ESERCITAZIONI 2008
APPLICAZIONI DI GENETICA
UMANA E MOLECOLARE
• Quantizzazione delle proteine
• Applicazioni delle proteine di fusione
Quantizzazione delle proteine tramite
reattivo di Bradford
OCH 2CH 3
Coomassie Brilliant Blu R
HN
N
SO3Na
N+
SO3Na
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante
da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)
Quantizzazione delle proteine tramite
reattivo di Bradford
• Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le
proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici
e carbossilici e tramite forze di van der Waals
• Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico
• Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico
passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina
l’assorbanza a 595 nm
• La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità
di proteina presente in soluzione, pertanto l’intensità del colore
blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione
proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano
la stessa quantità di colorante → il saggio è indipendente dal
tipo di proteina
•
Quantizzazione delle proteine tramite
reattivo di Bradford
VANTAGGI
• Semplicità di preparazione del reattivo
• Sviluppo del colore immediato
• Stabilità del complesso
• Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)
• Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,degli
agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti
come sodio azide
SVANTAGGI
• Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere
• La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal
contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di uno
standard
• Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida
APPLICAZIONI DELLE
PROTEINE DI FUSIONE
• Saggi di Pull-Down
• Doppio Ibrido
• Saggi di legame
Pull-Down
• Tecnica per verificare interazioni proteina-proteina
“sospette”
ESCA
Proteina di fusione
PREDA
Proteina d’interesse
(eucariotica)
Pull-Down
• Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina)
• Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina
Glutatione)
• Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della
purificazione
• Preparare gli estratti cellulari eucariotici che
contengono la proteina d’interesse
Pull-Down
CONTROLLO
ESPERIMENTO
Resina GST Esca
X
Preda
Y
Z
Resina GST
X
J
Preda
Y
Z
J
Estratto cellulare
Estratto cellulare
lavaggi
lavaggi
X
X
Resina GST Esca Preda
Resina GST
Z
Preda
Z
Pull-Down
Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
TRASFERIMENTO
SDS-PAGE
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT
BLOCKING
ANTICORPO
PRIMARIO
SVILUPPO
ANTICORPO
SECONDARIO
Pull-Down
Verifica dell’interazione tramite SDS-Page Western Blot
MK INPUT CO ESP
La nostra proteina
d’interesse è stata legata
dalla proteina di fusione!
Il controllo è pulito
Pull-Down
LIMITI DEL SAGGIO:
• Necessità di controlli negativi, presenza di legami
aspecifici alla resina.
• Interazioni deboli o transienti potrebbero non essere
rilevate.
• La presenza del tag potrebbe interferire con il
legame.
• E’ un sistema forzato che potrebbe non rispecchiare
l’effettiva situazione biologica.
Sistema del Doppio Ibrido
Con questa tecnica è possibile individuare interazioni proteinaproteina.
Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere
organizzati funzionalmente in domini distinti
1)Il dominio legante il DNA (DBD)
2)Il dominio di transattivazione (AD)
Sistema del Doppio Ibrido
I domini proteici sono normalmente identificati a
classificati in base alle loro caratteristiche
strutturali, funzionali e legate all’evoluzione.
Un dominio può quindi essere descritto come un’unità
strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata
durante l’evoluzione e in grado di funzionare
indipendentemente dal contesto a cui appartiene la
proteina.
Sistema del Doppio Ibrido
Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una
proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo
che riaquistino la loro funzionalità “rincontrandosi”.
AD
AD
DB
DB
AD
AD
DB
DB
Sistema del Doppio Ibrido
Tra i fattori di trascrizione più utilizzati c’è GAL4, che legando il
promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi.
Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in
grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si
colorano di blu.
Gal4
β-galattosidasi
UAS
Lacz
X-Gal
Sistema del Doppio Ibrido
Creazione di due ibridi:
• DBD Hybrid: costituito dal dominio DBD fuso alla proteina
d’interesse (Esca). Questa proteina di fusione può legare il DNA,
ma non è in grado di attivare la trascrizione.
• AD Hybrid: costituito dal dominio AD fuso ad un’altra proteina
(Preda). Normalmente viene utilizzata una libreria di DNA.
Sistema del Doppio Ibrido
Peptide Microarray
Peptide Microarray
High signal
intensity
Positive data set
Low signal
intensity
Negative data set