PCR quantitativa “Real-Time”
e sue applicazioni in ambito
biomedico
Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica
Dott.ssa Virginia Libri
RT-PCR convenzionale

Retrotrascrizione dell’RNA in cDNA
Oligo d(T)
Random esameri
Primer specifico per il gene

Amplificazione del cDNA tramite PCR
Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi:
Denaturazione,Annealing,Estensione

Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi)
Gli ampliconi sono ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di
amplificazione
Vengono fatti migrare su un gel di agarosio
Polymerase Chain Reaction: principio
Amplificazione selettiva in vitro di una
sequenza di DNA target
COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR:
1) Sequenza di DNA target
2) DNA polimerasi termostabile (Termophilus
aquaticus, Taq polimerasi)
3) Due oligonucleotidi (15-25 bp) specifici per
la sequenza target
4) dNTPs
Polymerase Chain Reaction: principio
CICLI TERMICI:
DENATURAZIONE
(94-96°C)
ANNEALING
(50-65°C)
EXTENSION
(72°C)
Polymerase Chain Reaction: Multiple PCR Cycles
2 copies
DNA
fragment
to be
amplified
4 copies
8 copies
Polymerase Chain Reaction:
vantaggi
1) Velocità e facilità d’uso
In poche ore si possono ottenere milioni di copie
della sequenza di DNA target
2) Sensibilità
Virtualmente è possibile utilizzare il DNA di una
singola cellula come template (contaminazione)
3) Robustezza
Amplificazione possibile anche utilizzando DNA di
bassa qualità
Polymerase Chain Reaction:
svantaggi
1) Solo sequenze note
Necessario conoscere la sequenza del DNA da
amplificare per sintetizzare i primers
2) Dimensioni e quantità limitate
Dime nsioni me d ie dell’amplic o n e 0 .1 - 5 k b
Quantità limitata rispetto alle tecniche di clonaggio
3) Proofreading
Ta q p o l i m e r a s i m a n c a d e l l ’ a t t i v i t à 3 ’  5 ’
esonucleasica, 20 cicli di reazione su un
frammento di 1 kb produrranno 40% di frammenti
con una mutazione puntiforme (1/10000)
Polymerase Chain Reaction: resa
Resa teorica: 2n
P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente
con il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T,numero di
copie di template di partenza
Log[DNA]

Plateau
Lineare
Esponenziale
Prodotto
variabile
N° cicli
termici
Polymerase Chain Reaction: plateau
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”,
esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei
prodotti
Il plateau non dipende da T
Anche se la quantità iniziale di template è la medesima, il plateau è
raggiunto in tempi diversi ed in cicli diversi
25
PCR product
20
15
10
5
0
0
10
20
Cycle
30
40
Soluzioni

Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale
Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale

Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una
fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR

La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione,
può essere rilevata utilizzando uno strumento
quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui
accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR
RT-PCR convenzionale
Reverse
transcription
Real-time RT-PCR
Reverse
transcription
PCR
reaction
Nested
PCR reaction
Gel
electrophoresis
DNA
sequencing
Southern
blot
Manual or
automated
analysis
PCR reaction
Quantitative
result
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale
durante la fase esponenziale della
PCR, quando cioè l'efficienza di
amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di
reazione, permettendo di ottenere
risultati molto più accurati rispetto alla
PCR tradizionale "end point"
RT-PCR quantitativa
•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione
•Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio
•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Plot lineare
Incremento di
fluorescenza
Cicli di PCR
Analisi tramite software
Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green
SYBR Green:SYBR
principio
Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
SYBR Green
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela
di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano poche
molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’ aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR green

Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

Non costosa

Non-specifica
 La molecola fluorescente si lega random a tutte le
doppie eliche, includendo i dimeri di primers
 È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione
Tm
melting peak
82.6
88.1
TaqMan
TaqMan
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:

coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano
in

maniera
aspecifica
a
tutto
il
DNA
sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di
interesse, marcate con molecole fluorescenti
Esistono diversi tipi di sonde:
Dual-labeled (come le sonde TaqMan)
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R
3’
5’
5’
Primer
3’
5’
Q
3’
5’
3’
Primer
5’
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
3’
Dimensione dell’amplicone
Forward
Probe
Reverse
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter”
ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”
5’
3’
Reporter-Quencher
Dye
Quencher
5,6 FAM
BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE
BHQ-2
Texas Red/ROXBHQ-2
Cy5/Quasar670
BHQ-2 ( or-3)
6-carbossifluoresceina
6-carbossitetrametilrodamina
Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R
perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Real-Time PCR:
attività 5’>3’ esonucleasica
3’
5’
3’
R
Q
5’
R
3’
Q
5’
5’
R
3’
5’
Q
5’
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
Real-Time PCR: la reazione
COMPONENTI DELLA REAZIONE:
1) DNA target
2) DNA polimerasi
3) Due oligonucleotidi
4) dNTPs
5) Probe fluorescente
Run Real-Time thermal cycle
50 cycles
95°C
3 min
Activates
Amplitaq Gold
15 s
65°C
55°C
50°C
30 s
2 min
Activates
UNG (Uracile N-Glicosilasi)
1 min
Curve di amplificazione
Fluorescenza
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il
cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
Normalised reporter fluorescence (Rn)
Plot di amplificazione
Linea soglia scelta
d a l l ’ o p e r a t o r e
In maniera da intersecare
le curve di tutti i campioni
nella fase esponenziale
Indica il valore al di
sopra del quale
inizia l’accumulo di
un amplificato
E’ il ciclo della reazione di
amplificazione in cui il segnale
di fluorescenza del campione è
maggiore rispetto a quello
d e l l a T h r e s h o l d
PCR cycle number
Quantificazione
ASSOLUTA
i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche
quantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
CT con quello del controllo endogeno
Quantitativa assoluta
Ct
10 1
35
10 2
10 3
unknown sample
10 4
25
10 5
10 6
3500 copies
10 7
15
1
2
3
4
5
6
7
log10 quantity
Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un
gene espresso costitutivamente (-actina, GAPDH, ATPs, 2 etc)
Quantitativa relativa
Plot di amplificazione
Control
Sample
Numero di cicli
CT
Quantitativa relativa: analisi dei dati

Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)
espresso costitutivamente (CT)

Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un
trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb)
(CT)
2- (CT,r- CT,cb)= 2- CT

Il valore così ottenuto permette di determinare la
concentrazione relativa del target
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Simili alle sonde TaqMan perché si legano al
DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci
sono però due sonde ognuna marcata con
un solo fluorocromo (accettore e donatore)
Quando le sonde non sono legate alle
sequenze target il segnale fluorescente
proveniente dall'accettore non è rilevato
Durante lo step di annealing PCR, entrambe le
sonde FRET ibridizzano alle sequenze
target: ciò avvicina il fluoroforo donatore
all'accettore permettendo il trasferimento di
energia tra i due fluorofori e la produzione di
un segnale fluorescente da parte
dell'accettore che viene rilevato
donatore
accettore
Molecular Beacons
I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher
non fluorescente alle estremità opposte di un oligonucleotide,
che sono disegnate in modo da essere complementari tra loro
formando una struttura stem-loop
La vicinanza del quencher
al reporter fluorescente
impedisce l’emissione di
fluorescenza
fluoroforo
quencher
Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodotto
amplificato
Molecular Beacons
Durante lo step di annealing PCR,
la sonda ibridizza alla sua
sequenza target: ciò separa il
colorante fluorescente dal
r e p o r t e r, p r o d u c e n d o u n
segnale fluorescente
La quantità di fluorescenza
prodotta ad ogni ciclo, o dopo
la PCR, dipende dalla quantità
di prodotto specifico in quel
d a t o
m o m e n t o
EXCITATIONE
FRET
ANNEALING
Amplicon
A d i f f e r e n z a d e l l e s o n d e Ta q M a n , l e m o l e c u l a r b e a c o n s n o n
vengono distrutte durante durante la reazione di amplificazione per
cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo
Probes : Scorpions
La progettazione delle
scorpion probes è
simile a quella delle
molecular probes, con
la differenza che al 3’
terminale del probe vi
è una sequenza, PCR
primer, che è specifica
per l’ estensione del
target
Questa sequenza
è
legata al 5’ terminale
di un primer per
mezzo di un “blocker”
5’
3’
Probes : Scorpions
Step 1
Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA
Scorpions primer
Probe
Target di DNA
Probes : Scorpions
Step 2
Durante il processo di denaturazione si verifica
l’allontanamento del quencher dal reporter e del
primer di innesco dal DNA target
Q
Primer di innesco
R
DNA target
Probes : Scorpions
Step 3
Raffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un
riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera
target specifica. Un primer non esteso viene quenciato
Riassumendo:
Metodi di rilevamento della fluorescenza
SYBR Green
TaqMan
Molecular
Beacons
Scorpion
probe
Real-Time PCR: applicazioni









Quantificazione virale
Quantificazione dell’espressione genica
Efficacia della terapia farmacologica
Misura dei danni al DNA
Controllo di qualità e validazione dei saggi
Detenzione dei patogeni
Controllo degli OGM
Genotyping
MRD
MRD (Minimal Residual Disease):
Quota residua di cellule neoplastiche
non eradicate dalla terapia di induzione della
remissione o dalle successive misure
terapeutiche
Tali elementi neoplastici, presenti ad un
livello inferiore alla capacità di rilevazione
delle metodiche convenzionali, sono in grado
di espandersi e dare origine alla recidiva
TH (Tirosina Idrossilasi)
Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi
delle catecolamine
HVA-VMA
TH (Tirosina Idrossilasi)

Perché la scelta di studiare l’espressione della TH?
Le cellule di Neuroblastoma (NB) hanno la
caratteristica di sintetizzare catecolamine, che risultano
alterate nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker
tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB,ma
non dagli altri tumori a piccole cellule rotonde

Pertanto lo studio di questo enzima può essere utilizzato
per identificare le metastasi midollari al momento della
diagnosi e per monitorare lo stato della MRD in modo da
individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti
i n
r e m i s s i o n e
c l i n i c a
TH (Tirosina Idrossilasi)

Possibile ruolo della TH come fattore prognostico negativo nel
Neuroblastoma (Pession et al. Oncology Reports 10:357-362,2003)

La concordanza con le analisi diagnostiche standard evidenziata
nello stadio IV consente di considerare la TH quale utile parametro
predittivo alla diagnosi

Negli stadi localizzati, dove in 3/24 (12.5%) è stata osservata la
positività isolata dell’espressione della TH suggestiva di
infiltrazione midollare minima, questa indagine potrebbe
rappresentare un valido strumento di approfondimento diagnostico

La valutazione della TH inoltre potrebbe entrare tra le analisi
diagnostiche indici di contaminazione neoplastica di cellule
staminali emopoietiche periferiche o midollari raccolte in pazienti
positivi alla diagnosi (studio in corso)