 Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea
(pura), cioè far sì che la proteina di interesse sia l’unica
presente nel campione a disposizione
 La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio
essenziale nell’analisi delle sue proprietà fisiche e biologiche ed
è una delle procedure più comuni della biochimica pratica
 La scelta di una fonte opportuna costituisce un requisito
fondamentale per la messa a punto di un procedimento di
purificazione efficiente
 Nei campioni biologici, quali cellule e tessuti, le proteine sono
sempre presenti in miscele complesse, le quali possono
contenere migliaia di proteine diverse
 Risulta dunque critica la scelta del campione biologico di
partenza
 E’ ovvio che maggiore sarà la concentrazione della proteina
di interesse nella fonte scelta e più semplice sarà la messa a
punto del procedimento di purificazione
 Piccole quantità di contaminanti possono essere tollerate, a
seconda delle indagini che si desidera effettuare sulla proteina
di interesse
 Gradi di purezza del 95% - 98% sono sufficienti per la maggior
parte delle analisi sperimentali
 Alcuni tipi di analisi, quali la determinazione della struttura
mediante cristallografia, richiedono campioni proteici
particolarmente puri
INVESTIGATORI DELLA CIA
BIOCHIMICI
OBIETTIVO: catturare un terrorista
OBIETTIVO: purificare una proteina
I FASE: INDAGINI
I FASE: RICERCA BIBLIOGRAFICA
DOMANDE:
1. Quali informazioni abbiamo?
2. Come si chiama e che aspetto ha?
3. Di cosa si occupa?
4. Quali ambienti frequenta?
5. Ha guardie del corpo?
6. Ha sosia?
DOMANDE:
1. Quali informazioni abbiamo?
2. Quali sono le caratteristiche della proteina?
3. Quali funzioni svolge nella cellula?
4. Dove è presente in elevate quantità?
5. Quali difficoltà ci aspettiamo di incontrare?
II FASE: preparazione del piano di cattura
II FASE: scelta della procedura
DOMANDE:
1. Lo vogliamo vivo o morto?
2. Analisi del territorio
3. Quanti uomini sono necessari?
DOMANDE:
1. Qualità o quantità?
2. Identificazione della fonte
3. Scelta dei passaggi
FASE OPERATIVA
FASE OPERATIVA
•
•
•
•
•
•
Circondare la zona e costringerlo ad uscire
Isolamento dal gruppo (escludere i sosia)
Arresto ed interrogatorio
Preparazione del campione di partenza
Isolamento e purificazione
Caratterizzazione
Ogni passaggio della procedura di purificazione determina la separazione delle
proteine totali presenti nel campione in una serie di frazioni (frazionamento).
Per ciascuna frazione è determinata la quantità di proteine totali e le unità di
attività enzimatica della proteina di interesse.
Una unità enzimatica (U) è definita come la quantità di enzima richiesta per convertire
1 µmol di substrato in prodotto in 1 min in condizioni definite (generalmente 25 o
30 °C, ad un valore di pH ottimale).
mg o U di proteina di interesse nella frazione
RESA
mg o U di proteina di interesse nella preparazione originale
Il grado di purezza di un enzima in una particolare frazione è espresso tramite
l’attività specifica, la quale pone in relazione l’attività enzimatica totale con il
contenuto totale di proteine presenti nella preparazione.
ATTIVITA’
SPECIFICA
U di enzima di interesse nella frazione
mg di proteine totali nella frazione
Nel corso di una purificazione ottimale
la resa diminuisce e
l’attività specifica aumenta
proteine Enzima
totali
(mg)
(mg)
Resa
%
Purezza
(%)
U totali
As
(U/mg)
Omogenato
1000
100
100%
10%
10000
10
1° stadio di
purificazione
100
50
50%
50%
5000
50
2° stadio di
purificazione
27
25
25%
92%
2500
92
3° stadio di
purificazione
20
19.8
19.8%
99%
1980
99
Saggio
colorimetrico
Stima da
SDS-PAGE
Saggio di
attività
enzimatica
Valore ipotetico
proteina pura =
100 U/mg
La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina
richiede la possibilità di:
1. Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine
del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla
base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO
ENZIMATICO)
2. Misurare la quantità di proteine totali nel campione
3. Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse
Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra
tutte le altre proteine del campione di partenza
 E’ necessario disporre di un opportuno saggio che consenta di
seguire la proteina durante i vari passaggi del procedimento
di purificazione
 E’ importante che il saggio disponibile sia eseguibile
rapidamente su molti campioni
 Il saggio deve indicare in maniera affidabile la quantità della
proteina desiderata presente ai vari stadi di purificazione
 Inoltre il saggio deve essere eseguibile con una piccola quantità
di campione proteico
Specifico
Quantitativo
Gruppo di enzimi che
catalizzano l’idrolisi
di monoesteri del fosfato
FOSFATASI
R-O-PO32- + H2O
R-O-H + HO-PO32-
NO2
NO2
FOSFATASI
O -PO32- + H2O
O-H + HO-PO32-
p-nitrofenil-fosfato
p-nitrofenolo
INCOLORE
GIALLO
Le reazioni che richiedono nucleotidi piridinici sono molto
usate nei metodi enzimatici di analisi.
Tali coenzimi (NAD, NADH, NADP, NADPH) sono ideali
perché sono usati stechiometricamente in un gran numero
di reazioni di ossido-riduzione.
Composto ridotto + NAD+
NAD+
(non assorbe a 340 nm)
Composto ossidato + NADH
NADH
(assorbe a 340 nm)
Saggio enzimatico non specifico, dal momento che evidenzia
tutti gli enzimi che usano come coenzima il NAD+.
proteine Enzima
totali
(mg)
(mg)
Omogenato
1000
100
Resa
%
Purezza
(%)
U totali
As
(U/mg)
100%
10%
10000
10
1° stadio
purificazione
5000
2° stadio
purificazione
2500
3° stadio
purificazione
1980
Saggio
colorimetrico
Stima da
SDS-PAGE
Valore ipotetico
Saggio di
proteina pura = 100
attività
U/mg
enzimatica
Cuvetta contenente il
campione di proteina
a concentrazione C
l
I1
I0
Rivelatore
Sorgente
I0
Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’onda λ attraverso un
percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa proporzione della
luce è assorbita dalla soluzione.
Se l’energia della luce incidente è I0 e l’energia della luce trasmessa (dopo essere
passata attraverso la soluzione) è I1, allora la frazione di luce trasmessa è I1/I0,
nota come trasmittanza T.
Se T = 100%, la sostanza è trasparente.
Se T = 0%, la sostanza è opaca ed assorbe completamente la luce.
L’assorbanza di una soluzione è direttamente proporzionale alla concentrazione del
materiale assorbente quando il percorso della luce è mantenuto costante.
A = log10(I0/I1) = εcl
coefficiente di
estinzione
L’assorbanza è adimensionale.
Quando la concentrazione è espressa in molarità (M) ed il percorso della luce in centimetri
(cm), ε è noto come coefficiente di estinzione molare (M-1cm-1) di un dato composto.
ε0.1%280nm è l’assorbanza a 280 nm di una soluzione allo 0.1% (1 mg/ml) della sostanza in
esame (ad es. una proteina) in una cuvetta lunga 1 cm.
 La concentrazione delle proteine può essere stimata misurando l’assorbanza
delle soluzioni contenenti le proteine a 280 nm (UV)
 Il metodo è adoperato comunemente perché non distrugge il campione ed è
molto rapido
 La maggior parte delle proteine ha un massimo di assorbimento a 280 nm per
la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e
fenilalanina (F)
 Poiché la composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente,
l’assorbimento molare varierà anch’esso di molto, a seconda del contenuto
di questi amminoacidi
Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280
nm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di
assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm.
Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto
l’assorbimento molare.
O
O
H2N
CH
C
CH 2
OH
H2N
CH
C
CH 2
O
OH
H2N
CH
C
CH 2
HN
OH
Trp (Triptofano)
Tyr (Tirosina)
Phe (Fenilalanina)
OH
Determinazione della concentrazione proteica
mediante spettrofotometria
Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina
Assorbimento
Picco di assorbimento di
Tirosine,
Triptofani e
Fenilalanine
220
240
260
280
300
320
340
360
Lunghezza d’onda “λ” (nm)
UV = 200 nm – 350 nm
380
400
Necessità di utilizzare cuvette di quarzo
A meno che la proteina non sia libera da altri composti che assorbono luce a
280 nm, i risultati saranno poco accurati
Gli acidi nucleici sono particolarmente fastidiosi perché gli anelli purinici e
pirimidinici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 nm, con un
assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nm
Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione
della proteina può essere stimata adoperando una formula che
corregge ragionevolmente bene per il contenuto in acidi nucleici:
[proteina] (mg/ml) = 1,55 A280 – 0,76 A260
 Non è distruttivo
 Consente misure in continuo, ad esempio su un eluente di una colonna
cromatografica
 Il limite di sensibilità può essere aumentato in maniera significativa
misurando i massimi di assorbimento a lunghezza d’onda comprese tra
190 e 220 nm
Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame
alcalino contenente potassio tartrato di sodio
In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso
di coordinazione con quattro gruppi –NH presenti in altrettanti
legami peptidici
Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a
550 nm
R
N
N
O
2+
CU+2
Cu
O
N
N
R
Essendo basato sull’interazione degli ioni rameici con i legami peptidici, il metodo
è universabile e molto riproducibile
Scarsa sensibilità: il metodo non si dimostra infatti adatto alla determinazione
di concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml
Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici
ottenuti per precipitazione con ammonio solfato perché questi campioni
contengono alte concentrazioni di ammonio
Consiste nella reazione del biureto, seguita dalla riduzione in condizioni alcaline
del reagente di Folin-Ciocalteu (acidi misti di fosfomolibdotungstato)
Gli ioni di rame facilitano il processo di riduzione
I gruppi cromogeni principali sono i legami peptidici complessati con rame
(biureto) ed i molibdotungstati ridotti blu, che sono ridotti in gran parte da
tirosina, triptofano ed amminoacidi polari
Il prodotto della reazione, eteropolimolibdeno, ha una forte colorazione blu,
con un massimo di assorbimento a circa 750 nm
Poco costoso
Di facile esecuzione
Altamente riproducibile
Molto sensibile: è possibile determinare concentrazioni fino a 10 µg/ml
E’ soggetto ad interferenze da parte di una varietà di sostanze, quali Tris,
HEPES ed EDTA
Le curve standard sono lineari solo a basse concentrazioni proteiche
Sono necessari tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibili
La reazione dipende dal pH ed è necessario avere un pH compreso tra 10
e 10.5
Recentemente sono stati introdotti un certo numero
di reagenti alternativi per la determinazione
degli ioni rameici, i quali consentono di effettuare
un saggio più conveniente e riproducibile …
La reazione del BCA (acido bicinconinico) è simile a quella del reattivo
di Lowry
Cu+2 è ridotto a Cu+1 dalle molecole proteiche in soluzione alcalina
Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu+1)
Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con
un massimo di assorbimento a 562 nm
Proteina + Cu+2
-
Cu+1 +
OOC
OH-
Cu+1
N
N
COO-
N
COO -
Cu+1
2BCA
-
OOC
N
Sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 µg/ml)
Ridotta suscettibilità alla presenza di detergenti
Dopo un’incubazione di 30 minuti a 37°C il colore è sufficientemente stabile
per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti)
Il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo
Interferenza da parte di carboidrati
Ecco un elenco di una parte delle sostanze che interferiscono con
il metodo BCA: catecolamine, triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina,
tirosina, saccarosio, glicerolo non puro, H2O2, acido urico e ferro.
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine
determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante
da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)
Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine
tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e
tramite forze di van der Waals
Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico
Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio
in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l’assorbanza a
595 nm
OCH 2CH 3
Coomassie Brilliant Blu R
HN
N
SO3Na
N+
SO3Na
La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina
presente in soluzione.
Pertanto l’intensità del colore blu (e dunque l’assorbimento) è proporzionale
alla concentrazione proteica.
In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di
colorante → il saggio è indipendente dal tipo di proteina
Poiché l’intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di
concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una
curva standard per ogni saggio.
1 mg/ml
2 mg/ml
4 mg/ml
X mg/ml
8 mg/ml
16 mg/ml
1 2
4
8
mg di proteina
16
Intensità del colore blu
Assorbanza a 595 nm
 Semplicità di preparazione del reattivo
 Sviluppo del colore immediato
 Stabilità del complesso
 Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml)
 Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,
degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei
preservanti come sodio azide
 Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere
 La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal
contenuto in aminoacidi basici → ciò rende difficile la scelta di
uno standard
 Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida