Resolution of Inflammation: Prostaglandin E2 Dissociates
Nuclear Trafficking of Individual NF-kB Subunits (p65, p50) in
Stimulated Rheumatoid Synovial Fibroblasts
Paul F. Gomez, Michael H. Pillinger, Mukundan Attur, Nada Marjanovic,
Mander Dave, Jean Park, Clifton O. Bingham III, Hayf Al-Mussawir, and
Steven B. Abramson
The Journal of Immunology
Rago Giuseppe F., Bartiromo Federica, Giarletta Mario
Department of
Rheumatology,
Hospital for Joint
Diseases and
Department of
Medicine,
New York
University School
of Medicine, New
York, NY 10003;
Department
of Medicine, New
York Harbor
Veterans Affairs
Healthcare System
New
York Campus, New
York, NY 10010
Per infiammazione o flogosi si intende un meccanismo di difesa non
specifico innato, che costituisce una risposta protettiva, seguente
all’azione dannosa di agenti fisici, chimici, biologici il cui obiettivo
finale è l’eliminazione della causa iniziale di danno cellulare o tissutale.
 L’infiammazione consiste in una sequenza
dinamica di fenomeni che si manifestano con una
intensa reazione vascolare.
 L’infiammazione serve a distruggere diluire e
confinare l’agente lesivo, ma allo stesso tempo
mette in moto dei meccanismi che favoriscono la
riparazione o la sostituzione di tessuto
danneggiato.
 Clinicamente i segni cardine dell’infiammazione
sono: arrossamento, tumefazione, calore, dolore,
alterazione funzionale.
L’infiammazione acuta
L'infiammazione acuta è una
risposta immediata e precoce a uno
stimolo lesivo. È una reazione
vascolare e cellulare al danno
tissutale. Si caratterizza per:
1.modificazioni vascolari;
2.passaggio dei leucociti dal letto
capillare al tessuto leso;
3.migrazione dei leucociti
all'interno del tessuto soggetto al
processo flogistico.
L’ifiammazione cronica
L'infiammazione cronica è un processo
flogistico di lunga durata in cui
coesistono l'infiammazione attiva, la
distruzione tissutale e i tentativi di
riparazione.
I mediatori flogistici
Ammine vasoattive (mast cells, piastrine)
 Istamina, serotonina

Vasodilatazione, permeabilità
Complemento, chinine, fattori della coagulazione

Permeabilità, chemiotassi, opsonizzazione
Metaboliti dell’acido arachidonico



Prostaglandine e trombossano (cicloossigenasi)
Leucotrieni (lipossigenasi)
Vasodilatazione, permeabilità, chemiotassi, dolore
Citochine (linfociti e macrofagi attivati)


Modulano la funzionalità di altre cellule
+ importanti= TNFalfa, IL (attivazione endoteliale), INFgamma
(attivazione macrofagica)
 Gli studiosi hanno fatto emergere che IL-1 e TNF
partecipano alla regolazione di malattie inclusa
l’artrite reumatoide.
 Vengono prodotte principalmente dai macrofagi
attivati
 La secrezione di TNF e IL-1 può essere stimolata da
endotossine e atri prodotti microbici,
immunocomplessi, lesioni fisiche
 Sia IL-1 che TNF stimolano i fibroblasti sinoviali a
secernere mediatori come PGE2, metalloproteinasi, fattori di crescita.
Nf-kb e infiammazione
 NF-κB controls many genes involved in inflammation, it is
not surprising that NF-κB is found to be chronically active
in many inflammatory diseases, such as inflammatory
bowel disease, arthritis, sepsis,gastritis, asthma, among
others. Many natural products (including anti-oxidants)
that have been promoted to have anti-cancer and antiinflammatory activity have also been shown to inhibit NFκB.
 NF-κB was first discovered in the lab of Nobel Prize
laureate David Baltimore via its interaction with an 11-base
pair sequence in the immunoglobulin light-chain enhancer
in B cells.
Ruolo di NF-kB nella vita della cellula
Enzimi di
risposta allo
stress
Molecole di
adesione
Trascrizione di geni
Citochine proinfiammatorie
Molecole
direttamente
coinvolte nel
ciclo cellulare
Proteine
anti-apoptotiche
Bcl-2, cIaP1,
cIaP2
Nf-kb: fattori trascrizonali implicati
nell’infiammazione
Nf-kb è una famiglia di fattori trascrizionali dimerici
formati da etero ed omodimeri di proteine della famiglia
REL. Ci sono 5 proteine Rel tra queste si individuano due
sottogruppi:

 Contengono domini di
trans-attivazione
 RelA(p65)
 RelB
 cRel
 trascrizione
 Espressi come precursori
delle proteine p105 e
p100. Non hanno
dominio di transattivazione.
 P50
 P52
 trascrizione
Schematic diagram of NF-κB protein structure. There are two structural
classes of NF-κB proteins: class I (top) and class II (bottom). Both classes of
proteins contain a N-terminal DNA-binding domain (DBD), which also serves as
a dimerization interface to other NF-κB transcription factors and in addition
binds to the inhibitory IκBα protein. The C-terminus of class I proteins contains
a number of ankyrin repeats and has transrepression activity. In contrast, the Cterminus of class II proteins has a transactivation function.
Mechanism of NF-κB action. In this figure, the NF-κB heterodimer between Rel and p50
proteins is used as an example. While in an inactivated state, NF-κB is located in the cytosol
complexed with the inhibitory protein IκBα. Through the intermediacy of integral membrane
receptors, a variety of extracellular signals can activate the enzyme IκB kinase (IKK). IKK, in
turn, phosphorylates the IκBα protein, which results in ubiquitination, dissociation of IκBα
from NF-κB, and eventual degradation of IκBα by the proteosome. The activated NF-κB is then
translocated into the nucleus where it binds to specific sequences of DNA called response
elements (RE). The DNA/NF-κB complex then recruits other proteins such as coactivators and
RNA polymerase, which transcribe downstream DNA into mRNA, which, in turn, is translated
into protein, which results in a change of cell function.
NF-kb
 I dimeri di nf-kb si legano ai promotori dell’NO sintasi
e a quelli della cicloossigenasi2 inducendone
l’espressione.
 Tra le PG sintetizzate da COX2, PGE2 è forse la meglio
studiata. PGE2 media la vasodilatazione, la
permeabilità vascolare e il dolore, può anche avere
effetti antinfiammatori
Le prostaglandine si formano velocemente,
esercitano i loro effetti localmente
 La cicloossigenasi compie il primo passo nella sintesi delle prostaglandine a partire da un
comune acido grasso, l'acido arachidonico. Come è illustrato nel riquadro qui a destra,
la cicloossigenasi aggiunge due molecole di ossigeno all'acido arachidonico, cominciando
una serie di reazioni che produrranno, alla fine, una varietà di prostaglandine diverse.
L'aspirina impedisce il legame dell'acido arachidonico nel sito attivo della
cicloossigenasi
 COX-1 e COX-2
In realtà noi possediamo due cicloossigenasi diverse (chiamate COX-1 e COX-2) e le
utilizziamo per scopi diversi. La COX-1 è presente in quasi tutte le nostre cellule,
sintetizza le prostaglandine usate in tutto il corpo per mantenere una corretta fisiologia.
Il secondo enzima, la COX-2, viene prodotto solo occasionalmente e solo nelle cellule
coinvolte nella risposta infiammatoria o immunitaria. Causa dolore e gonfiore in risposta
ad un danno fisico o ad un infezione, aumenta la permeabilità delle pareti dei vasi
sanguigni e fa giungere le cellule del sistema immunitario al tessuto danneggiato.
Cicloossigenasi
Un Enzima Complesso
Questo enzima, in realtà, ha due siti attivi diversi, chiamati complessivamente
prostaglandina sintasi. Su un lato, c'è il sito attivo di cicloossigenasi. Sul lato opposto, c'è
il sito di perossidasi completamente separato dall'altro, che è necessario per attivare i
gruppi eme che partecipano alla reazione di cicloossigenasi. Il complesso enzimatico in
realtà è un dimero composto di due subunità identiche, così ci sono due siti attivi di
cicloossigenasi e due siti attivi di perossidasi molto vicini gli uni agli altri. Inoltre, ogni
subunità ha una piccola protuberanza ricca di catene idrocarburiche apolari, diretta verso
il basso in questa figura. Queste protuberanze ancorano il complesso alla membrana del
reticolo endoplasmatico, mostrata in azzurro sul fondo della figura. Il sito attivo di
cicloossigenasi è nascosto in profondità all'interno della proteina, ed è raggiungibile
attraverso un tunnel che sbuca al centro della protuberanza. Il tunnel si comporta come
un imbuto, guidando l'acido arachidonico fuori dalla membrana e all'interno dell'enzima
dove viene fatto reagire.
 Contrariamente alla maggior parte degli ormoni, che sono prodotti in
ghiandole specializzate e poi trasportati in tutto il corpo dal sangue,
le prostaglandine vengono sintetizzate dalle cellule e poi agiscono
solo nell'area circostante prima di venire demolite.
 Le prostaglandine sono eicosanoidi che appartengono alla famiglia
degli autacoidi, sono cioè delle molecole che vengono liberate dalla
cellula nell’ambiente extracellulare.
 Gli eicosanoidi sono sintetizzati in seguito all’interazione di stimoli di
diversa natura con la membrana cellulare e diffondono
immediatamente nell’ambiente extracellulare
 Gli eicosanoidi si formano a partire dall’ acido arachidonico
dal 1935 le “prostaglandine”
 Dal punto di vista chimico, le
prostaglandine sono acidi grassi, solubili
nella componente lipidica del corpo
umano.
 Benché l'identificazione delle
prostaglandine da parte del fisiologo
svedese Ulf von Euler risalga al 1935, le
ricerche su composizione, struttura,
funzioni e applicazioni cliniche di queste
sostanze ebbero inizio solo alla fine degli
anni Sessanta. Nel 1971 il farmacologo
britannico John Robert Vane dimostrò
che molti effetti clinici dell'Aspirina®
sono collegati alla capacità di questo
farmaco di inibire la sintesi di
determinate prostaglandine.
Note cliniche
 Alcune prostaglandine provocano la
costrizione dei vasi sanguigni. Questo
effetto viene sfruttato in ostetricia, dal
momento che la costrizione dei vasi
sanguigni che irrorano l'utero provoca
una stimolazione delle contrazioni di
quest'organo; preparati farmacologici a
base di prostaglandine possono essere
somministrati alle donne incinte per
indurre il parto o l'aborto terapeutico. A
causa dell'effetto esercitato sui vasi
dell'utero, le prostaglandine prodotte
dall'organismo sono responsabili della
dismenorrea, cioè del dolore e dei
crampi accusati da molte donne nei
primi giorni del ciclo mestruale.
 In generale le loro funzioni vanno dalla
coagulazione del sangue, al metabolismo
dell’osso, allo sviluppo del sistema
nervoso, alla funzione renale, al tono dei
vasi sanguigni, alle rispote immuni
PGE2
Le prostaglandine, simili ad altri eicosanoidi, sono
costituite da 20 atomi di carbonio ma questo sottogruppo
è caratterizzato da una struttura ad anello con carbonio
in posizione 5. Furono scoperte nel 1930 nelle secrezioni
prodotte dalla ghiandola prostatica, da cui deriva il loro
nome. Oggi si sa che le prostaglandine sono praticamente
varietà di reazioni biochimiche. Ogni prostaglandina viene
indicata con una lettera maiuscola ed un numero
minuscolo, come la prostaglandina E2 (PGE2). La lettera
indica la sostituzione nell’anello, del carbonio in posizione
5, con una molecola di ossigeno o di idrossido. Il numero
indica i doppi legami presenti nella catena molecolare
laterale.
Systematic (IUPAC) name
7-[3-hydroxy-2-(3-hydroxyoct-1-enyl)- 5-oxo-cyclopentyl] hept-5-enoic acid
Acido 5,8,11,14- eicosantetraenoico
La cicloossigenasi trasforma l’AA nella Prostaglandina endoperossido
PGG2 a sua volta convertita in PGH2, dal quale si otteranno i prodotti
finali.
 The naturally occurring prostaglandin E2 (PGE2) is known in medicine
as dinoprostone.
 Like other prostaglandins, dinoprostone can be used as an
abortifacient.
 It works by binding and activating the prostaglandin E2 receptor.
 It was discovered by Bunting, Gryglewski, Moncada and Vane in 1976.
Figure . The relationship
between EP receptor (EP)
activation by PGE2 and
other signal transduction
pathways. Signaling
through EP2 leads to
GSK-3 phosphorylation
via a protein kinase A–
dependent mechanism
(A).
 Gli studi di Zurier et al.
Indicano che la PGE2
può ridurre
l’infiammazione in
modelli animali che
presentano artrite
reumatoide.
Side view of the crystallographic
structure of a homodimer of the
RELA protein (green and
magenta) bound to DNA
(brown).
Le PGE2 sono mediatori dell’infiammazione,
ma possono anche mediare effetti anti-infiammatori
Sintesi del superossido
PGE2
Secrezione delle MMP-1
ATTRAVERSO EFFETTI SU ERK
Gli autori dell’articolo, partendo da queste
considerazioni e usando RA SF (rheumatoid arthritis
synovial fibroblasts), sono andati alla ricerca della
relazione tra PGE2 ed NF-kB.
PGE2
NF-kB
Esiste una relazione?
Cos’è la RA?
Processo infiammatorio a carico del tessuto
connettivo - tessuto di sostegno presente in tutti gli
organi ed in modo particolare a livello articolare conseguenza di una reazione di tipo autoimmunitario.
Dunque i fibroblasti - i maggiori produttori della
matrice extracellulare – sono interessati dal processo
infiammatorio.
Le prostaglandine E2 sono in grado di
regolare la localizzazione nucleare di p65 e
p50, subunità attivate di NF-kB?
Premessa
L’IL1-B e il TNFa stimolano la
traslocazione nucleare di p65
e p50 con conseguente
attivazione di NF-kB
In seguito a somministrazione di PGE2, si è osservato:
• Traslocazione nucleare di p50
•
Accumulo citosolico di p65
NON ATTIVAZIONE DI NF-kB
Quindi, PGE2 dissocia il traffico
nucleare delle singole subunità di
NF-kB, giocando
UN EFFETTO
ANTI-INFIAMMATORIO
Quali sono i meccanismi con cui agisce
PGE2?
1
PGE2 blocca l’attivazione di ERK
stimolata da IL-1B e da TNFa
Quindi, PGE2 agisce con un meccanismo dipendente da ERK
2
Inoltre, PGE2 stimola
l’espressione di IKBa
tramite up-regulation
Quindi, PGE2 agisce anche con un meccanismo
indipendente da ERK
Feedback Loop
Citochine
NF-kB
ERK
COX-2
IKBa
PGE2
•
PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma
intensifica quella di p50
•
ERK promuove la traslocazione nucleare di p65
ma inibisce quella di p50
•
PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso
meccanismi dipendenti e non da ERK
•
L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2
in assenza di
stimolazione
bassi livelli di p50
nucleare e livelli
pressochè nulli di
p65 nucleare.
Il trattamento con IL-1β o con TNFα separatamente o
contemporaneamente ha lo stesso effetto
La traslocazione
nucleare di p50 e p65
dopo 6 ore è
aumentata
considerevolmente
Dato che PGE2 ha effetti anti-infiammatori nei RA SF,
come PGE2 regola la localizzazione di p50 e p65 nei RA
SF umani?
Considerando che:
• IL-1B e TNFa stimolano la continua traslocazione
nel nucleo di p65 e p50 durante le 6 ore
• I livelli citoplasmatici di p65 e p50 si riducono
dopo 1 ora di stimolazione per la traslocazione di un
pool citosolico, ma erano recuperati dopo 6 ore
• Prima della stimolazione, i RA SF sono stati trattati
con cicloesimide e questo inibiva il riaccumulo di
p65 e p50 nel citosol
… e questo indica che
IL-1B e TNFa stimolano la sintesi de novo di
p65 e p50 che sono successivamente
localizzate nel citosol…
Diamo uno sguardo a p50
Analizziamo le quantità di p65 e p50
PGE2
Inibisce la traslocazione
nucleare di p65
Promuove la traslocazione
nucleare di p50
PGE2 agisce attraverso effetti separati sulle due proteine
Ma come possono questi effetti avere consguenze sulla
trascrizione?
Ma cosa accade a monte della secrezione di PGE2?
Quali sono gli effetti dell’inibizione di COX?
•
PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma
intensifica quella di p50
•
ERK promuove la traslocazione nucleare di p65
ma inibisce quella di p50
•
PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso
meccanismi dipendenti e non da ERK
•
L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2
•
PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma
intensifica quella di p50
•
ERK promuove la traslocazione nucleare di p65
ma inibisce quella di p50
•
PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso
meccanismi dipendenti e non da ERK
•
L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2
Come ERK regola la traslocazione nucleare di
p65 e di p50?
Regola entrambe le proteine allo stesso modo o
in maniera separata e diversificata?
ERK promuove la traslocazione nucleare di
p65 ma non di p50
Come essere sicuri che la via di trasduzione di
ERK sia legata alla traslocazione di p65?
GFP
caMEK
DsRed
p65
MEK
ERK
P65
nel
nucleo
•
PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma
intensifica quella di p50
•
ERK promuove la traslocazione nucleare di p65
ma inibisce quella di p50
•
PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso
meccanismi dipendenti e non da ERK
•
L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2
Dato che PGE2 e PD98059 inibiscono la
traslocazione nucleare di p65 e intensificano
quella di p50
PGE2 potrebbe regolare NF-kB attraverso
inibizione di ERK?
Dato che l’evento iniziale nell’attivazione di
NF-kB è la fosforilazione, l’ubiquitinazione e
la degradazione di IKBa
PGE2 ed ERK possono agire sulla
localizzazione di p65 e p50 attraverso effetti
su IKBa?
I livelli di IKBa non sono regolati da ERK
•
PGE2 inibisce la traslocazione nucleare di p65 ma
intensifica quella di p50
•
ERK promuove la traslocazione nucleare di p65
ma inibisce quella di p50
•
PGE2 regola l’attivazione di NF-kB attraverso
meccanismi dipendenti e non da ERK
•
L’attivazione di ERK e l’espressione di COX2
PGE2 ed ERK regolano l’espressione di
COX2 nei RA SF?
PGE2
ERK pathway
COX2
Possono le PGE2 diminuire i livelli di iNOS
nei macrofagi attivati?
FEBS Lett. 1998 Nov 27;440(1-2):76-80.
Prostaglandins prevent inducible nitric oxide synthase protein
expression by inhibiting nuclear factor-kappaB activation in J774
macrophages.
D'Acquisto F, Sautebin L, Iuvone T, Di Rosa M, Carnuccio R.
Department of Experimental Pharmacology, University of Naples Federico II, Italy.
PGE2
LPS
iNOS
PGE2
iNOS
LPS
PGE2
NF-kB
iNOS
PGE2 ed ERK
Quali sono le basi molecolari
di questo meccanismo?
Premessa
NF-kB
Che cosa avviene quando le PGE2 legano il
loro recettore EP-2?
PKA
PGE2
EP2
cAMP
PKA
SHP-1
JAK
Un’attivazione sostenuta di NF-kB è stata
osservata in lesioni aterosclerotiche ed in cellule
muscolari lisce dei vasi arteriosi.
Toxicol Lett. 2009 Oct 28;190(2):172-8. Epub 2009 Jul 16.
Cholesterol-3-beta, 5-alpha, 6-beta-triol induced PI(3)K-Akt-eNOSdependent cyclooxygenase-2 expression in endothelial cells.
Liao PL, Cheng YW, Li CH, Lo YL, Kang JJ.
Institute of Toxicology, College of Medicine, National Taiwan University, Jen-Ai Road,
Section 1, Taipei 100, Taiwan, ROC.
Colesterolo,
alpha-trioli
e-NOS
COX-2
NO
PGE2
L’ effetto e’ probabilmente dovuto a:
aumento del cGMP → attivazione della PKG → fosforilazione della catene
leggere della miosina → rilassamento della muscolatura liscia dei vasi
(vasodilatazione)
IKBa
Platelets. 2008 Dec;19(8):605-13.
DG-041 inhibits the EP3 prostanoid receptor--a new target for
inhibition of platelet function in atherothrombotic disease.
Heptinstall S, Espinosa DI, Manolopoulos P, Glenn JR, White AE, Johnson A, Dovlatova
N, Fox SC, May JA, Hermann D, Magnusson O, Stefansson K, Hartman D, Gurney M.
Department of Cardiovascular Medicine, University of Nottingham, Nottingham, UK.
[email protected]
PGE2
EP-3
P-selectin
Coniugati piastrine - leucociti
Effetti pro - aggregatori
Thromb Haemost. 2007 Aug;98(2):287-95.
Regulation of hyaluronan synthesis by vasodilatory
prostaglandins. Implications for atherosclerosis.
Fischer JW, Schrör K.
Institut für Pharmakologie und Klinische Pharmakologie, Universitätsklinikum
Düsseldorf, Düsseldorf, Germany. [email protected]
PGE-2
EP-2
Acido
Ialuronico
HAS 1 e 2
si associa con
Leucociti e VSMC
…Grazie
per
l’attenzione…