Progetto
“Lauree Scientifiche”
Cromatografia
su strato sottile
- TLC -
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“Lauree Scientifiche”
CROMATOGRAFIA
Nella cromatografia, le separazioni
possono avvenire su colonna
(colonna cromatografica)
o su un supporto planare
(TLC)
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“Lauree Scientifiche”
CROMATOGRAFIA SU STRATO
SOTTILE (TLC)
La cromatografia su strato
sottile o TLC, è una tecnica
cromatografica
di
semplice
preparazione; questo la rende
particolarmente
adatta
per
l'esecuzione
di
valutazioni
qualitative o semi-quantitative.
Come tutte le cromatografie, si
basa sulla diversa separazione
di diverse sostanze tra una fase
stazionaria ed una fase mobile,
in funzione dell'affinità di ogni
sostanza con esse.
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PRINCIPIO DI
FUNZIONAMENTO
Tutti i componenti della miscela sono depositati
sulla lastra (fase stazionaria) e sono trasportati
(eluiti) da un solvente (fase mobile) che si
muove.
Nella TLC l’eluente si muove dal basso verso l’alto
attraverso un strato sottile per capillarità.
I composti si muovono con diversa velocità, in
base alla diversa affinità della sostanza
analizzata, verso un eluente e verso la fase
stazionaria.
Si ha separazione poiché i composti più affini
all’eluente si muovono di più sulla lastra.
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FASE STAZIONARIA
La fase stazionaria è generalmente uno strato
dallo spessore uniforme di circa 1 mm di
materiale adsorbente, depositato su una lastra di
vetro o plastica. Il materiale adsorbente può
essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere
o polvere di diatomee, tutti materiali polari
Fasi stazionarie (per TLC):
Silice: la superficie dei granuli
OH
OH
OH
O
O
O
di silice è caratterizzata dalla
Si
Si
Si
presenza di gruppi silanolici
O
O
O
O
(Si-OH) e di gruppi silossanici
(Si-O-Si):
Sistema tetraedrico di SiO4
Si
Si
Si
Allumina: è ottenuta dall’idrossido di alluminio mediante
opportuni trattamenti e disidratazione a 400-500°. Si può
ottenere in tre forme:
O
Cl
Al
Al
O
O
Na
Al
O
Al
O
Al
Al
O
Cl
Na
acida (pH circa 4)
neutra
basica (pH circa 10)
per acidi carbossilici e
aminoacidi
per composti neutri
per amine
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FASE MOBILE
La fase mobile è un solvente opportunamente
scelto (od una miscela di solventi), capace di
separare i componenti della miscela da analizzare
e poco affine per polarità alla fase stazionaria
scelta.
Fasi mobili (per TLC):
La TLC utilizza un’ampia varietà di
solventi, con diverso grado di polarità:
potere eluotropo: forza con cui il
solvente è in grado di trascinare
l’analita lungo la lastrina;
solventi apolari (idrocarburi alifatici
quali esano o eptano) per soluti con
polarità molto bassa;
idrocarburi clorurati (CHCl3, CH2Cl2),
tetraidrofurano, etere etilico,
acetonitrile, alcool isopropilico: in
ordine di polarità crescente
Esempio di serie di eluenti
Con forza eluente crescente
Su fase fissa polare
n-pentano
isoottano
cicloesano
di carbonio
xilene
toluene
benzene
cloroformio
metilene cloruro
tetraidrofurano
acetone
acetato di metile
anilina
n-propanolo
etanolo
metanolo
acido acetico
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I vantaggi della tecnica TLC
visibilità delle sostanze che rimangono sul punto di
deposizione
preparazione del campione spesso non necessaria
utilizzo fasi mobili che assorbono in UV
vasta scelta di reagenti chimici coloranti selettivi
grande numero di campioni trattabili
simultaneamente
velocità di condizionamento
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TECNICA CROMATOGRAFICA
La traccia rossa è la
sostanza più affine con
l’eluente in quanto ha
percorso un tragitto più
lungo.
La traccia gialla
rappresenta una
sostanza meno affine
all’eluente,infatti ha
percorso una distanza
minore.
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Separazione TLC di estratto di
pomodoro
Analizzare un concentrato di pomodoro
Estrarre sostanze principali: licopene e
β-carotene
Eseguire la tecnica cromatografica TLC
Separare ed identificare componenti
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Pigmenti nel concentrato di pomodoro:
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LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei
carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del
pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di
alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero,
uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma
di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella
frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di
30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e
antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici
applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per
curare le malattie degenerative delle cellule.
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β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei
carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti
naturali, ad esempio della carota.
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Descrizione dell’esperienza:
Materiale utilizzato:
Bilancia tecnica
Pipette graduate
2 becker, beuta, matraccio
Cotone idrofilo
Sostanze utilizzate:
50g pomodoro concentrato
Diclorometano
N-esano
Alcool etilico 95%
Sodio solfato anidro
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Procedimento:
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Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e
aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la
spatola;
Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la
miscela pressando leggermente
Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;
Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;
Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il
filtrato in una beuta.
Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo
volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.
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SEMINA
La semina viene
effettuata
con il nostro campione da
analizzare,tramite un
apparecchio chiamato
microsiringa o con un
semplice capillare per
punto di fusione; questo
procedimento deve
essere fatto
accuratamente
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OSSERVAZIONI
Il β-carotene è la
componente che sale
con maggiore velocità
sulla lastra a causa
della maggiore affinità
con l’eluente.
Il licopene invece
viene rallentato
perché instaura dei
legami con la fase
stazionaria che è il gel
di silice.
Licopene
β-carotene
Campione
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ANALISI DATI
L’analisi dei dati si
basa su un fattore
chiamato: Rf
Rf= corsa della macchia /corsa
dell’eluente
Ogni sostanza ha un Rf
diverso.
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ANALISI A UV
Qualora non sia possibile
osservare direttamente le
macchie di campione sulla
superficie della lastrina caso molto frequente - si
può ricorrere
all'osservazione sotto luce
ultravioletta o alla reazione
con reagenti che
sviluppano composti
colorati
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CONCLUSIONI
La tecnica TLC permette di separare i
componenti principali di una miscela;
le sostanze estratte sono pure, cioè
molto simili agli standard.
E’ possibile estrarre i componenti dal
pomodoro.