1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri
Preparare il Buffer di lisi aggiungendo NaCl e Tris pH 8.0 alla
soluzione fornita seguendo la tabella per le concentrazioni (Volume
finale 1,5 ml)
Concentrazione Iniziale
Concentrazione Finale
NaCl
5M
150mM
Tris pH 8.0
1M
50mM
Aggiungere freschi al Buffer di lisi il Cocktail di Inibitori delle Proteasi (250X)
Risospendere il pellet batterico fornito con 1,5 ml di Buffer di lisi
Aggiungere al pellet risospeso il Lisozima (250X)
Incubare in ghiaccio per 20 minuti
Congelare il lisato batterico
Lisato batterico
X
GST proteina
Y
ZJ
2° ESERCITAZIONE: preparazione della
proteina di fusione
Protocollo 1
Resina GST proteina
Scongelare il lisato batterico
Prelevare 1 ml di lisato e aggiungerlo alla resina fornita
Incubare 20 minuti in ghiaccio
Centrifugare 4 minuti a 2500 rpm
Eliminare il supernatante
Effettuare 3 lavaggi con 1 ml di PBS1X, centrifugando 4 minuti a 2500 rpm
Risospendere la resina in 300 μl di PBS1X
Protocollo 2: calcolo della concentrazione della proteina di fusione
Prelevare 1 μl di proteina di fusione e diluirlo in 1 ml di soluzione di
Bradford
Leggere allo spettrofotometro
Calcolare la concentrazione della proteina
3° ESERCITAZIONE: controllo della
proteina di fusione su gel
Protocollo
Prelevare 2 μg di proteina
Risospendere in Buffer di caricamento (3X)
Caricare su gel di poliacrilammide
Gruppi
KDa
170
130
95
72
PTP
55
43
34
GST
26
M
1
4
6
5
9
13
19 12
22
23
3
8
17
M 15 20 18 16
2
14 10 21 11