Analisi del linkage
(concatenazione)
Corso di Genetica per la Facoltà
di Medicina e Chirurgia
dell’Università di Torino
Alberto Piazza
Ibridi cellulari somatici
Analisi di ibridi cellulari somatici
La rodopsina è un gene il cui difetto può causare la Retinite
Pigmentosa (RP), una malattia genetica eterogenea (30% X, 25%AD,
45%AR, causa maggiore di cecità: 1/4000). Sulla base di questa
analisi, quale è il cromosoma umano su cui è localizzato il gene?
Crossing-over singoli e doppi
L’effetto della
ricombinazione
Crossing-over tra
cromosomi
omologhi nella
meiosi
Distribuzione dei ricombinanti tra due
loci per diverse distanze tra i loci
DeM
molto lontani
D e M molto vicini
D e M abbastanza lontani
Linkage tra il gene
per una forma
autosomica
dominante di retinite
pigmentosa, RP9, e
due geni marcatori
AeB
sul cromosoma 7
Analisi della concatenazione (o “linkage”)
Concatenazione – si evidenzia quando due loci (geni) sono
localizzati sullo stesso cromosoma sufficientemente vicini così
che la loro frequenza di ricombinazione è minore del 50%
Frequenza di ricombinazione (%) la probabilità di
ricombinazione tra due loci
Frequenza di ricombinazione 50% è come se i geni fossero
localizzati su cromosomi diversi
Frequenza di ricombinazione di 1% = 1centiMorgan
centiMorgan (cM) – unità di misura genetica della frequenza di
ricombinazione tra due loci, di lunghezza approssimativamente
costante (la distribuzione dei crossing-over varia in misura minima
a seconda del cromosoma e se si tratta di meiosi maschili o
femminili), equivalente alla distanza fisica di circa 2 x 106 bp (paia
di basi)
Analisi del linkage
Richiede famiglie di grandi dimensioni in cui siano presenti più
persone affette e non affette
Qual è la frequenza di ricombinazione tra l’emofilia e la cecità ai
colori se i geni che controllano tali caratteri distano 10 cM sul
cromosoma X?
10%: dopo la meiosi i due caratteri si troveranno su cromosomi
diversi nel 10% dei casi, mentre nel 90% dei casi si troveranno
insieme sullo stesso cromosoma
Distanza fisica = (2 x 106 bp/cM) x 10 cM = 2 x 107 bp
Ricombinante
La distanza tra il gene che causa la malattia e il marcatore RFLP è 14 cM: 1 R, 6NR -> 1/7
Alberi genealogici di due famiglie
con neurofibromatosi 1 (NF1)
malattia autosomica dominante
Fase ignota
Fase nota
Della madre affetta
non si conosce se D è
sullo stesso
cromosoma di 1 o 2
Linkage sul cromosoma X
Con quale probabilità sarà affetto ?
?
Il gene per l’emofilia (recessivo X-linked) ha gli alleli H, h
Il gene MARCATORE ha gli alleli A,a
Tra il gene dell’emofilia e il gene marcatore vi è una
distanza genetica di 3 cM
Analisi del linkage
due loci sono concatenati ad una frazione di ricombinazione=q
Likelihood ratio = ------------------------------------------------------------------------------------------due loci NON sono concatenati (frazione di ricombinazione=0.5)
(simile ad una probabilità)
LOD score – Logaritmo10 della ODDS (= likelihood) ratio
LOD score > 3.0 evidenza di linkage:
1.000 volte più probabile che due loci
siano concatenati piuttosto che non
concatenati.
LOD score < - 2.0 evidenza di NON
linkage con una probabilità di 100
contro 1.
Analisi del linkage tra NF1 e
un gene marcatore mediante
il Lod score
q
= percentuale di ricombinazione
Likelihood = ½ (1 - q )3 + ½ q3
ODDS
= Likelihood / (1/2) 3
LOD score = Log (ODDS)
Curve di lod scores
In ordinata il lod score, in ascissa la frequenza di
ricombinazione (da un’analisi di linkage ipotetica)
Curva 1: evidenza di linkage (Z>3) con nessun
caso ricombinante
Curva 2: evidenza di linkage (Z>3) con una
frazione di ricombinanti stimata di 0.23
Curva 3: linkage escluso (Z<-2) per frazioni di
ricombinazione minori di 0.12, linkage
indecidibile per valori maggiori
Curva 4: linkage indecidibile per tutti i valori
della frazione di ricombinazione
La funzione di mappa di Haldane
La determinazione
dell’ordine dei loci
nell’analisi di più di
due loci
Analisi di linkage a molti punti
Uso dei dati di linkage nella
diagnosi di NF1 sul cromosoma 17
L’uso della mappa genetica del cromosoma 17 per una diagnosi della NF1.
Senza conoscere la posizione del gene NF1 rispetto agli altri marcatori non
sarebbe possibile la diagnosi del feto maschio che in questo caso è
affetto
Genotipizzazione ad alta densità e linkage disequilibrium
(LD) nel genoma umano
(da Current Opinion in Chemical Biology 6,1( February) 2002, 24-30)
X
X
X
Il LD misura l’associazione tra alleli nei
cromosomi degli individui di una popolazione.
Diminuisce dal momento in cui è avvenuta la
mutazione, tanto più quanto maggiore è la
ricombinazione.
Non sono necessari nuclei famigliari
Il linkage disequilbrium (LD, in italiano
“associazione gametica preferenziale”)
cambia nel tempo.
(a) La croce rossa indica la posizione
nella quale nel DNA di un cromosoma è
avvenuta una nuova mutazione X. Si
crea perciò un altro allele
(polimorfismo) strettamente associato
(in completo LD) agli altri alleli
marcatori 1–6 sullo stesso cromosoma.
(b,c) Col passare delle generazioni
l’estensione della regione di
associazione (LD) diminuisce a causa
della ricombinazione. La
ricombinazione rimescola gli alleli
marcatori che tendono a diminuire la
loro associazione con l’allele mutato X.
(d) Il LD tra la mutazione (X) e i
marcatori vicini si osserva solo in una
regione ristretta attorno alla mutazione.
Mappa ad alta risoluzione di un
gene-malattia
Parametri citogenetici, fisici
e genetici nel Genoma
Umano
Riferimento
Citogenetico
Dimensioni
fisiche
Genoma aploide
(23 cromosomi)
3x109 np
Un cromosoma
(in media)
Una banda
cromosomica
Distanza
genetica
4300 cM 30.000  60.000
1,5x108 np ~ 200 cM
35x106 np
Numero di geni
~ 5 cM
~ 2200
~ 50
Metodi usati nella mappatura
fisica del gene
Metodo
Scopo
Risoluzione
(in np)
Ibrido cellulare uomotopo
Assegnazione del
cromosoma
FISH
Localizzazione entro una
banda cromosomica
Mappatura mediante
enzimi di restrizione
Mappatura fine di una
regione del gene
105  106
Clonaggio in cromosomi
artificiali (YAC)
Clonaggio del gene
(frammenti lunghi)
105  106
Clonaggio in batteri
(BAC)
Clonaggio del gene
(frammenti medi e corti)
103  105
PCR
Clonaggio del gene
(frammenti corti)
102  104
Sequenziamento del
DNA
Identificazione del
nucleotide
1
50  250x106
5  20x106