Fibrosi Cistica II
Lezione 8
By NA
Linkage-lod score
 Il linkage e’ una relazione di vicinanza fra due loci ed e’ funzione della loro
distanza. La definizione di un linkage fra due loci si basa su calcoli statistici
che permettono di quantizzare la probabilta’ che i risultati ottenuti non siano
dovuti al caso . Nel caso dell’uomo l’analisi della progenie di una singola famiglia
raramente fornisce informazioni sia per lo scarso numero di meiosi sia per la
difficolta’ di risalire alla fase. Bisogna mettere insieme i dati provenienti da
piu’ famiglie.
P di un assortimento genetico in una progenie se i geni sono associati
Odds
ratio=
P di un assortimento genetico nella progenie se i geni sono indipendenti
(1- n r
(1/2)n+r
Lod score: logaritmo in base 10 dei singoli rapporti di ogni famiglia, si possono cosi
sommare. Un valore di 3 indica linkage.
By NA
LOD SCORE
LOD SCORE (Z):
logaritmo della probabilita’ che i loci siano associati (data la
frazione di ricombinazione q ) piuttosto che non associati (q=0.5). La probabilita’
complessiva di un gruppo di famiglie e’ il prodotto delle probabilta’ di ciascuna famiglia,
percio’ la somma dei lod score. Per q = 0.5, Z=0: infatti sono il rapporto fra probabilta’
identiche e log10(1)=0. Z=3(1000:1) e’ la soglia per accettare il linkage con una
probabilita’ di errore del 5%. Z=-2 esclude il linkage.
Z
4
3
2
1
0
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Frequenza di ricombinazione
By NA
0.5
Fibrosi Cistica
ancora storia
 1985: Analisi di linkage: il gene
della fibrosi cistica (CF) viene
associato ad un polimorfismo proteico (enzima paraossonasi) di cui si ignora
la localizzazione.
Per una patologia autosomica
recessiva l’analisi di linkage e’
ostacolata dal fatto che non si
conosce la FASE, per cui il
calcolo si effettua prima
considerando che i 2 loci(allele
polimorfico e locus malattia)
siano in cis e poi in trans e il
valore di lod score sara’ la
media tra i due valori ottenuti.
By NA
-/+
-/+
-/-
-/+
-/-
Fibrosi Cistica
ancora storia
 1986: Furono trovati altri marcatori associati alla CF
e il gene della paraossonasi viene mappato sul cromosoma 7.
TRA
OGNUNO DI QUESTI
MARCATORI E IL GENE DELLA
CF SONO STATI TROVATI
DEI RICOMBINANTI.
NESSUNO
DI
QUESTI
MARCATORI
E’
IL
REALE
RESPONSABILE DELLA CF.
 Identificata la regione, utilizzando gli RFLP della regione, si
restringe la mappatura di CF alla bande citogenetiche 7q31-32. Si
definirono inoltre i marcatori fiancheggianti: oncogene MET
prossimale e D7S8 (clone anonimo) distale
Met
CF
0.4
By NA
D7S8
0.3
Fibrosi Cistica:ancora
storia
 1986-:
si identificano altri polimorfismi nella regione e si fonda un
consorzio per cumulare i dati raccolti in piu’ centri. Viene attuato prima il
chromosme walking, successivamente, per ovviare alla brevita’ delle sonde
disponibili, si passo’ al chromosme jumping
 1989: si riesce ad evidenziare la presenza di linkage disequilibrium per
i marcatori XV2.c e KM19 che risulteranno far parte del 5’ del gene
Cos’e’ il linkage disequilibrium?
By NA
Linkage disequilibrium
Il linkage e’ una relazione fra loci, mentre l’associazione e’ la relazione fra alleli.
Associazione allelica significa che se degli individui hanno un certo allele in un locus, la
probabilita’ di avere un particolare allele di un altro locus e’ statisticamente piu’ alta
di quella legata al caso e/o alla frequenza del secondo allele nella popolazione. Es. un
particolare antigene HLA e’ presente nel 78% della popolazione con artrite
reumatoide, ma e’ presente nel 36% della popolazione generale.
L’associazione e’ un’ asserzione statistica che segnala la ricorrenza contemporanea
di alcuni alleli o di fenotipi. L’associazione ha cause diverse,non necessariamente
genetiche, mentre il linkage e’ una relazione specifica legata alla vicinanza fisica di due
locus. Es. se il locus A e’ fisicamente associato ad un locus malattia, in una specifica
famiglia un particolare allele di quel locus segrega con la malattia, in un altra e’ un altro
allele, ma nella popolazione generale entrambi gli alleli sono presenti anche associati al
gene normale.
By NA
Linkage disequilibrium
LINKAGE EQUILIBRIUM: l’associazione in cis o trans di 2 alleli su un
cromosoma e’ casuale. Se definiamo APLOTIPO la particolare combinazione di
alleli sul cromosoma, la frequenza di ogni aplotipo e’ pari al prodotto delle
frequenza dei singoli alleli.
LOCUS ALLELI
By NA
FREQUENZA
APLOTIPI FREQUENZA
1
A
a
p
q
A
B
2
B
b
r
s
A
b
pr
ps
a
B
qr
a
b
qs
NON SEMPRE E’
COSI….
Linkage disequilibrium
 Il
linkage disequilibrium e’ una situazione per cui un particolare
aplotipo e’ statisticamente piu’ probabile in un sottogruppo di una
popolazione. Indica che la popolazione deriva da un comune ancestore o, nel
caso delle mutazioni patogene, che la mutazione e’ avvenuta su un
cromosoma ancestrale comune alla popolazione. Il linkage disequilibrium non
ha niente a che fare con la presenza della mutazione patogena e’ una
osservazione che facilita la mappatura genetica. Indica che fisicamente
associato al locus A polimorfico c’e’ un altro locus che, quando mutato
origina la malattia. Essendo un fenomeno legato all’origine comune degli
individui della popolazione, in un’altra popolazione il disequilibrium
riguardera’ un altro allele del locus A
By NA
Linkage disequilibrium
 E’
necessario considerare tutte le cause
disequilibrium e’ solo una delle cause
dell’associazione: il linkage
 Causa-effetto
e selezione naturale: Un certo allele rende piu’
suscettibili a manifestare la malattia o permette alle persone malate di
sopravvivere e di avere figli
 Errori
per la stratificazione della popolazione o per mancata
correzione statistica: se una popolazione e’ composta di sottoinsiemi
geneticamente distinti entrambi i marker possono essere piu’ frequenti, ma
senza che questo implichi un’associazione. Nel secondo caso i dati non
vengono confermati da studi successivi
By NA
Fibrosi Cistica e linkage disequilibrium
Il gene della Fibrosi Cistica e’ stato clonato grazie alla
presenza del linkage disequilibrium.
CHR CF
(254 con mut)
CHR NORMALI
(318 wild-type)
ALLELE di
XV-2C
ALLELE di
KM-19
numero
percentuale
numero
percentuale
A
1
1
17
6.7
74
28.9
B
1
2
218
86.5
35
16.4
C
2
1
7
2.8
110
44
D
2
2
10
4
31
10.7
APLOTIPO
Incerto
2
4
Dati ottenuti su 114 famiglie britanniche con un figlio affetto.
Il cromosoma CF, identificato perche’ presente nell’affetto,
tende a portare gli alleli X1 e K2.
By NA
Possibili cause del linkage disequilibrium
Potrebbe
essere causa dell’effetto del fondatore: la mutazione potrebbe essere
comparsa in un antenato della popolazione Nord-Europea che portava l’aplotipo B e
probabilmente gli eventi di ricombinazione non hanno avuto sufficiente tempo per
rispristinare una situazione di equilibrio, cioe’ ad una associazione casuale. Cio’ significa
anche che gli eventi di ricombinazione sono rari tra il gene CF e i due marcatori cioe’ il
locus malattia e’ strettamente associato ai due marcatori XV-2C e KM-19
La
presenza di un particolare aplotipo potrebbe conferire un vantaggio selettivo
nell’individuo che lo porta (come accade per gli antigeni HLA: particolari aplotipi
sembrano migliorare la risposta immunitaria e percio’ sono sottoposti a pressione
selettiva)
La
conoscenza del linkage disequilibrium oltre a dare una indicazione della
localizzazione precisa del locus malattia, risulta utile per la consulenza: permette di
calcolare con maggiore precisione il rischio di trasmissione. Es: normalmente 1/25
portatori nella popolozione nord-europea, ma se un individuo ha aplotipo BB il rischio
e’ maggiore, mentre e’ molto ridotto per aplotipi AA.
By NA
Clonaggio del gene della CF
Tecniche utilizzate
Gene walking
Chromosome jumping
RICERCA DELLE MUTAZIONI
By NA
Zoo- blot
CFTR
1989:
una volta clonato il gene putativo, bisogno’ dimostrare che era il
gene della fibrosi cistica. Furono pertanto esaminati gli affetti e si trovo’
che il 70% dei cromosomi CF presentavano la delezione di una tripletta
(F508) senza che venisse alterata la ORF. Il prodotto del gene e’ stato
definito CFTR( cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).
OUT
IN
Nterm
By NA
ATP
ADP+
Pi
NBD1
R
Domain
Cterm
NB21
ATP
ADP+
Pi
Conferma del coinvolgimento di CFTR
La presenza in omozigosi della F508 in individui gravemente
affetti non era conclusiva, anche se molto convincente: la
delezione avrebbe potuto essere un polimorfismo come altri in
linkage disequilibrium strettissimo con il gene. La identificazione
del coinvolgimento di CFTR nel trasporto dello ione cloro
attraverso le membrane apicali e la caratterizzazione di alcune
mutazioni il cui effetto era piu’ evidente sull’espressione del gene
confermarono che CFTR era il gene della Fibrosi cistica.
CFTR
cloro
By NA
Diagnosi di CF
 Oggi sono state descritte oltre 700 mutazioni nel gene
CFTR
Molte vengono definite mutazioni private, perche’ individuate in una sola
famiglia. In molti casi non e’ certo che siano patogene, potrebbero
essere sequenze varianti in un cromosoma in cui e’ presente un allele CF.
Non ci sono altre mutazioni molto frequenti, sono tutte mutazioni con
frequenza che non supera qualche punto percentuale. Sono state trovate
mutazioni di diverso genere lungo tutto il gene e probabilmente altre
devono essere ancora scoperte
La presenza di centinaia di mutazioni diverse rende
molto difficili i test diagnostici per la CF
Screening per PCR e
successiva amplificazione
By NA
Amplificazione specifica con primer
che legano sequenze mutate
Tipi di mutazione
SONO STATE TROVATE MUTAZIONI DI VARIO GENERE:
Mancata produzione della proteina(frameshift e non senso)
Mancato processamento della proteina e conseguente
ripiegamento anomalo della stessa e incapacita’ di fuoriuscire nel
lume cellulare(F508)
Non corretta regolazione della proteina: il canale ionico e’
regolato tramite fosforilazione da parte di kinasi cAMP dipendenti,
mutazioni nei domini regolatori della proteina portano al mancato
funzionamento di questo sistema.
Mutazioni puntiformi che distruggono il canale stesso.
Alcuni soggetti presentano mutazioni in omozigosi e sono affetti
piu’ gravemente.
Esistono anche casi di eterozigosi composta con mutazioni
diverse nello stesso soggetto.


By NA
Ricerca delle mutazione nel gene CFTR
Le mutazioni CF sono piu’ di 700, le piu’ comuni hanno frequenza
diversa nelle popolazioni:
F508 va dal 50% nel mediterraneo all’85% in Danimarca e nei paesi
baschi, in media il 70% degli ALLELI MUTATI sono F508. Altre 12
mutazioni hanno una frequenza combinata del 15%. quindi le frequenze
medie dei genotipi dei MALATI di fibrosi cistica sono :
49% F508/F508
21% F508/mutaz. comune non F508
21% F508/mutaz.rara
4.5% mutaz. comune non F508/mutaz. rara
2.25% mutaz. comune non F508/ mutaz. comune non F508
2.25% mutaz. rara/mutaz. rara
Circa il 90% degli affetti ha almeno un allele F508 e sara’ comunque
possibile in Europa identificare circa il 70% dei genotipi utilizzando i
test per le mutazioni comuni
By NA