Progetto
“Lauree Scientifiche”
Cromatografia
su strato sottile
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“Lauree Scientifiche”
CROMATOGRAFIA
La cromatografia è una tecnica analitica per
separare specifiche sostanze in una miscela
E’ una tecnica efficace per separare componenti
di miscele complesse.
Le separazioni si basano su interazioni fisicochimiche a livello molecolare tra il supporto
cromatografico, le sostanze da separare e taluni
componenti del solvente mobile.
Le separazioni avvengono in una colonna
(colonna cromatografica) o su una lastra (TLC)
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IMPIEGHI DELLA CROMATOGRAFIA
Le applicazioni della cromatografia interessano un
vasto campo della chimica, dall’inorganica
all’organica, sia di sintesi che naturale.
In particolare la cromatografia è una tecnica
indispensabile nella chimica di sintesi e delle
sostanze organiche naturali, per isolare e
purificare i componenti di miscele di varia natura,
e in campo biologico per purificare polisaccaridi,
proteine, acidi nucleici, virus e anche cellule.
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CROMATOGRAFIA SU STRATO
SOTTILE (TLC)
La cromatografia su strato
sottile o TLC, è una tecnica
cromatografica
di
semplice
preparazione; questo la rende
particolarmente
adatta
per
l'esecuzione
di
valutazioni
qualitative o semi-quantitative.
Come tutte le cromatografie, si
basa sulla diversa separazione
di diverse sostanze tra una fase
stazionaria ed una fase mobile,
in funzione dell'affinità di ogni
sostanza con esse.
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PRINCIPIO DI
FUNZIONAMENTO
Tutti i componenti della miscela sono depositati
sulla lastra (fase stazionaria) e sono trasportati
(eluiti) da un solvente (fase mobile) che si
muove.
Nella TLC l’eluente si muove dal basso verso l’alto
attraverso un strato sottile per capillarità.
I composti si muovono con diversa velocità, in
base alla diversa affinità della sostanza
analizzata, verso un eluente e verso la fase
stazionaria.
Si ha separazione poiché i composti più affini
all’eluente si muovono di più sulla lastra.
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FASE STAZIONARIA
La fase stazionaria è generalmente uno strato
dallo spessore uniforme di circa 1 mm di
materiale adsorbente, depositato su una lastra di
vetro o plastica. Il materiale adsorbente può
essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere
o polvere di diatomee, tutti materiali polari
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FASE MOBILE
La fase mobile è un solvente opportunamente
scelto (od una miscela di solventi), capace di
separare i componenti della miscela da analizzare
e poco affine per polarità alla fase stazionaria
scelta.
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TECNICA CROMATOGRAFICA
La traccia arancione è
la sostanza più affine
con l’eluente in quanto
ha percorso un tragitto
più lungo.
La traccia gialla
rappresenta una
sostanza meno affine
all’eluente,infatti ha
percorso una distanza
minore.
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Separazione TLC di estratto di
pomodoro
Analizzare un concentrato di pomodoro
Estrarre sostanze principali: licopene e
β-carotene
Eseguire la tecnica cromatografica TLC
Separare ed identificare componenti
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Pigmenti nel concentrato di pomodoro:
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LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei
carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del
pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di
alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero,
uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma
di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella
frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di
30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e
antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici
applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per
curare le malattie degenerative delle cellule.
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β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei
carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti
naturali, ad esempio della carota.
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Descrizione dell’esperienza:
Materiale utilizzato:
Bilancia tecnica
Pipette graduate
2 becker, beuta, matraccio
Cotone idrofilo
Sostanze utilizzate:
50g pomodoro concentrato
Diclorometano
N-esano
Alcool etilico 95%
Sodio solfato anidro
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Procedimento:
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Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e
aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la
spatola;
Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la
miscela pressando leggermente
Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;
Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;
Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il
filtrato in una beuta.
Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo
volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.
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SEMINA
La semina viene
effettuata
con il nostro campione da
analizzare,tramite un
apparecchio chiamato
microsiringa o con un
semplice capillare per
punto di fusione; questo
procedimento deve
essere fatto
accuratamente
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OSSERVAZIONI
Il β-carotene è la
componente che sale
con maggiore velocità
sulla lastra a causa
della maggiore affinità
con l’eluente.
Il licopene invece
viene rallentato
perché instaura dei
legami con la fase
stazionaria che è il gel
di silice.
Licopene
β-carotene
Campione
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ANALISI DATI
L’analisi dei dati si basa
su un fattore chiamato:
Rf
Rf= corsa della macchia /corsa
dell’eluente
Ogni sostanza ha un Rf
diverso.
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ANALISI A UV
Qualora non sia possibile
osservare direttamente le
macchie di campione sulla
superficie della lastrina caso molto frequente - si
può ricorrere
all'osservazione sotto luce
ultravioletta o alla reazione
con reagenti che
sviluppano composti
colorati
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CONFRONTO SPETTRI
LICOPENE STANDARD
LICOPENE ESTRATTO
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CONFRONTO SPETTRI
β – CAROTENE STANDARD
β – CAROTENE ESTRATTO
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CONCLUSIONI
La tecnica TLC permette di separare i
componenti principali di una miscela;
le sostanze estratte sono pure, cioè
molto simili agli standard.
E’ possibile estrarre i componenti dal
pomodoro.