LE MALATTIE
DEL SANGUE
EMOPATIE NON NEOPLASTICHE
LEUCOCITOSI
LEUCOCITI
LEUCOPENIE
PIASTRINOSI
PIASTRINE
CARATTERISTICHE
GENERALI
PATOGENESI
PIASTRINOPENIE
POLIGLOBULIE
ERITROCITI
ANEMIE
QUADRI
SPECIFICI
EMOPATIE NEOPLASTICHE
CELLULE
LINFOIDI
LEUCOCITI
CELLULE
MIELOIDI
PIASTRINE
ERITROCITI
Leucemia linfoblastica acuta
Leucemia linfatica cronica
Leucemia prolinfocitica
Leucemia a cellule capellute
Linfomi di Hodgkin
Linfomi non Hodgkin
Leucemia mieloide acuta
Leucemia mieloide cronica
Sindromi mielodisplastiche
Mielofibrosi idiopatica
Trombocitemia primitiva
Policitemia vera
APLASIA MIDOLLARE: emocromo
Esame
Risultati
U.M.
Globuli bianchi (WBC) 1.0
Globuli rossi (RBC)
4.0
Emoglobina (Hb)
8.5
Ematocrito (Hct)
28.0
MCV
88.0
MCH
26.0
MCHC
33.0
Piastrine (Plt)
22.0
x103/µL
x106/µL
gr/dl
%
fl
pg
gr/dl
x103/µL
Neutrofili
Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
%
%
%
%
%
44.0
45.0
8.0
1.5
1.5
Intervallo di riferimento
4.0 - 10.8
4.5 - 5.5
14.0 - 18.0
42.0 - 52.0
82.0 - 94.0
27.0 - 31.0
32.0 - 37.0
130.0 - 400.0
40.0 - 74.0
20.0 - 45.0
3.4 - 9.0
0.0 - 8.0
0.0 - 15.0
APLASIA MIDOLLARE: biopsia midollare
APLASIA MIDOLLARE: biopsia ossea
LEUCEMIA ACUTA: emocromo
Esame
Risultati
U.M.
Globuli bianchi (WBC) 40.0
Globuli rossi (RBC)
4.1
Emoglobina (Hb)
9.2
Ematocrito (Hct)
30.0
MCV
88.0
MCH
27.0
MCHC
33.0
Piastrine (Plt)
40.0
x103/µL
x106/µL
gr/dl
%
fl
pg
gr/dl
x103/µL
Neutrofili
Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
%
%
%
%
%
10.0
74.0
12.0
2.5
1.5
Intervallo di riferimento
4.0 - 10.8
4.5 - 5.5
14.0 - 18.0
42.0 - 52.0
82.0 - 94.0
27.0 - 31.0
32.0 - 37.0
130.0 - 400.0
40.0 - 74.0
20.0 - 45.0
3.4 - 9.0
0.0 - 8.0
0.0 - 1.5
LEUCEMIA ACUTA: biopsia midollare
LEUCEMIA ACUTA: biopsia ossea
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: emocromo
Esame
Risultati
U.M.
Globuli bianchi (WBC) 56.2
Globuli rossi (RBC)
4.5
Emoglobina (Hb)
11.0
Ematocrito (Hct)
35.0
MCV
84.0
MCH
30.0
MCHC
33.0
Piastrine (Plt)
420.0
x103/µL
x106/µL
gr/dl
%
fl
pg
gr/dl
x103/µL
Neutrofili
Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
%
%
%
%
%
73.0
20.0
4.0
1.0
2.0
Intervallo di riferimento
4.0 - 10.8
4.5 - 5.5
14.0 - 18.0
42.0 - 52.0
82.0 - 94.0
27.0 - 31.0
32.0 - 37.0
130.0 - 400.0
40.0 - 74.0
20.0 - 45.0
3.4 - 9.0
0.0 - 8.0
0.0 - 1.5
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia midollare
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA: biopsia ossea
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: emocromo
Esame
Risultati
U.M.
Globuli bianchi (WBC) 25.0
Globuli rossi (RBC)
4.5
Emoglobina (Hb)
14.0
Ematocrito (Hct)
43.0
MCV
86.0
MCH
33.0
MCHC
34.0
Piastrine (Plt)
250.5
x103/µL
x106/µL
gr/dl
%
fl
pg
gr/dl
x103/µL
Neutrofili
Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
%
%
%
%
%
20.0
76.0
4.0
0.0
0.0
Intervallo di riferimento
4.0 - 10.8
4.5 - 5.5
14.0 - 18.0
42.0 - 52.0
82.0 - 94.0
27.0 - 31.0
32.0 - 37.0
130.0 - 400.0
40.0 - 74.0
20.0 - 45.0
3.4 - 9.0
0.0 - 8.0
0.0 - 1.5
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA: biopsia midollare
LEUCEMIE ACUTE:
Fisiopatologia e Clinica
Eziopatogenesi ed epidemiologia
LEUCEMIE ACUTE : FISIOPATOLOGIA
1) INSUFFICIENZA MIDOLLARE
2) INFILTRAZIONE DI TESSUTI E ORGANI NON
EMOPOIETICI DA PARTE DELLE CELLULE
BLASTICHE
3) LIBERAZIONE DI CITOCHINE
LEUCEMIE ACUTE : CLINICA
INSUFFICENZA MIDOLLARE
-INSUFFICIENTE PRODUZIONE ERITROCITI:
-astenia, cardiopalmo, dispnea
-INFUFFICIENTE PRODUZIONE PIASTRINE:
-porpora, ecchimosi, epistassi, gengivorragie, disturbi del visus,
ipermenorrea, metroraggie; piu rare: macroematuria, emorragie
tratto GI, SNC
-INSUFFICIENTE PRODUZIONE LEUCOCITI:
-infezioni
LEUCEMIE ACUTE : il DANNO
DELLE CELL. LEUCEMICHE
EZIOPATOGENESI DELLE LEUCEMIE ACUTE
HSC
Fattori ambientali
X?
Alterazione
genetica
Condizioni
ereditarie
progenitore mieloide/linfoide
?
altro evento
trasformante
cellule leucemiche
Cellule mature
FATTORI AMBIENTALI ED EPIDEMIOLOGIA
Agenti fisici
•Radiazioni ionizzanti
•Sorgenti elettriche/magnetiche
Agenti chimici
•Benzene (sigarette, industrie
inquinamento atmosferico)
•Altri composti aromatici
•Ossido di etilene
•Fenossi-erbicidi
•Uretano, nitrosamine (sigarette)
•Chemioterapia (es. alchilanti)
Agenti virali
•HTLV-1
•EBV
CONDIZIONI EREDITARIE
Sindromi
ereditarie
Alto rischio
familiare di LA
•Sindrome Down (trisomia 21)
•Sindromi con deficit del “DNA-repair”
(S. Bloom, Anemia di Fanconi)
•Sindromi da immunodeficienza
(S. Wiskott Aldrich)
•Monosomia del 7 (SMD)
•Mutazione AML-1
LEUCEMIE ACUTE: ALTERAZIONI GENETICHE
TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
Promoter/Enhancer
Gene cromosoma A
Promoter/Enhancer
Gene cromosoma B
Promoter/Enhancer
Gene di fusione A/B
Promoter/Enhancer
Gene di fusione B/A
I
II
Promoter/Enhancer
Gene del cromosoma A
regolato dal promoter del
gene del cromosoma B
TRASLOCAZIONE AML1-ETO
CBFβ
AML1
Sito CBF
Geni target
ETO
AML1
Sito CBF
NCor
HD
Geni target
RAS signalling cascade
RAS signalling pathways
DELEZIONI CROMOSOMICHE E MONOSOMIE
Alcun tipi di delezioni del 5q
Delezione del cromosoma 17 (p13)
Monosomia 7 e delezione 7q
Perdita di geni
oncosoppressori
Cytogenetic Abnormalities in
Adult ALL
t(9;22) (20-30%)
BCR-ABL
7q35 (3-5%)
Diploid and
others
(30-40%)
TCR b
14q11 (5%)
TCR a/ d
? 13q14
C-MYC
ETV6-AMLI
8q24 (1-2%)
E2A-PBX1
t(12;21)
(1-2%)
AF4-MLL
p16/p14/p15
9p21 (7-15%)
MLL
t(1;19) (5-7%)
t(4;11) (5-7%)
11q23 (3-4%)
Faderl S, et al. Cancer. 2003;98:1337-1354.
AF1P
AF10
ENL
? ATM
TAL1
TAL2
LCK
TAN1
LYL1
RHOM1
RHOM2
TCL1
HOX11
Ig k
Ig l
Ig H
EPIDEMIOLOGIA DELLE LEUCEMIE ACUTE
Incidenza: 3,5 casi/100000 abitanti/anno
LAM
•Ogni età
•Età mediana: 60-65
•Esposizione professionale
o iatrogena a Rx, benzene,
chemioterapici
LAL
•80% delle LA per età < 15 aa
•20% delle LA nell’adulto
•Agenti ambientali (?)
•eziologia virale (EBV, HTLV-1)
LEUCEMIE ACUTE:
PROCEDURE
DIAGNOSTICHE
LEUCEMIE ACUTE DIAGNOSI
SANGUE PERIFERICO
ASPIRATO MIDOLLARE
IMMUNOFENOTIPO (Citofluorimetria)
CARIOTIPO
BIOLOGIA MOLECOLARE
CITOFLUORIMETRIA
Citofluorimetria: definizione
Tecnica multiparametrica che
misura le caratteristiche
fisiche e/o chimiche di cellule
in sospensione all’interno di
un fluido di trasporto
Tre componenti:
1. Fluida
2. Ottica
3. Elettronica
Citofluorimetria: principi base
Nel citofluorimetro, singole cellule passano
allineate attraverso un sistema di rilevazione
ottico/elettronico.
scatter di luce
Parametri misurati
fluorescenza
Camera di flusso (componente fluida)
All’interno della camera di flusso, le particelle sono in fila grazie
alla differenza di pressione tra il campione ed il fluido di trasporto
Injector
Tip
Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
Il raggio laser, di forma ellittica, è focalizzato in modo da colpire le cellule
Al centro del canale di conta=fluido di trasporto
Componente ottica
Un microscopio usa la luce
per illuminare le cellule sul
vetrino
Un citofluorimetro usa una
fonte di luce monocromatica
da focalizzare sulle cellule
Fonte di luce:
LASER (Light
Amplification by
Stimulated
Emission
Radiation)
LIGHT SOURCE
Forward scatter
Forward scatter = indicatore relativo delle dimensioni cellulari
Laser
FALS Detector
Side (90o) scatter
Indicatore relativo della complessità cellulare interna (granuli)
Laser
FALS Detector
90oLS
Detector
Misura della fluorescenza
Laser
Le diverse emissioni di colore
per diverse sostanze fluorescenti
vengono separate da filtri ottici per cui
si possono analizzare separatamente
le diverse fluorescenze
Frequency
FALS Detector
I fotomoltiplicatori trasformano
I segnali luminosi in impulsi elettrici
Direttamente proporzionali allaFluorescence
luce
detector
Raccolta e gli impulsi vengono elaborati
(PMT3, PMT4 etc.)
Da un software (conversione analogico-digitale)
Fluorescence
Misura della fluorescenza: utilità
Le cellule possono essere identificate grazie alle loro
molecole di superficie e relativo specifico marker (CD,
“cluster di differenziazione”)
Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono
essere utilizzati per identificare il tipo di cellula
L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un
Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5) e si può
eseguire un test di immunofluorescenza diretta
Citofluorimetria: analisi e output dei dati
I segnali luminosi, trasformati in impulsi elettrici, vengono
processati da un sistema di conversione analogico-digitale
Plot degli eventi in scala grafica
Istogramma
one-parameter
Dot-plots a due dimensioni
Citofluorimetria:
selezione della popolazione da analizzare
Cluster analysis (software per analisi dei dati):
analisi di tutti i marker in relazione a tutti gli eventi
analisi di tutte le sottopopolazioni cellulari
Gating (filtro dei dati):
Forward scatter versus side-scatter
CD45 versus side scatter
analisi di una singola sottopopolazione per volta
Analisi citofluorimetrica nelle
leucemie acute: immunofenotipo
Diagnosi delle leucemie acute
Classificazione delle leucemie acute
Monitoraggio malattia minima residua
(sensibilità 10-3 – 10-4)