
Brebner et al, rep-med 2013
Il saggio SFLC (Freelite™ Assay, The Binding Site Ltd., Birmingham, United
Kingdom) è stato introdotto nel 2001. Esso riconosce un epitopo presente solo sulle
catene leggere delle Ig nel siero.
E’ l’unico test approvato dalla U.S. Food and Drug Administration ed è classificato
come un test immunologico sulle catene leggere.
Misura k e l separatamente rilevandone basse concentrazioni (meno di 1 mg/dL nel
siero e meno di 200 mg/day nelle urine).
Il vantaggio maggiore è il calcolo del rapporto kappa/ lambda per cui il range
diagnostico è 0.26–1.65.
Un rapporto alterato è utile indice di clonalità, poiché un disordine clonale produce
elevate concentrazioni di un tipo solo di catene leggere.
Si ritiene che questo saggio potrebbe avere un ruolo aggiuntivo nello screening,
nella diagnosi, nel monitoraggio e nella prognosi delle PCD nella pop. Ad alto
rischio.Oltre la rilevanza in
Fase diagnostica e nel monitoraggio durante la terapia potrebbero anche essere
l’unico marcatore
della malattia in alcuni casi (MM non secernente; AL; LC MM)
•Sindrome di Fanconi: depositi di catene k nel tubulo prossimale e presenza di catene
k nelle urine e dolore (1/14 evolve in MM)
•Sindrome POEMS: Isotipo L. VEGF (Policlinico San Matteo di Pavia-siero separato da
provetta tappo rosso senza gel messo in un eppendorf).
•MM IgM: 1%. IFT.
•Malattia da emoagglutinine fredde: IgMk. Emolisi extravascolare. Anemia. Cercare le
agglutinine fredde con un titolo >1:64 A 4 GRADI.
•AL IgM: 5%, associata a catene l. Biopsia del nervo surale se neuropatia. R.
•Scleromixedema: 1-eruzione generalizzata papulare o sclerodermoide; 2-depositi di
mucina e fibrosi; 3-gammapatia monoclonale IgG (l); 4-assenza di patologia tiroidea.
Conclusioni
-Porre attenzione nella lettura al protidogramma delle singole bande
raccogliendo una storia clinica completa del paziente
- Di fronte un picco monoclonale fare ulteriori approfondimenti
-Ricordare i nuovi test (sFLC)
-Tenere a mente i casi rari
Grazie dell’attenzione
Diagnosi differenziale di alterazioni del protidogramma