CONSULTAZIONE RAPIDA
GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit –
PCR Setup – Swab Substrate
Pub. No. 4481757 Rev. A Translated from English Publication Number 4477601 Rev. A
Nota: per le linee guida sulla sicurezza e il rischio biologico, fare riferimento alla sezione “Sicurezza” in GlobalFiler™ Express PCR
Amplification Kit User Guide (Pub. no. 4477672). Per ogni prodotto chimico, leggere le Schede con i dati di sicurezza (SDS) e seguire le
istruzioni relative alla manipolazione. Indossare occhiali, indumenti e guanti di protezione adeguati.
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Descrizione del prodotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Prerequisiti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Linee guida sulla preparazione del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Preparare il lisato del campione (protocollo per la temperatura ambiente) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Preparare il lisato del campione (protocollo per il calore) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
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Preparazione delle reazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
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Conservare il lisato del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
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Esecuzione di PCR ed elettroforesi capillare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
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Garanzia limitata del prodotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Descrizione del prodotto
Il GlobalFiler™ Express Kit (200 reazioni Part no. 4476609 o 1000 reazioni Part no. 4474665) è un saggio multiplex STR (basato sull’uso
di brevi sequenze ripetute in serie) che amplifica 21 loci STR autosomici, Amelogenina, 1 locus Y STR e 1 locus Y di inserimento/
cancellazione (Y indel). È ottimizzato per consentire l’amplificazione diretta dei seguenti tipi di campioni di origine singola:
• campioni ematici o buccali raccolti da substrati di carta trattata (descritto in Consultazione rapida Pub. no. 4481766);
• campioni ematici o buccali raccolti da substrati di carta non trattata e trattati con Prep-n-Go™ Buffer (descritto in Consultazione
rapida Pub. no. 4481775);
• campioni buccali raccolti su substrati di tampone e trattati con Prep-n-Go™ Buffer (descritto in questa Consultazione rapida).
Prerequisiti
Prima di cominciare, sistemare questa guida nell’area del laboratorio in cui vengono eseguite le procedure di PCR.
Linee guida sulla preparazione del campione
• Staccare ogni testa del tampone buccale dallo stelo del tampone prima della lisi.
• In caso di utilizzo di un protocollo per lisi a caldo, effettuare la lisi in uno dei seguenti formati:
– provette da 1,5 ml con un blocco di riscaldamento (blocco b di riscaldamento a secco VWR® Scientific Select o simile);
– 96-Well Deep-Well Plate (Part no. 4392904) con un forno e un adattatore per piastra in metallo (incubatore per ibridazione
Robbins Scientific® modello 400 o simile, rack da banco Agilent® per provette da 200 µl/piastre inferiori V (in metallo)
Cod. art. 410094 o simile).
IMPORTANTE! Non utilizzare un adattatore per piastra in plastica.
• Per prestazioni ottimali, si consiglia la lisi di un tampone intero. Per preservare il campione, valutare la lisi di mezzo campione.
Preparare il lisato del campione (protocollo per la temperatura ambiente)
1. Aggiungere un Prep-n-Go™ Buffer da 400 µl (Part. no. 4471406) a provette da 1,5 ml o i pozzetti appropriati di una 96-Well
Deep-Well Plate (Part no. 4392904).
2. In ogni provetta o pozzetto, collocare la testa intera di ogni tampone e lasciar riposare per 20 minuti
a temperatura ambiente (da 20 a 25 °C) per lisare il campione.
3. Dopo 20 minuti, trasferire il lisato del campione dalla piastra per campioni alle provette o alle piastre per conservazione, quindi
smaltire la piastra per pozzetti profonda che contiene le teste del tampone.
Nota: per ridurre il rischio di contaminazione, non rimuovere le teste del tampone dalla piastra per lisato prima di trasferirlo.
4. Passare alla sezione “Preparazione delle reazioni” a pagina 2 o vedere “Conservare il lisato del campione” a pagina 3.
Preparare il lisato del campione (protocollo per il calore)
Questo protocollo può migliorare le prestazioni per i campioni difficili o vecchi.
1. Preriscaldare il blocco di riscaldamento a 90 °C o il forno con l’adattatore per piastra in metallo a 99 °C.
2. Aggiungere un Prep-n-Go™ Buffer da 400 µl (per tamponi buccali, Part. no. 4471406) a provette da 1,5 ml o i pozzetti appropriati
di una 96-Well Deep-Well Plate (Part no. 43929040).
3. In ogni provetta o pozzetto, collocare l’intera testa di ogni tampone. In caso di utilizzo di provette, tapparle. Lasciar riposare
ogni provetta o piastra per 20 minuti nel blocco di riscaldamento preriscaldato o nel forno per lisare il campione.
4. Dopo 20 minuti, rimuovere le provette o la piastra con pozzetto profondo dal blocco di riscaldamento o dal forno.
5. Lasciar riposare il lisato a temperatura ambiente per almeno 15 minuti per far raffreddare il lisato (per un pipettaggio accurato).
6. Trasferire il lisato del campione dalle provette da 1,5 ml o dalla piastra per campioni nelle provette o nelle piastre per
conservazione, quindi smaltire le provette da 1,5 ml o la piastra con pozzetto profondo contenente le teste del tampone.
Nota: per ridurre il rischio di contaminazione, non rimuovere le teste del tampone dalla piastra per lisato prima di trasferirlo.
7. Passare alla sezione seguente per preparare le reazioni o vedere “Conservare il lisato del campione” a pagina 3.
Preparazione delle reazioni
1. Aggiungere Prep-n-Go™ Buffer (Part no. 4471406) ai pozzetti di controllo nella piastra di reazione:
A questi pozzetti di un MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate...
Aggiungere:
Controllo negativo
3 µl di Prep-n-Go™ Buffer
Controllo positivo
• Per 25 e 26 cicli
0 µl di Prep-n-Go™ Buffer
• Per 27 cicli
1 µl di Prep-n-Go™ Buffer
• Per 28 cicli
2 µl di Prep-n-Go™ Buffer
2. Calcolare il volume di ciascun componente necessario per preparare le reazioni, utilizzando la tabella seguente.
Componente della
reazione
Volume per reazione
Master Mix
6,0 µl
Primer Set
6,0 µl
Nota: nei calcoli includere le reazioni aggiuntive allo scopo di fornire il volume in eccesso per le perdite che si verificano durante
il trasferimento dei reagenti.
IMPORTANTE! Questo kit è stato ottimizzato per un volume di reazione PCR da 15-µl per superare l’inibizione della PCR
prevista in caso di amplificazione di campioni non depurati. L’utilizzo di un volume di reazione PCR inferiore può ridurre la
possibilità della chimica del kit di generare profili STR completi.
3. Preparare i reagenti. Scongelare il Master Mix e il Primer Set, quindi agitare su vortex 3 secondi e centrifugare brevemente prima
di aprire le provette o i flaconi.
IMPORTANTE! Lo scongelamento è necessario solo durante il primo utilizzo del kit. Dopo il primo utilizzo, i reagenti vengono
conservati a da 2 a 8 °C e, pertanto, non richiedono ulteriore scongelamento. Non ricongelare i reagenti.
4. Pipettare i volumi necessari dei componenti in una provetta di polipropilene di dimensioni adeguate.
5. Agitare la miscela di reazione su vortex per 3 secondi, quindi centrifugare brevemente.
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GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit – PCR Setup Swab Substrate Consultazione rapida
6. Dispensare 12 µl della miscela di reazione in ogni pozzetto di reazione di un MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate. Il
volume finale in ogni pozzetto è di 15 µl (miscela di reazione più Prep-n-Go™ Buffer e lisato del campione o controllo positivo).
7. Aggiungere i campioni alla piastra di reazione:
A questi pozzetti di un MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate...
Aggiungere:
Campioni
3 µl di lisato del campione
Controllo positivo
• Per 25 e 26 cicli
3 µl di Control DNA 007
• Per 27 cicli
2 µl di Control DNA 007
• Per 28 cicli
1 µl di Control DNA 007
Nota: i volumi del controllo positivo sono quantità suggerite e possono essere regolati se le altezze di picco sono eccessivamente alte o
basse per il numero del ciclo ottimizzato.
8. Sigillare la piastra con MicroAmp® Clear Adhesive Film (Part no. 4306311) oppure con MicroAmp® Optical Adhesive Film
(Part no. 4311971).
IMPORTANTE! Raccomandiamo una pellicola adesiva per la sigillatura della piastra per fornire una tenuta uniforme per tutti i
pozzetti e impedire l’evaporazione. Non utilizzare tappi, che potrebbero non fornire una tenuta uniforme per tutti i pozzetti.
IMPORTANTE! Se si utilizza il termociclatore 9700 con il blocco per piastre in argento o in argento dorato, posizionare un
MicroAmp® Compression Pad (Part no. 4312639) sulla parte superiore della piastra per impedire ulteriormente l’evaporazione
durante l’amplificazione termica. Il Veriti® Thermal Cycler non necessita di un Compression Pad.
9. Centrifugare la piastra a 3000 giri/min per circa 20 secondi in una centrifuga da tavolo con Plate Holder.
Conservare il lisato del campione
Tappare le provette di conservazione del lisato del campione o sigillare la piastra di conservazione del lisato del campione con
MicroAmp® Clear Adhesive Film.
Conservare il lisato del campione secondo necessità:
Durata di conservazione del lisato del
campione
Temperatura
<2 settimane
Da 2 a 8 °C
>2 settimane
Da –15 a –25 °C
Queste raccomandazioni sulla conservazione sono preliminari in attesa dei risultati degli studi di stabilità in corso. Non sono stati
valutati appieno gli effetti di più cicli di congelamento-scongelamento sul lisato. Pertanto, si sconsigliano più cicli di congelamentoscongelamento.
Esecuzione di PCR ed elettroforesi capillare
Per eseguire l’amplificazione PCR e l’elettroforesi capillare (CE), vedere GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit-PCR Amplification
and CE Quick Reference Card (Pub. no. 4481784) e il GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit User Guide (Pub. no. 4477672).
Garanzia limitata del prodotto
Life Technologies Corporation e/o le sue affiliate garantiscono i loro prodotti come descritti nei Termini generali e condizioni di
vendita di Life Technologies reperibili sul sito Web di Life Technologies www.lifetechnologies.com/termsandconditions. In caso di
domande, contattare Life Technologies su www.lifetechnologies.com/support.
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October 2012