Sistemi per omogeneizzare e
frazionare tessuti e cellule
Per poter essere studiati in dettaglio le
molecole biologiche e i vari complessi
sub-cellulari devono essere isolati dal
materiale di partenza.
IL primo passaggio consiste nella
distruzione della struttura cellulare o dei
tessuti.
Coltura
cellulare
o tessuto
• 1-Scelta del materiale di partenza
• 2-Metodo di rottura delle cellule
• 3-Proprietà chimico-fisiche delle
soluzioni impiegate.
Metodi per rompere le cellule
• -metodi blandi:
•
lisi per osmosi
•
digestione enzimatica
•
solubilizzazione chimica
•
omogenizzatori
• -metodi moderati
•
omogenizzatori a lama
•
mortaio
• -metodi vigorosi
•
French press
•
Sonicazione
•
Macinazione con microsfere
METODI BLANDI
Lisi per osmosi
Na+, Ca2+
K+
Mg2+
Shock
osmotico
Le cellule animali riescono a mantenere costante la concentrazione
intracellulare di soluti scambiando
attivamente (consumo di ATP) ioni
con l’esterno.
Un abbassamento drastico della pressione osmotica esterna (immersione in acqua
distillata) provoca un rigonfiamento delle
cellule ed una ‘esplosione’ delle membrane.
Digestione enzimatica
Lisi della
parete+
shock osmotico
Solubilizzazione chimica
-
+
O SO3 Na
Sodio dodecil solfato
Omogeneizzazione con potter
METODI MODERATI
Omogeneizzatori con lama (frullatore)
Macinazione con mortaio
METODI VIGOROSI
French press
Pistone
Camera di
compressione
Valvola a
spillo
SONICAZIONE (ultrasuoni)
SOLUZIONI
• Il tampone ideale deve possedere le seguenti
qualità:
– Tamponare a pH vicino alla neutralità
– Essere altamente solubile.
– Non penetrare attraverso le membrane (se si
studiano organelli).
– Essere stabile chimicamente ed enzimaticamente
– Non assorbire luce nelle regioni dello spettro UVvisibile
– Non essere tossico.
ACIDO O BASE
pK
Acido acetico
4.75
Acido citrico
4.76 (pKa2)
6.4 (pKa3)
MES
6.35 (pKa1)
10.3 (pKa2)
6.8
PIPES
acido 1,4piperazinodietansulfonico
Imidazolo
Acido fosforico
È efficace come tampone solo a pH acidi (4-5.5).
È efficace come tampone a pH <7. Tende a chelare gli ioni
polivalenti.
È uno dei cosiddetti ‘Good buffers’ (dal nome di chi ne ha
esplorato l’uso in biochimica e biologia cellulare), come
anche Bicina, PIPES, HEPES ed altri. Poco tossico per le
cellule.
6.1
acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico
Acido carbonico
note
La forma diprotonata tende a formare CO2. Più utile come
tampone per la biochimica, a pH alcalini, lo ione
monoacido.
Relativamente costoso, ma valido. Interagisce pochissimo con i
metalli divalenti (Ca2+, Mg2+, Mn2+). Può interferire con il
metodo di Lowry per la determinazione della
concentrazione proteica.
7.0
7.2 (pKa2)
12.3 (pKa3)
HEPES acido N-2-idrossietil-piperazina-N’-2-
Poco costoso. È spesso metabolita o inibitore di sistemi
enzimatici. Tende a precipitare i cationi polivalenti.
7.5
Vedi PIPES.
8.1
Poco costoso e molto usato. Tuttavia può dare effetti inibitori con
molti sistemi enzimatici ed interagire fortemente con I
metalli di transizione. Il suo pKa varia sensibilmente con la
temperatura
etansulfonico
Tris
Tris(idrossimetil)aminometano
Bicina
8.35
Un ‘Good buffer’.
9.2
Forma complessi con gli acidi nucleici.
N,N’-bis-(2-idrossietil)glicina
Acido borico
Glicina
9.8 (pKa2)
ALTRI COMPONENTI DEL MEDIUM
• Ioni Mg2
• Composti tiolici (2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo,
glutatione, cisteina…) vengono utilizzati per
mantenere ridotti i gruppi sulfidrilici delle
proteine essenziali).
• Inibitori di proteasi..
• Per gli acidi nucleici, RNA in particolare,
occorrerà usare degli inibitori di nucleasi
(RNAsina, cocktails di anticorpi specifici per le
ribonucleasi, vanadil nucleotidi…).