MENDEL
•Studio di “caratteri” che si presentano in
forme alternative
Prima legge di Mendel
I fattori responsabili della trasmissione
ereditaria di particolari tratti (geni) sono unità
discrete che sono presenti in doppia copia
nei genitori (alleli) e si separano
(segregano) durante la formazione dei
gameti. I gameti si combinano casualmente
dando origine a 4 combinazioni alleliche nella
F2
•Il tratto “liscio” è dominante su “rugoso”
(recessivo)
•Il tratto recessivo riappare nella generazione
F2 in rapporto 3:1
AA
aa
A
a
Aa
A
a
A AA Aa
a Aa aa
Genitori
Gameti
F1
F2
INROCIO MONOIBRIDO
P: lisci x rugosi
F1: tutti lisci
F2: 5474 lisci e 1850 rugosi (1:3)
Seconda legge di Mendel:
Assortimento indipendente dei caratteri
Comportamento di due caratteri :
•Segregazione indipendente dei due alleli di un carattere
(R r) rispetto a quelli dell’altro (Y y)
•Formazione di 4 tipi di gameti in proporzioni uguali
•Incontro casuale dei gameti -> comparsa di 4 fenotipi
nella F2 nel rapporto 9:3:3:1
•Fenotipi parentali + ricombinanti
NB si riferisce solo a caratteri relativi a geni localizzati
su cromosomi diversi o geni sullo stesso cromosoma
distanti fra loro
P1:
F1:
F2
liscio/giallo x rugoso/verde
RRYY
rryy
tutti lisci/gialli
RrYy x RrYy
BBVgVg x bbvgvg
B-Vg b-vg b-Vg B-vg
b-vg
Morgan
Studio della ricombinazione in Drosophila
Bb
Vgvg
Bb
bb bb
vgvg Vgvg vgvg
Mappaggio di loci attraverso l’analisi della freq di ricombinazione
ANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI
 Determinare la frequenza con cui due loci ricombinano fra loro alla meiosi =
TETHA (
•
se due loci sono su cromosomi diversi o molto lontani sullo stesso cromosoma
segregano indipendentemente. La probabilità che vengano ereditati insieme è
del 1/2 ->  = 50%
•
Se due loci sono vicini fra loro sullo stesso cromosoma saranno ereditati
insieme più frequentemente ->  < 50%
Tanto più sono vicini, tanto più piccola è la probabilità che avvenga un
crossing-over
LA FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE () E’ UNA MISURA DELLA
DISTANZA GENETICA
DISTANZA GENETICA =
numero atteso di crossing-overs fra 2 loci per meiosi
•L’unità di misura della distanza genetica è il Morgan
1 Morgan = 100 centiMorgan (cM)
•In media 1 cM corrisponde a circa 106 bp. Genoma umano ≈ 3x109 = 33 Morgan
•Le frequenze di ricombinazione fra loci non sono additive (a causa dell’effetto dei
crossing-over multipli)
A1
C2
B1
• Per  <10% c’è una corrispondenza ≈ 1:1 fra  e cM :
A2
C1
1 cM ≈  = 1%
• Per  <10% si usano delle funzioni di mappa per convertire  in cM e viceversa
Funzioni di mappa -> relazione fra frazione di ricombinazione e distanza genetica
Haldane:
 = -1/2 ln(1-2)
e-2)
Kosambi tiene conto dell’interferenza
B2
Alleli e genotipi
•Ogni individuo ha due alleli ad ogni locus : genotipo
•Omozigote/Eterozigote
Eterozigosità (H)
Probabilità che un individuo preso a caso sia eterozigote per un determinato marker
H = 1 - (p12 + p22 + p32 + p42 + …..pi2)
EQUILIBRIO DI HARDY-WEINBERG
Relazione tra frequenze alleliche e genotipiche
Presupposto: nella popolazione le unioni sono casuali e non ci sono eventi di mutazione,
selezione, migrazione in atto
LOCUS CON 2 ALLELI
A frequenza p
a frequenza q
p+q=1
A
a
A
AA
p2
Aa
pq
a
Aa
pq
aa
q2
LOCUS AUTOSOMICO
f(AA) = p2
f(Aa) = 2pq f(aa) = q2
p2 + 2pq + q2 = 1
LOCUS LEGATO AL CROM X
Nei maschi:
f(A) = p f(a) = q
Nelle femmine
f(AA) = p2 f(Aa) = 2pq f(aa) = q2
Genotipi, fenotipi e penetranza
• Il fenotipo e’ la caratteristica che deriva dall’avere un
determinato genotipo
• La probabilità che un determinato genotipo risulti
nell’espressione di un fenotipo è la penetranza
• In certi casi la stesso fenotipo può essere determinato da
diversi genotipi (fenocopie)
• Lo stesso genotipo può avere diverse manifestazioni
fenotipiche (pleiotropia)
ANALISI DI LINKAGE (CONCATENAZIONE)
•L’analisi di linkage permette determinare la posizione cromosomica
di un locus responsabile di una determinata malattia/carattere
genetico rispetto a marcatori polimorfici la cui localizzazione è nota
•L’analisi di linkage è un approccio molto utile per il mappaggio e
l’identificazione di geni responsabili di malattie genetiche
Mendeliane
(oltre 1,200 geni identificati)
•Più difficoltosa è l’identificazione dei numerosi geni implicati in
malattie più comuni, ad ereditarietà complessa
(pochissimi geni identificati finora)
POSITIONAL CLONING
REQUISITI
per l’ANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI
1) Una o più famiglie in cui segrega il carattere/malattia in questione
2) MARCATORI GENETICI
•
•
•
Altamente polimorfici .
Facilmente tipizzabili e stabili di generazione in generazione
Posizione nota nel genoma
MARCATORI GENETICI
• Marcatori polimorfici -> presenza di 2 o + alleli
alternativi
• Generalmente non funzionali
• Facilmente tipizzabili e stabili di generazione in
generazione
• Posizione nota nel genoma -> costruzione di
Framework Maps
• Per tutti i cromosomi sono state create mappe
genetiche di marcatori polimorfici
MARCATORI MOLECOLARI (DEL DNA)
RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
•Presenza/assenza sito di taglio di enzima di restrizione
•Biallelici
•Southern blot / PCR
MICROSATELLITI
• ripetiz in tandem di 2-3-4 nucleotidi (CA)n
•Molti alleli, molto informativi
•Distribuiti in modo uniforme nel genoma. ≈ ogni 100 Kb
•PCR / marcatura con fluorescenza
SNPs (Single Nucleotyde Polymorphisms)
•Differenze di singola base, non necessariamente riconosciuti da enz. di restriz.
•Biallelici
•Molti frequenti
•Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala
ANALISI GENETICA DI CARATTERI UMANI
Impossibilità di eseguire incroci “sperimentali”
Famiglie piccole e tempi di generazione lunghi
Alberi genealogici
I
1
II
III
1
1
2
2
2
3
3
4
4
5
5
6
7
IV
V
1
1
2
3
4
2
5
Tratto AUTOSOMICO DOMINANTE
•
•
•
•
aa
Aa
aa
Aa
Una persona affetta ha almeno un genitore affetto
I due sessi sono colpiti in modo uguale
Carattere trasmesso da ambedue i sessi
Un figlio di un affetto x non-affetto ha il 50% di probabilità di essere affetto
(se genitore affetto=eterozigote)
La > parte delle mutazioni che causano malattie dominanti (rare) sono presenti
solo in eterozigosi
Tratto AUTOSOMICO RECESSIVO
Aa
Aa
Aa
A
aa
A
Aa
Aa
a
a
AA
Aa
Aa
aa
aa
•Di solito i genitori di individui affetti sono sani (portatori asintomatici)
•I due sessi sono colpiti in modo uguale
•Se due genitori sono portatori la probabilità di avere un figlio affetto è 1/4
•Maggiore frequenza di consanguineità
Cromosomi X e Y -> eteromorfi
•Crom X contiene migliaia di geni
•Crom Y costituito per lo piu’ da eterocromatina, pochi geni funzionali
•SRY -> gene determinante il sesso maschile
•Regioni pseudoautosomiche (PAR): regioni con omologia al
cromosoma X
•Sono le regioni dove ha luogo l’appaiamento e il crossing over col crom X
•Il crossing over a livello delle PAR assicura la corretta segregazione X-Y
•PAR1 -> crossing over obbligato -> Altissima freq di ricombinazione
SRY
INATTIVAZIONE DEL CROMOSOMA X
NB inattivazione non random
nei tessuti extra-embrionali
Tratto RECESSIVO LEGATO AL CROMOSOMA X
X
Y
xY
Xx
XY
x
xX
xY
Y
X
x
XX
Xx
XY
xY
X
X
xX
xX
XY
XY
•Gli individui affetti sono prevalentemente maschi (emizigoti)
•I genitori di maschi affetti sono normali: la madre è una portatrice asintomatica
•Le femmine possono essere affette se la madre portatrice ed il padre è affetto.
-> Talvolta come conseguenza del pattern di inattivazione del cromosoma X
•Il carattere non puo’ essere trasmesso da padre a figlio
Tratto DOMINANTE LEGATO AL CROMOSOMA X
XY
xY
xY
Xx
xx
Xx
xY
Xx
Xx
XY
xx
Xx
Xx
xY
•Ambedue i sessi sono affetti, ma femmine > maschi
•Spesso le femmine hanno sintomi più lievi o più variabili dei maschi
•Se un maschio è affetto, trasmetterà il carattere a tutte le figlie e a nessun figlio
•Se una femmina è affetta, trasmetterà il carattere alla metà dei figli, maschi o femmine
ANALISI DI LINKAGE
Metodo Parametrico (o Model based)
Definizione di un modello di ereditarietà del locus-malattia
gene malattia bi-allelico con frequenze alleliche e penetranze conosciute
Esempio:
Singolo locus D = allele “mutato” d = allele wild-type
Frequenze alleliche: P(D) = p, P(d) = 1- p = q
Penetranze: fDD , fDd , fdd
La posizione del gene malattia è considerato sconosciuto
-> Stima di  fra il locus malattia ed il marcatore
Conteggio dei ricombinanti  = ___R___
(R + NR)
Si stima la posizione genetica del locus malattia calcolando la likelihood dei dati
osservati al variare della frazione di ricombianzione
Metodo del LOD SCORE
(Metodo della massima verosimiglianza)
Confronto della probabilità dei genotipi osservati nelle ipotesi alternative di linkage o
assortimento indipendente
Ho = i due loci sono indipendenti ->  = 0.5
H1 = i due loci sono in linkage -> 0 <  < 0.5
Likelihood [L()] = Probabilità che i dati osservati si verifichino quando la
fraz di ricombinaz è 
Likelihood ratio test:  è significativamente < 0.5?
LOD = log of the odds
Z() = log10 [L()/L( =0.5)]
Calcolo di pedigree likelihood:
Algoritmi Elston-Stewart, Lander-Green, MCMC
ESEMPIO CONTEGGIO RICOMBINANTI E CALCOLO DEL LOD SCORE:
1) Pedigree a fase nota
1)Modello di ereditarietà:
dd
25
Deduco i genotipi per locus malattia
Dd
11
2)LA FASE E’ NOTA
3)Individuo i ricombinanti
dd
34
Dd
12
Dd
13
Dd
13
dd
Dd
dd
24
14
24
Dd
23
NR
NR
NR
R
NR
NR
LOD SCORE (LOD)
Z = log10
 R ( 1- ) NR
0.5 (R+NR)
No ricomb
Per  = 0
Z = log10
> 1 ricomb. Z = - ∞
1
0.5 N
ESEMPIO CONTEGGIO RICOMBINANTI E CALCOLO DEL LOD SCORE:
2) Pedigree a fase non nota
1)Modello di ereditarietà:
Deduco i genotipi per locus malattia
2)LA FASE NON E’ NOTA
?
Dd Dd
21 12
3)Individuo i ricombinanti
dd
34
Dd
13
Dd
13
dd
Dd
dd
24
14
24
Dd
23
NR
NR
NR
NR
NR
R
Se la fase è
R
R
R
R
R
NR
Se la fase è
LOD SCORE (LOD)
Z = log10
1 R
2
( 1- ) NR +
0.5 R+NR
1
2
 NR ( 1- ) R
0.5 R+NR
Dd
12
Dd
21
Spesso i dati ricavati da una solo famiglia non sono sufficienti per stabilire
presenza /assenza di linkage.
I lod score ottenuti da famiglie indipendenti (per lo stesso valore di ) si possono
sommare fra loro
Si calcola il lod score per diversi valori di  ( = 0, 0.1, 0.2,…, 0,5) ->
Tabella
tetha
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Fam 1
-inf
0.28
0.32
0.22
0.08
Fam2
1.20
1.02
0.82
0.58
0.32
Fam3
-inf
1.36
2.68
2.71
1.91
Totale
-inf
2.66
3.82
3.51
2.31
Massimo Lod score (MLS)
Valore max di lod score che si ottiene al variare di un parametro (generalmente )
Il valore di  per cui il LOD è massimo è la stima più probabile della frazione di
ricombinazione
linked, no
recombination
ESEMPIO DI CALCOLO LOD SCORE
22
12
34
12
23
14
24
23
24
NR
NR
NR
R
NR
Z = log10
22
NR
R
 ( 1- ) 4
0.5 5
Famiglia
1
2
Totale
0.05
22
12
12
NR
R
22
NR
R
12
NR
R
Z = log10 1/2 ( 1- ) 4 + 1/2  4
0.5 4
0.5 4
Frazione di ricombinazione
0.1
0.2
0.3
0.4
0.12
0.32
0.42
0.36
0.22
0.81
0.72
0.52
0.3
0.09
0.93
1.04
0.94
0.66
0.31
Costruzione di mappe genetiche di riferimento
FAMIGLIE CEPH
Costituiscono un pannello di 40 famiglie di
riferimento, selezionate per la loro
struttura ideale per l’analisi di linkage (3
generazioni, con i 4 nonni, 2 genitori, e
almeno 6 figli).
Mappe genetiche dell’intero genoma:
•Généthon
http://www.genethon.fr
•Marshfield
http://research.marshfieldclinic.org/genetics/
•deCODE
http://www.decode.com/
Passo fondamentale per:
•Mappaggio di loci di malattie
•Hanno costituito una base per la costruzione e la verifica di mappe fisiche
Corrispondenza distanza genetica - fisica
Approssimativamente:
1 cM ~ 1 Mb (1x106 bp)
Non è costante
•Varia da regione a regione
(> verso i telomeri)
•Mappa femminile è più lunga
•Hotspots
TABELLA LOD SCORES A 2 PUNTI
(Abifadel et al. Nat Genet 34:154, 2003)
MULTIPOINT LOD SCORE
Data una mappa di markers con posizione nota, si calcola la likelihood per ogni
posizione del locus malattia lungo il cromosoma. Permette di estrarre il massimo
dell’informazione data da tutti i markers sul cromosoma.
MLS = 4.80
Genome screen
•Uso una collezione di marcatori uniformemente spaziati su tutto il genoma
•Tipicamente ~ 400 microsatelliti (10 cM distanza media)
•Calcolo Lod Score (multipoint) lungo tutti i cromosomi
-> Test multipli
Limiti di significatività
Z > 3 evidenza di linkage è significativa
E’ stato calcolato che questo corrisponde ad un “whole-genome p value” di 0.05:
un falso positivo ogni 20 genome screens
Z < -2 si puo’ escludere la presenza di linkage
COSTRUZIONE DI APLOTIPI: definizione della regione critica
Una serie di alleli per loci adiacenti che vengono ereditati
insieme sullo stesso cromosoma formano un aplotipo
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
– several small nuclear pedigrees
(parents and two or more
affected children) for autosomal
recessive traits
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
– several small nuclear pedigrees
(parents and two or more
affected children) for autosomal
recessive traits
– for autosomal dominant traits,
single extended pedigrees with
several affected individuals in
multiple generations are often
large enough to find significant
linkage
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
• Define, if possible, suitable
genetic model for the disease
Is my disease:
Autosomal or X-linked?
Dominant or recessive?
What is the disease allele
frequency?
and the disease phenotype
penetrance?
Are there phenocopies?
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
• Define, if possible, suitable
genetic model for the disease
• Evaluate power of study
through simulation
What is the maximum
lod-score that I can
achieve in my family, or
collection of families?
What is the average lodscore I can expect to
reach, if there is linkage?
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
• Define, if possible, suitable
genetic model for the disease
• Evaluate power of study
through simulation
• Type markers throughout the
genome, or
How to carry out a linkage study
• Collect pedigree(s)
• Define, if possible, suitable
genetic model for the disease
• Evaluate power of study
through simulation
• Type markers throughout the
genome, or
• Type markers in or near
candidate genes or regions
Results from linkage study
LO D - S C O R E TAB LE R E PO R T
Marker
0.001
0.01
0.05
0.1
0.2
0.3
---------------------------------------------------------------------------------------------D1S199
-4.42
-3.93
-2.78
-1.92
-0.91
-0.38
D1S234
-2.64
-2.47
-1.80
-1.20
-0.54
-0.24
D1S220
-5.26
-4.72
-3.49
-2.51
-1.25
-0.52
D1S209
-1.91
-1.77
-1.35
-0.98
-0.52
-0.26
D1S216
-2.51
-2.11
-1.08
-0.37
0.21
0.27
D1S206
1.04
0.93
0.55
0.23
0.08
0.11
D1S252
3.17
2.84
1.92
1.19
0.39
0.06
D1S498
1.02
1.02
1.01
0.94
0.70
0.39
D1S484
-1.64
-1.46
-1.01
-0.67
-0.29
-0.10
D1S196
-2.54
-2.35
-1.71
-1.15
-0.49
-0.19
D1S218
-2.24
-2.08
-1.59
-1.15
-0.57
-0.24
0.4
-0.12
-0.12
-0.13
-0.10
0.13
0.06
0.01
0.10
-0.01
-0.07
-0.05
S Chavanas et al: Localization of the Netherton Syndrome Gene to Chromosome 5q32, by Linkage Analysis
and Homozygosity Mapping. Am J Hum Genet 66:914, 2000
Recombinants can be used
to identify limits of disease
locus critical region
6
10
8
5
7
8
4
(pedigree adapted from Vitale et al, 2001)
6
5
11 11
4
4
5
5
7
6
8
9
6
5
6
11
4
5
7
8
6
6
10
8
5
7
8
4
5
10
8
5
7
8
4
6
10
8
5
7
8
4
5
11
4
5
6
9
5
6
10
8
5
7
8
4
6
11
7
9
6
8
5
6
11
7
9
6
8
5
6
10
8
5
7
8
4
6
12
5
9
4
8
5
5
11
4
5
6
9
5
5
11
4
5
6
9
5
5
11
4
5
6
9
5
6
10
8
5
7
8
4
6
10
8
5
7
8
4
6
10
8
5
7
8
4
5
11
4
5
6
9
5
6
12
5
9
4
8
5
6
10
8
5
7
8
4
6
10
8
5
7
8
4
6
10
8
5
7
8
5
Complications in linkage analysis:
Genetic heterogeneity
• Genetic (or locus) heterogeneity is when multiple independent genes
can cause the same disease phenotype
• Classic lod-score analysis assumes disease is caused by a single gene
which is the same in all families
• For common conditions, heterogeneity is probably the rule rather than
the exception
• Disease genes will be linked to markers located in different regions of
the genome in different families
• Genetic heterogeneity can lead to false exclusion of linkage when
linked and unlinked families are analyzed together
Complications in linkage analysis:
Genetic heterogeneity
• Carefully select families for homogeneous clinical
features (e.g., age of onset in BRCA):
– sometimes there are no clear differences in phenotype
• Analyze single pedigrees large enough to produce
significant lod-scores:
– may not always be available (e.g., recessive inheritance)
– results are confined to the given pedigree
• Perform linkage analysis allowing for heterogeneity
Complications in linkage analysis:
Incomplete penetrance and phenocopies
• Incomplete penetrance refers to absence of disease phenotype in
individuals with disease genotype
• Non-penetrant carriers will appear as recombinants and may
lead to false exclusion of linkage
• To avoid errors deriving from reduced penetrance, carry out an
“affecteds-only” analysis
• A genetic model including reduced penetrance can be defined in
lod-score analysis
Complications in linkage analysis:
Incomplete penetrance and phenocopies
• For common traits, non genetic cases (sometime called phenocopies)
may co-exist with genetic ones in same family
• Intra-familial genetic heterogeneity may lead to the presence of
affected individuals with different disease genotype in the same family
• As in the case of non-penetrant carriers, these will appear as
recombinants and may lead to false exclusion of linkage
• Phenocopies can be accomodated in lod-score analysis by defining a
non-zero penetrance for the normal disease genotype
•
•
•
•
•
Complications in linkage analysis:
Other possible sources of errors
Pedigree errors (e.g., non paternity)
Misclassification of affected and unaffected
individuals (errors in diagnosis)
Misclassification of marker genotypes (typing
errors)
Incorrect marker map (in multipoint analysis)
Incorrect estimates of marker allele frequencies in
pedigrees with untyped individuals (especially in
two point analysis)
Marker allele frequencies can affect results of linkage analysis
Single nucleotide polymorphism
(SNP) with alleles 1 and 2
22
If mother is 11, daughter is a recombinant
Mother can be 11 or 12
12
12
If mother is 12, phase of daugher
is unknown and chances are 50:50
that she is a recombinant or a non
recombinant
1 1 Probability of mother’s genotype
depends on marker allele frequencies
in the general population
Complications in linkage analysis:
Complex mode of inheritance
• Many common traits result from interaction of
several genes and environmental factors
• Disease transmission does not follow a simple
Mendelian mode of inheritance
• Lod-score analysis assumes knowledge of genetic
model underlying transmission of disease
• It may not be the best method for detection of
genes responsible for complex traits
Programmi:
Linkage, Fastlink, Vitesse, Simwalk, Merlin, Genehunter
http://linkage.rockefeller.edu/soft/list.html