Replicazione
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Replicazione
Ciclo cellulare
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Replicazione
Arthur Kornberg, 1970
Replicazione
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Replicazione
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Replicazione
Giunzione
innesco (primer)
Stampo
è fondamentale
per la sintesi
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Replicazione
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L’attivita’ delle DNA polimerasi
5'
3'
5'
1) Selettività
Per 4
deossinucleoti
“1000 volte”
2) Verifica
dell’appaiamento
ottimale
3) In caso di
appaiamento
errato
riduzione
velocità di
incorporazione
10000 volte
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L’attivita’ delle DNA polimerasi
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Replicazione
1) Aggiunta
occasionale di
una forma
tautomerica
2) Attività
esonucleasica
3) Al 3’
4) In media
possiede una
accuratezza
1 nucleotide
non corretto
ogni
10.000000
sintetizzati
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Le tre DNA Polimerasi di E.coli
1)
2)
3)
4)
5)
Pol I
Pol II
Pol III
Pol IV
Pol V
rimozione innesco riparo
riparo
Replicazione piccolo Chr altamente processiva
Riparo
Riparo
DNA Polimerasi I
DNA Polimerasi II
DNA Polimerasi III
Struttura
Dalton
Composizione
Numero/cellula
109,000
monomero
400
120,000
monomero
?
>250,000
eteromultimero
10-20
Attività enzimatiche
Allungamento 5'-3'
Esonucleasi 3'-5'
Esonucleasi 5'-3'
si
si
si
si
si
no
si
si
no
polA
riparazione difet.
vitalità ridotta
solo quando difetta
5'-3' esonucleasi
polB
riparazione difet.
senza effetto
pplC, dnaN, dnaZX, dnaQ, dbaT
previene replicazione
letale condizionale
Mutanti
Loci mutanti
Fenotipi dei mut.
Letalità
Eucarioti e procarioti
1) Più di 15
DNA polimerasi
2) Più subunità
3) Alfa 4 subunità
2 con polimemasi
2 con primasi
Poco processiva
Perciò rimpiazzata
Da delta ed epsilon
“Switching”
Pol epsilon
Filamento guida
Pol delta
Filamento discontinuo
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1) DNA elicasi hanno diversa processività
2) Diversa polarità 5’-3’ o viceversa
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1) A valle (+)
superavvolg
imenti
Indotti
dalla pol
2) Topo II
Riduce il
numero di
legame
topologico
Ogni 20 bp(-2)
Separazione di 10
nucleotidi
provoca un
aumento di 1
di
superavvolgim
enti (+)
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Proteina
Funzione
DNA polimerasi a
Innesco
DNA polimerasi d
Sintesi del DNA
PCNA
Processività
Fattore di replicazione C
Allungamento
Fattore di replicazione A
Proteina SSB
Topoisomerasi I e II
Separazione dei filamenti
MF1 (FEN I)
Rimozione dell’RNA
DNA ligasi
Saldatura delle incisioni
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1) 0loenzima
2) Pol III
3) 3 copie
4) 2 Pol III
core
Complesso
gamma
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1) Caricatore
Della pinza
scorrevole
Sliding clamp
loader
Aiuta ad aprire
l’anello del
caricatore
per
avvolgere il
DNA e
posizionarlo
utilizzando ATP
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Fedeltà della replicazione
• Controllo presintetico
• Correzione di bozze
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Meccanismo di appaiamento delle 2 DNA
polimerasi
e simultanea sintesi del DNA sui 2 filamenti
stampo
Perché si impone la necessità di avere la
sintesi simultanea dei 2 filamenti?
Modello a trombone
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Origine di Replicazione
Sequenze ricche di AT
si denaturano facilmente
Replicatore
Sequenze che dirigono
l’inizio della replicazione
Modello del replicone
Iniziatore
Proteine che attivano
l’inizio della replicazione
Legando specifiche
sequenze
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Origine di Replicazione
Sito dove il DNA viene separato
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Origine di Replicazione
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Origine di Replicazione
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Replicatori
ed iniziatori
Poco
conosciuti
negli
Eucarioti
multicellulari
1) Iniziatore
2) Legano
specifiche
sequenze
3) Interagisco
no con altri
fattori
4) Possono
piegare la
regione del
DNA
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Origine di Replicazione
1) DNA A
2) DNA B=DNA
elicasi
3)
DNAC=proteina
che carica la
elicasi
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Seq A lega il
DNA
emimetilato
ed impedisce
il legame di
DNA-A
“Iniziatore”
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Origine di Replicazione
Eucarioti
1) Origine di replicazione multiple
2) Mediamente sono separate ogni 30
kb (Chr 22 ha circa 10 origini)
3) Migliaia in quelli più grandi
4) Ciascuna origine deve essere
replicata una sola volta
5) (deve essere inattivata fino al
prossimo ciclo di divisione cellulare)
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Complesso pre-replicativo
1) Selezione del
replicatore in
G1
2) Attivazione
dell’origine in
fase S
3) Formazione
dei complessi
pre-replicativi
4) Le molecole di
DNA ancora
non
denaturate
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1) In G1 si forma il complesso di
pre-RC
1) Iniziatore ORC
riconosce il
replicatore
2) ORC recluta due
caricatori delle
elicasi (CDC6,
CDT1)
3) Complesso Elicasi
Mcm2-7
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1) In S vengono attivate le chinasi
Cdk e Ddk.
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1) Dopo la
fosforilazione
del complesso
arrivano in modo
predeterminato
2) prima le Pol
epsilon e delta
poi le primasi
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La terminazione della replicazione
Sono diverse nei
1) Cromosomi circolari
(è completa e
generalmente le molecole figlie restano legate
tra loro, “concatenameri”)
2) Lineari
( non è completa perciò strategie
diverse per superare il problema delle
terminazioni libere)
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1) La richiesta di
primer multipli
determina
l’impossibilità a
sintetizzare le
estremità
2) Anche partendo
dall’ultimo
nucleotide, la
rimozione del
primer crea un
Gap
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Telomeri
Formati da T e G
Il 3’ dell’estremità
in queste
regioni si
estende oltre il
5’ formando un
tratto a singolo
filamento
Queste regioni
reclutano la
telomerasi
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1) La telomerasi
allunga il 3’ OH
ma non necessita
di uno stampo
esogeno ma
utilizza un RNA
che funge da
stampo perciò il
DNA di nuova
sintesi è a
singolo filamento
2) RNA telomerasi
3) TER utilizza
come stampo un
RNA (TERT)
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1) La soluzione è
quella di
allungare
l’estremità
attraverso delle
proteine che
fungono da
stampo o da
primer
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Conservazione della lungezza dei telomeri
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