FONDOPERLAPROMOZIONEDIACCORDIISTITUZIONALI “PIATTAFORMADIBIOTECNOLOGIEVERDIEDITECNICHEGESTIONALIPERUN SISTEMAAGRICOLOADELEVATASOSTENIBILITÀAMBIENTALE” QUADERNO BIOCONTROLLO Febbraio2014 FONDOPERLAPROMOZIONEDIACCORDIISTITUZIONALI “PIATTAFORMADIBIOTECNOLOGIEVERDIEDITECNICHEGESTIONALIPERUN SISTEMAAGRICOLOADELEVATASOSTENIBILITÀAMBIENTALE” QUADERNO BIOCONTROLLO ͳ ʹ Presentazione Per Regione Lombardia il sostegno all’innovazione e alla ricerca, la valorizzazione del capitale umano rappresentano leve fondamentali per rendere più attrattivo il territorio, aumentare la competitività del sistemaeconomico,accademico,scientificoesocialeerilanciareunacrescitadinamica,solidaesostenibile. EccoperchéRegioneLombardiastamettendoafattorcomunepolitichequalificanti,svolgendounruolodi promotoreefacilitatorediretitrauniversitàecentridieccellenza,istituzionilocalienazionali,cameredi commercioeassociazionidiimpresaalivellolocaleeglobale.Inquestocontestosiinserisceilprogramma di Ricerca e Sviluppo “BIOGESTECA”, uno degli 11 progetti finanziati da Regione Lombardia attraverso il “bandodiinvitoapresentarepropostediaccordiistituzionaliperlarealizzazionediprogrammidiricercae sviluppo nei settori energia, ambiente, salute e manifatturiero avanzato a valere sul fondo per la promozionediaccordiistituzionali”.Unbandocheèstatolanciatonel2009,conassegnazionenel2010,di circa 27 milioni di euro, nell'ambito del Fondo per la Promozione di Accordi Istituzionali. Il programma BIOGESTECA,favorendolacostituzionediunaretecollaborativatrauniversità,centridiricerca,istituzionie imprese del sistema lombardo della ricerca ne ha rafforzato la visibilità e la competitività a livello internazionale. Ma ha anche permesso di fornire risposte alla crescente domanda globale di prodotti alimentari, una delle principali sfide che ci attendono e tema di Expo Milano 2015, che deve necessariamenteconiugarsiconunosvilupposostenibile,capaceditutelarel’ambienteeallostessotempo valorizzare l’applicazione di strumenti innovativi e tecnologici. BIOGESTECA ha il merito di offrire un contributoessenzialeallasoddisfazioneditaliesigenzeattraversounapproccioinnovativochahaportato ancheallarealizzazionediunapiattaformadibiotecnologieverdieditecnichegestionaliperlostudioela sperimentazionedidiversesoluzionicheinteragisconotradiloroconlafinalitàcondivisadellasostenibilità del sistema agricolo. I risultati prodotti dalle attività pluriannuali del progetto, che ha impegnato più di cento ricercatori e ha reclutato e formato più di quaranta dottorandi di ricerca e giovani ricercatori, ci fornisconointeressantispunticheabreveemedioterminesirivelerannoutiliperchioperainLombardia neisettoridell’agroͲalimentare,dellebioenergieedellasalvaguardiaambientale.Dicertoilnostroimpegno saràrivolto,ancheconlacollaborazionedellaCameradiCommercioIndustriaArtigianatoeAgricolturadi Lodichehacofinanziatoilprogetto,insiemeaRegioneLombardia,adareampiadivulgazioneepromozione del trasferimento tecnologico dei risultati, con iniziative specifiche che si inseriranno tra quelle previste dalla Regione stessa e dai diversi Enti partner del progetto nelle attività di avvicinamento all’importante EsposizioneUniversalediMilano2015. Mario Melazzini Assessore alle Attività produttive, Ricerca e Innovazione di Regione Lombardia ͵ Ͷ IlprogrammadiRicerca&SviluppoBIOGESTECA Lasostenibilitàecompetitivitàdelsistemaagricolonelsuoinsiemeimpegnanoilmondodellaricercaalla definizione continua di soluzioni e tecnologiche innovative. La configurazione attuale della produzione agrariasicaratterizzaperelevatiimpieghidimezzitecnici,risorsenaturaliedenergiachesitraduconoin impattisignificativisull’ambienteedinconsistentiproduzionidirifiuti.Allostessotempo,iprodottiagricoli hanno quasi sempre perso le loro connotazioni territoriali e la collettività stenta a riconoscere il ruolo dell’agricolturacomepresidiodiunterritoriodamantenereedicuiusufruire.Lacompetitivitàdelsistema agricolo non può prescindere da questo riconoscimento, soprattutto in un contesto europeo dove viene sempre più riconosciuta una remunerazione, diretta o indiretta, alla multifunzionalità dell’agricoltura. L’obiettivo a cui tendere è, quindi, quello di un sistema agricolo che sia in grado di ridurre la pressione ambientale salvaguardando le risorse naturali limitando la produzione di rifiuti e recuperando i sottoprodotti in modo da trasformarli in energia e fertilizzanti. In questo modo, il sistema agricolo può caratterizzarsi come rispettoso dell’ambiente e generare al contempo esternalità positive riconoscibili e quindiremunerabilidallacollettività. Materie primee mezzi tecnici Energiadi altaqualità Risorse naturali Emissioni inquinanti Sistema agricolo Energiadi bassa qualità Materie primee mezzi tecnici Riutilizzo dell’energia Emissioni inquinanti Energiadi altaqualità Sistema agricolo Prodottipoco differenziati Rifiuti Risorse naturali Prodotti caratterizzatidalla sostenibilitàdel sistemaproduttivo Sottoprodotti Valorizzazione energeticae fertilizzante Rifiuti Schemadelsistemaagricoloattuale Schemadisistemaagricolosostenibile SistemaagricoloattualeSistemaagricolosostenibile InstrettacoerenzaconlefinalitàdelBando“AccordiIstituzionali”lanciatonel2009daRegioneLombardia, il programma di Ricerca & Sviluppo BIOGESTECA ha generato e consolidato una rete collaborativa tra gruppi di ricerca appartenenti all’Università degli Studi di Milano, all’Università degli Studi di Milano Bicocca, al Consiglio per le Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura, all’Ente Nazionali Risi, alla Fondazione Parco Tecnologico Padano, alla Fondazione Filarete e ad Agricola 2000, che creando forte sinergiaeintegrazionetracompetenzehaprodottonuoveconoscenzeeinnovazionitecnologicheingrado ͷ di fornire risposte alla richiesta di sostenibilità del sistema agricolo lombardo e più in generale delle agricolturainambientiadelevatapressioneantropica. Le attività del Programma BIOGESTECA, articolate in sette workpakages, hanno adottato approcci di biotecnologieverdiperladefinizionedistrategiedigestionedellecoltureedelterritorioagricoloaridotto impatto ambientale in combinazione con tecnologie per la riduzione degli input e per l’utilizzazione dei reflui e residui con finalità energetiche e fertilizzanti. In particolare sono presi in considerazione aspetti delle colture e della loro gestione, relativi all’uso dell’acqua, dei fertilizzanti, dei presidi fitosanitari e dell’energia, al fine ultimo di migliorare l’efficienza d’uso di queste risorse a garanzia della sostenibilità ambientale ed economica della produzione primaria. Per alcune delle tecnologie e delle alternative innovative sperimentate è stata eseguita anche una analisi tecnica, economica e ambientale in modo di acquisire una valutazione non solo delle singole soluzioni, ma anche dell’intero sistema in cui possono essere impiegate; ciò tenendo conto, quindi, anche dei loro effetti sull’ambiente in termini di energia, emissioni, utilizzo di mezzi tecnici, produzione di rifiuti e delle esternalità (positive e negative) delle produzioniagricoleversolacollettività,qualiilmiglioramentodellafruibilitàelasalvaguardiadelterritorio. WP1 Gestionedegli apportidi fertilizzantial suolo WP6 Utilizzodirefluie residuiperla produzionedi energiae fertilizzazionedei terreni WP2 Efficienzad’usodei nutrientiminerali eriduzionedegli apportidi fertilizzantial suolo WP3 Usodellarisorsa idricanella coltivazionedel riso WP5 Esplorazionedella variabilitàgenetica esceltevarietali WP4 Biocontrollo WP7 Valutazionetecnica,economicaeambientale I risultati del progetto, disponibili al sito www.biogesteca.unimi.it e raccolti in quattro volumi di sintesi (Gestione della risorsa irrigua; Efficienza d’uso dei nutrienti e razionalizzazione delle fertilizzazioni; Biocontrollo delle avversità biotiche; Gestione e valorizzazione dei reflui) forniscono alcune soluzioni tecniche e spunti innovativi che a breve e medio termine potranno fornire soluzioni efficaci per il rafforzamentodellasostenibilitàdell’agricolturaintensivamoderna,siainuncontestoregionalesiainun contesto più ampio nazionale e internazionale. Per quest’ultima ragione le attività e i risultati del Programma BIOGESTECA trovano piena collocazione tra le tematiche e gli obiettivi che caratterizzano l’eventoEXPOinprogrammanel2015nelnostropaese. Il programma si è avvalso per il monitoraggio dei lavori di un Comitato Guida che in qualità di membri esterniallaretecollaborativahaannoveratoespertidelsettoredifamainternazionalequaliilProf.Paolo Balsari(UniversitàdegliStudidiTorino),ilProf.FabioFava(UniversitàdegliStudidiBologna),ilProf.Enrico Martinoia (Università di Zurigo), il Prof. Zeno Varanini (Università degli Studi di Verona) e il Prof. Fabio Veronesi(UniversitàdegliStudidiPerugia).Ledivulgazionedeirisultatitraglisteakeholdersavariotitolo adessiinteressatisièavvalsadelsostegnodellaCameradiCommercio,Industria,ArtigianatoeAgricoltura diLodi. IcoordinatoridelProgramma Prof.GianAttilioSacchi Prof.GiorgioProvolo ͺ Biocontrollo acuradiRobertoPiluePamelaAbbruscato Indice ͲIntroduzione pag. 11 pag. 17 pag. 45 pag. 62 pag. 69 ͲSviluppodimezziabassoimpattoambientale dibiocontrollodell’agentedelbrusone ͲMaisriccoinantiossidanti:un’opportunità perilcontenimentodell’usodiagrofarmaci ͲPeptidiendogenidelsemeadattivitàbiocida ͲSelezioneecaratterizzazionedicolture battericheconattivitàantagonista ͻ ͳͲ Introduzione DopoigrandisuccessirealizzatidallaGreenRevolution,chehamodificatoradicalmentel’agricolturaneipaesi sviluppati, al giorno d’oggi si parla sempre più insistentemente di tematiche riguardanti la sostenibilità e la competitività del sistema agricolo. Infatti, l’utilizzo di genotipi superiori, di mezzi tecnici, risorse naturali ed energiaconseguentiall’applicazionedellemetodologiedicoltivazionemesseapuntonell’ambitodellaGreen Revolution, ha determinato non solo un incremento della produttività agricola ma anche impatti significativi sull’ambienteeconsistentiaccumulidirifiuti.Allostessotempo,iprodottiagricolihannoquasisemprepersole loro connotazioni territoriali e la società stenta a riconoscere il ruolo dell’agricoltura come presidio di un territorio da preservare e non solo di cui usufruire. L’obiettivo a cui tendere è, quindi, quello di un sistema agricolochesiaingradodiridurrelapressioneambientalesalvaguardandolerisorsenaturaliadesempiocon uncorrettosfruttamentodellarisorsaidricaelimitandol’utilizzodifertilizzantieagrofarmaci.Inquestomodo, laproduzioneagricolapotrebbeesserecaratterizzata,oltrechedallaqualitàetipicitàdeiprodottistessi,dal riconoscimento che il sistema produttivo è rispettoso dell’ambiente e capace di generare al contempo esternalitàpositivericonoscibiliequindiremunerabilidallacollettività.Infatti,lestrategieagroambientalidella PoliticaAgricolaComune(PAC),definitadallaUE,sonomirateinlargaparteamigliorarelasostenibilitàdegli ecosistemi agricoli. Uno sviluppo agricolo sostenibile deve quindi garantire la redditività dell'agricoltura prevenendo i rischi del degrado ambientale concorrendo ad una più efficiente gestione delle risorse. In quest’ottica si colloca il progetto “Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema agricolo ad elevata sostenibilità ambientale” ͲBIOGESTECA. Nell’ambito di questo progetto, finanziato dalla Regione Lombardia, si colloca la tematica del Biocontrollo (Work Package4, WP4). Obiettivo di questo WorkPackage è quello di cercare di limitare l’utilizzo degli agrofarmaci in agricoltura per quanto riguarda le colture del riso e del mais che caratterizzano in particolare la nostra Regione. L’elevato costo dei prodotti fitosanitariedilloropossibileimpattoambientalerendonoprioritarialamessaapuntodistrategiealternative didifesadellepiantetesearidurre,senonadescludere,l’impiegodiquestiprodotti.Infatti,lecoltivazionidel mais e del riso hanno raggiunto elevati livelli di produttività grazie alle moderne pratiche agronomiche, ai sistemimeccaniciadisposizioneeall’usodiprodottifitosanitariperilcontenimentodeidannidovutiainsetti, funghi ed infestanti e alla concimazione. Come precedentemente detto, questa metodologia di agricoltura intensiva contribuisce al degrado dell’ecosistema e non è in linea con le richieste delle direttive della nuova PAC e delle “European Integrated Farming Framework Guidelines (2011), nonché della Direttiva 128/2009 sull’usosostenibiledeiprodottifitosanitari.Diconseguenza,lasfidaperlamaidicolturaerisicolturalombarda ogginonèsoloilmantenimentodell’attualeelevataproduttività,malasuaattuazionesenzal’usooconunuso limitato di agrofarmaci e con mezzi e modalità sostenibili per l’ambiente e compatibili con le risorse a disposizione o addirittura con differenti risorse o gestione alternative delle risorse. Questo è un obiettivo importantepermigliorarelaqualitàelasicurezzadeimaiserisicoltivatiinLombardia:bastipensareinfatti, chel’Italiaèilprimopaeseproduttoredirisod’Europacheconunasuperficiecoltivatadi235.000ha(datiENR, 2012), rappresenta circa il 53% della superficie e produzione della Comunità Europea. La peculiarità della risicolturaitalianaècheil94%dell’areaproduttivasiconcentrainPiemonte(52%)eLombardia(42%)perun ͳͳ valore equivalente di 517 milioni di euro (dati Istat 2008). E’ implicito, quindi, il valore economico della risicolturalombardacheèprotagonistainsiemeaquellapiemontesedellafilierarisicolanazionale.Perquanto riguardailmaislasuperficiecoltivataconquestocerealeèdicirca214.000haperunaproduzionedigranelladi circa2263100tonnellate(datiIstat2012)usateingranparteafinimangimisticiedall’agroindustriaingenerale. Quindiilbiocontrollopotrebbecontribuireallasalvaguardiaeallosviluppo,inmanierasostenibile,diquesto enorme patrimonio agricolo così importante per la nostra Regione e per l’intero Paese. L’elevato costo dei presidi fitosanitari ed il loro possibile impatto ambientale rendono prioritaria la messa a punto di strategie alternativedidifesadellepiantetesearidurre,senonadescludere,l’impiegodiquestiprodotti. Il biocontrollo in un contesto di agricoltura sostenibile è effettuato con un insieme di tecniche utilizzate per ridurre i danni dovuti agli agenti delle avversità biotiche, tra i quali notevole importanza rivestono funghi fitopatogeni,conilfinediridurrel’utilizzodiagrofarmacidisintesi.Imezziadisposizioneperl’attuazionedel biocontrollosonoessenzialmente:a)sceltavarietale/modificadeigenotipidellepiante;b)sostanzenaturaliad attivitàinibitorianeiconfrontidegliagentidelleavversitàbiotichec)organismiadattivitàantagonista(Fig.1). Nell’ambito di questo progetto, in sintonia con la logica di multidisciplinarietà e di applicazione di approcci all’avanguardia adottata in tutto il programma di R&S del progetto BIOGESTECA, tutti i mezzi disponibili per l’attuazionediunefficacebiocontrollosonostatiutilizzatieindagaticonmetodiafferentiadisciplinediversee complementaritralorocomelachimica,lamicrobiologia,l’agronomia,ilmiglioramentogenetico,labiologia molecolare,lagenomicaelabioinformatica. Figura1.Letreprincipalistrategieutilizzatenelbiocontrollo:a)selezione/modificadigenotipi;b)trattamenti conbioestrattiec)utilizzodiorganismibeneficiadattivitàantagonista. Nell’ambitodellastrategia(a),l’attenzioneèstatarivoltaaifunghifitopatogenietossinogeni,responsabilidi danni rilevanti alle colture. L’insorgenza e la diffusione delle infezioni fungine è generalmente limitata mediante trattamenti con fungicidi specifici. A titolo di esempio, in anni particolarmente favorevoli alle infezioni, quasi l’80% della superficie investita a riso nel nord Italia viene sottoposta a trattamenti fungicidi. Diversi studi hanno mostrato l’esistenza di variabilità genetica di alcuni caratteri legati alla resistenza delle ͳʹ piantealleinfezionidapartedifunghifitopatogeni;taliresistenzesonodeterminatedaunsingologeneodaun gruppo di geni che possono essere studiati e sfruttati per la selezione o l’individuazione di varietà con un’elevatacapacitàdicontrastarel’insediamentodelpatogeno,dapotersiimpiegareinstrategielowͲinputdi contenimentodeidanni.Fralemalattiedelrisoèdiparticolarerilevanzailbrusoneilcuiagenteeziologicoèil fungo Magnaporthe oryzae che causa sulle foglie lesioni a macchia di colore rosso, dal tipico aspetto di “bruciature”(Fig.2A).Isintomidellamalattiapossonocompariresufoglie(brusonefogliare),culmo,collettoe pannocchia (mal del collo), assumendo diverse forme e colore, anche in base alla sensibilità della cultivar. Il brusone è sicuramente la malattia che causa le maggiori perdite di produzione proprio alle nostre latitudini, quandoilrisoècoltivatointerrenisommersiesciolti,carentiinsostanzaorganica,eccessivamenteconcimati (conparticolareriferimentoall’azoto),ecomunqueinpresenzadivarietàsensibili.Occorreinoltresottolineare che molti funghi possono influenzare la qualità delle produzioni in quanto produttori di micotossine estremamentepericoloseperlasalutedell’uomoedeglianimalidomestici.Icereali,edinparticolareilmais, sonotraivegetalipiùfrequentementecontaminatidamicotossine,chepossonoessereprodottesiainfasedi coltivazione, sia in post raccolta. Su mais sono particolarmente frequenti funghi del genere Fusarium, soprattutto i produttori di fumonisine, mentre più sporadici sono i miceti afferenti ai generi Aspergillus e Penicillum,ingradodiaccumularerispettivamenteaflatossineeocratossine(Fig.2B). Figura2.Duetralepiùimportantimalattiedelrisoedelmaiscausatedafunghifitopatogeni,brusoneinriso (A)efusariosiinmais(B). ͳ͵ Lasintesidimicotossinedapartedeisingoliceppifunginidipendedanumerosifattori,ilprimodeiqualiè senza dubbio rappresentato dalla presenza dei geni che rendono possibile lo svolgersi dell’intero iter metabolicocheportaall’accumulodellevariesostanzetossiche.Lapotenzialitàtossinogenasiesprimesolo quando si verificano le opportune condizioni climatiche e nutrizionali e la componente biotica ambientale non interferisce negativamente con la sintesi della micotossina. Risulta quindi importante verificare l’influenza della composizione delle cariossidi dei diversi ibridi sulla potenzialità tossinogena di isolati di Fusarium, Aspergillus e Penicillium, al fine di individuare eventuali fattori che inibiscono l’accumulo delle varie micotossine. La strategia più efficace attualmente adottata in preͲraccolta per ridurre il rischio di infestazione e quindi di accumulo di micotossine, si fonda essenzialmente su principi di lotta agronomica (scelta varietale basata sull’epoca di semina e/o sulla durata del ciclo produttivo e controllo della concimazioneazotata)odilottachimicacontrolapiralide,insettoͲchiavenellacolturadelmaischefavorisce le infezioni fungine. Lo studio dell’insiemedei fattori che consentono lo sviluppo di funghi fitopatogeni nei cereali potrebbe essere affrontato anche attraverso l’identificazione di meccanismi molecolari e di vie metabolichecoinvoltineifenomenidiresistenzadaosservatiinalcunigenotipiovarietàdipiante.L’impiego dellemodernetecnologiediindaginebioͲmolecolarisuivegetalipotrebbequindifornireindicazioniutiliper losviluppodistrategiedibiocontrollo. Lastrategia(b)attuauncontenimentodeipatogenimediantel’usodisostanzenaturali.Questeincludono: 1)metabolitiadattivitàantifunginaestrattidamicrorganismie/opiante 2) estratti cellulari di microrganismi e/o molecole che attivano/potenziano le reazioni di resistenza della pianta Nel primo caso si tratta di molecole che agiscono direttamente sul fungo stesso, inibendone la crescita o causandone la morte, in modo analogo ai fungicidi di sintesi, dai quali si differenziano perché estratti da piantee/omicrorganismi.Nelsecondositrattadiestrattichenonhannoalcunaazionesulfungopatogeno, ma agiscono indirettamente attivando o amplificando le difese della pianta. Le piante dotate di geni di resistenza reagiscono all’infezione da parte del patogeno, cercando di limitarne/impedirne lo sviluppo. Questo può tradursi in una rapida risposta di difesa in corrispondenza del sito di infezione, la cosiddetta risposta ipersensibile (Hypersensitive Response o HR), che comporta la variazione dei flussi di ioni calcio, produzionedispeciereattivedell’ossigeno(ROS),edinfinelamortedellecelluleinvaseconilconseguente contenimentodelpropagarsidell’infezione.Inaltricasinonsievidenziarispostaipersensibileelalimitazione della colonizzazione dell’ospite viene conseguita con la produzione di molecole ad attività antimicrobica diretta, proteine di patogenesi (PR proteins:pathogenesisͲrelated proteins) come glucanasi o chitinasi e l’apposizione di barriere fisiche rappresentate da callosio o lignina. La risposta ipersensibile è frequentemente associata con l’attivazione della cosiddetta resistenza sistemica acquisita o SAR (Systemic Acquired Resistance) che si manifesta a distanza temporale di uno o più giorni dalla HR e interessa anche organi distali rispetto alla zona di interazione ospiteͲpatogeno. L’attivazione della SAR è mediata dall’acido salicilico che induce la sintesi di PR e al contempo inibisce le catalasi che degradano le ROS. La SAR viene stimolata, oltre che da HR, anche da infezioni ad esito necrotico e da composti chimici di varia natura, ͳͶ denominati nel loro complesso, attivatori di resistenza. La somministrazione degli induttori di resistenza primadell’eventoinfettivopredisponelapiantaareagirepiùprontamenteepiùefficacementealtentativodi colonizzazionedapartedelpatogeno. Ulterioriprospettivesonorecentementeemerseinseguitoall’individuazionedimicrorganisminaturalmente associatiaicerealiedingradodicontrastarelosviluppodiagentifitopatogeniesercitandounafunzionedi biocontrolloattraversofenomenidicompetizionepernicchieecologicheesubstrati,produzionediinibitori, sostanzeallelochimiche,antibiotici,cianidiedenzimilitici(strategiac). Batteripromotoridellacrescitavegetale(PlantGrowthPromotingBacteria,PGPB)sonoingradodiesercitare un’attività di stimolazione indiretta della crescita. PGPB aventi attività antagonista nei confronti di classi diversedifitopatogeni,risultanoinfattiutilinellaprotezionedellecoltureesonoinoltreapplicabiliinapprocci didifesaintegrata.L’attivitàantagonistacomprendediversimeccanismi,qualilacompetizionepernicchieo substrati, la produzione di inibitori allelochimici appartenenti alle classi dei siderofori, enzimi litici (1,3Ͳ glucanasi,chitinasi),antibiotici,batteriocineecianidi.Apparequindiinteressantelapossibilitàdiprocedere adunostudiodiscreeningedieventualeisolamentodimicrorganismidotatiditalecapacitàepromettentela loroapplicazioneincampocomeinnovativosistemadibiocontrollodellefitopatologiedelrisoedelmais. In questo quaderno verranno raccolti gli studi effettuati nell’ambito di questo progetto di ricerca suddivisi nelleseguentiattività: ͲSviluppodimezziabassoimpattoambientaledell’agentedelbrusone Gliobiettivispecificidell’attivitàsarannolaselezioneelamessaapuntodimezzi“naturali”dibiocontrolloda utilizzare nella difesa del riso dall’agente del brusone. Per la selezione di mezzi di biocontrollo a basso impattoambientaledautilizzareinalternativaaifungicididisintesi,siintendestudiarel’efficaciadell’utilizzo siadiunaclassedisostanzenaturalianotaazionefungicida,lesaponine,dicuisonopiuttostoricchelespecie afferentialgenereMedicago,siadiattivatoridelsistemadidifesadiriso.Labiosintesidellediversesaponine diMedicagospp.èstatacaratterizzatamolecolarmenteperlasintesidisaponinespecificheinvitrosuscala industriale. Inoltre, materiali genetici di Medicago con contenuti e composizioni specifiche di saponine differentisonostatiinvestigatiperlacostruzionedivarietàutiliallaproduzionesiadiforaggiosiadispecifici metabolitisecondari.Unsecondoobiettivodiquestaattivitàsaràquellodiidentificareigenichiaveattivati nellarispostadidifesadelrisoabrusone,qualitargetutilipersvilupparemolecoleadazioneprotettivae/o guidareiprogrammidimiglioramentogeneticodivarietàpiùresistenti. ͲMaisriccoinantiossidanti:un’opportunitàperilcontenimentodell’usodiagrofarmaci Obiettivo specifico dell’attività è la costituzione e l’identificazione di genotipi di mais ad elevata pigmentazioneecontenutoinflavonoidiingradodicontenerelacontaminazionedamicotossine.Irisultati ͳͷ dell’attività,oltreacostituireunprimopassoversolacostituzionedigenotipidimaisconminorrichiestadi trattamenticonagrofarmaci,potrebberopermetterelacostituzionedilineedautilizzatenellaproduzionedi ibridiadelevatovalorenutraceuticoinquanto,appunto,ricchiinflavonoidi. L’attività è suddivisa in due parti, la prima che costituirà e studierà i genotipi pigmentati e la seconda che studierà i genotipi più promettenti (coltivati in prove parcellari in diverse località) per quanto riguarda la caratterizzazionedeifunghipatogenipresentipotenzialmentecapacidiprodurremicotossine. ͲPeptidiendogenidelsemeadattivitàbiocida L’attivitàsiproponediidentificarelineedimaisicuisemimegliodialtreaccumulanoerilascianonelmezzo, durante le primissime fasi della germinazione, proteine e/o peptidi in grado di inibire la crescita di funghi patogeni. L’indagine si propone inoltre, ricorrendo ad opportuni protocolli di purificazione ed analisi proteomica,l’identificazione,lapurificazioneelacaratterizzazionemolecolaredellemolecoleattive.Lelinee di mais più interessanti potrebbero costituire materiale di base per possibili programmi di miglioramento genetico indirizzati alla costituzione di ibridi di mais i cui semi necessitano in misura minore di trattamenti concianti.Inoltre,l’identificazioneelacaratterizzazionedellemolecoleattiveèunottimopresuppostoperun eventuale sfruttamento del loro potenziale biotecnologico applicativo in una logica di biofarming, cioè di messaapuntodisistemibiologici(colturebatteriche,colturecellularioditessuti)perunaloroproduzionein scalaindustriale. ͲSelezioneecaratterizzazionedicolturebattericheconattivitàantagonista Obiettivo di questa attività è quello di isolare e caratterizzare ceppi batterici con attività antagonista nei confrontidialcunespeciebatterichedifitopatogenicheinteressanomaiseriso.Irisultatidiquestolavoro permetteranno di selezionare specifici ceppi microbici che da soli o in coͲcoltura potranno essere sfruttati come antiparassitari biologici in grado di proteggere le colture di mais e riso dall’attacco di specifici microrganismi fitopatogeni. E’ stata così generata una collezione microbica di circa 100 isolati batterici endofitierizosfericidapiantedimaiseriso.Sonostaticondottideitestinpiastrapervalutarelacapacità della collezione microbica di attinomiceti e degli isolati microbici con attività di promozione della crescita ACCͲdeaminasica(ACCd)dieffettuareattivitàdibiocontrollocontrofitopatogenidelmaisedelriso.L’intera collezione,èstatasaggiataneiconfrontidiceppisiadiFusariumverticillioides,siadiMagnaportheoryzae.I ceppichehannodimostratoattivitàantagonistaneiconfrontideifitopatogenisaggiatisonostatiidentificati tramite sequenziamento parziale del gene 16S rRNA. Successivamente è stato intrapreso uno screening attraverso saggi in vitro per caratterizzare quali attività di promozione della crescita vegetale (PGP) siano coinvoltenelbiocontrollo. IntroduzioneacuradiRobertoPilu,PamelaAbbruscatoeAnnamariaVercesi. ͳ Sviluppo di mezzi a basso impatto ambientale di biocontrollo dell’agentedelbrusone PamelaAbbruscato1,LauraCrispino1,BarbaraMenin1,PietroPiffanelli1 ElisaBiazzi2,MariaCarelli2,PatriziaGaudenzi2,CarlaScotti2,AldoTava2 1) FondazioneParcoTecnologicoPadano,Lodi 2) CRAͲCentrodiRicercaperleProduzioniForaggereeLattieroCasearie,Lodi Introduzioneallatematica Tralediverseproblematicheambientalidaaffrontareinagricoltura,perevitareingentiperditediraccolto,la gestione delle malattie è una delle più complesse, dal punto di vista pratico (diversità e incidenza dei patogeni) ed onerose per l’aspetto economico (costo dei fitofarmaci). La malattia del riso più grave e più diffusa nel mondo e anche nell’areale lombardo è il brusone (Ou, 1985), il cui agente eziologico è il fungo fitopatogenoMagnaportheoryzaeB.Couch(CouchandKohn,2002)telomorfodiPyriculariaoryzaeCavara, chepuòsvolgerepiùcicliinfettividurantelastagionevegetativadell’ospite.Lamalattiainteressalefoglieei culmidellapianta,malaformapiùdannosaèilcosiddetto“maldelcollo”,dovutoallosvilupponell’ultimo internodo sotto alla pannocchia, con conseguente deperimento ed essiccamento parziale o totale delle spighetteinessacontenute.Ciòdeterminadannisiaallaquantitàdiraccolto,siaallaqualità,ovverodiresa alla lavorazione (Cortesi, Giuditta 2003). L’incidenza di questa malattia è aggravata dalle condizioni meteoͲ climatiche(escursionitermicheevalorimediditemperaturaelevati,persistenzadirugiadainprimamattina, bagnaturafogliare,umiditàdell’aria)chefavorisconolosviluppoegerminazionedelpatogeno,nonchélasua penetrazionenellapianta.Nel2007,ilconsistenteaumentodelletemperatureedumiditànelperiodoestivo ha causato una grave incidenza del “mal del collo” e si sono registrate perdite vicine a 10 quintali/ettaro. Durantelacampagna2008,l’intensitàdeidannicausatidalpatogenoèstatadecisamentetralepiùelevate degliultimidecenni.Lecondizionideinutrientinelterrenopossonoaggravarel’entitàdelleperdite:terreni carenti in sostanza organica o sabbiosi o limosi (Picco et al., 2000) e/o l’eccessiva concimazione azotata aumentano significativamente la gravità dell’epidemia (Manibhushan Rao, 1994). Uno studio recente sulla diffusioneterritorialedellamalattiatraPiemonteeLombardia(Tabacchi,2011)haevidenziatounamaggior frequenza ed intensità delle epidemie di brusone nelle provincie di Pavia e Milano, legata a questi fattori. Infatti, il terreno nell’areale lombardo, avendo un minor contenuto di sostanza organica e una tessitura sabbiosa, richiede un maggior apporto di azoto, facilitando conseguentemente l’instaurarsi e la diffusione della malattia. Inoltre, in queste aree, è più diffusa la semina interrata a file su terreno asciutto (con irrigazione20Ͳ30giornidopolaseminaesuccessivagestioneinsommersioneoturnata),chefavorisce,però, maggioresquilibrionellanutrizioneazotataedelevateescursionitermiche. Una recente ricerca sulle resistenze del germoplasma di riso storico italiano ha dimostrato che solo il 30% delle varietà tipiche italiane presenta una resistenza genetica al brusone (FaivreͲRampant et al., 2011), ͳ richiamandolanecessitàdisviluppodinuovevarietàresistenti.Nelleprovincielombardesonomaggiormente coltivate le varietà tipiche da risotto, come Carnaroli, Vialone Nano, Arborio che sono, però, tra le più suscettibilialbrusonedituttelevarietàstoricheitaliane,aggravandoancoradipiùlagestionedellamalattia inLombardia.Talifattorihannocomportato,inquesteprovincie,unusometodicoecontinuodifungicidiper limitare i danni ed evitare la perdita dei raccolti. A queste condizioni, infatti, senza appositi trattamenti fungicidi, si stimano perdite produttive attorno al 7Ͳ10% in bassa presenza di brusone; in aree ad alta incidenzaildannopuòsuperareperfinoil40%.Dal2012,fattaeccezioneperunaprorogaconcessainItalia anche l’anno successivo, la Comunità Europea ha vietato l’uso di fungicidi contenenti triciclazolo, sostanza attivamoltoefficaceneiconfrontidiM.oryzae.Soloduesostanzeattive,azoxystrobineflutriafol,risultanoal momento registrate su riso per il contenimento dei danni dovuti al patogeno: i Disciplinari di Protezione Integrata in vigore in Lombadia e Piemonte consentono l’esecuzione di un unico intervento all’anno con il soloazoxystrobin.L’incrementodellafertilizzazioneazotatainrisaia,lamancanzadiunaresistenzagenetica nelle varietà tipicamente coltivate in Lombardia e la minor disponibilità di fungicidi dotati di diverso meccanismo d’azione rendono cruciale e attuale mettere a punto strategie di difesa nei confronti di M. oryzae che consentano di coltivare il riso in Lombardia rispettando l’ambiente e compatibilmente con le risorse disponibili. Tale obiettivo può essere perseguito con la selezione di varietà di riso più resistenti al patogeno,maancheconsostanzenaturaliattiveneiconfrontidiM.oryzae,dautilizzareinsostituzionedei fungicidi di sintesi. La maggior parte degli studi in corso per lo sviluppo di strategia di lotta biologica si concentrano sull’identificazione di microorganismi o loro estratti cellulari ad elevata attività inibitoria nei confronti di M. oryzae. Tra questi: il fungo endofita Harpophora oryzae (Su et al., 2013), una miscela di rizobatteri (Filippi et al., 2011), due ceppi batterici dal caratteristico comportamento da plant growthͲ promoting rhizobacteria (PGPR) identificati come Pseudomonas fluorescens e Chryseobacterium balustinum (Lucasetal.,2009),BacillusmethylotrophicusBC79(Shanetal.,2013)eilbatterioendofitaAchromobacter xylosoxidansAUM54(Melvinetal.,2012).L’attivitàantifunginadisingolimetabolitiestrattidaStreptomyces, come la molecola antifungalmicina 702 isolata da S. padanus JAU4234 (Xiong et al., 2013) o le molecole resistomicina e tetracenomicina D isolate da S. canus BYB02 (Zhang et al., 2013), è stata verificata, ma, essendo in alcuni casi queste sostanze antibiotici antibatterici, l’utilizzo in campo di queste molecole può comportareseririschiperlasalutedelconsumatoreeperl’ambiente. Perquantoriguarda,invecelemolecolederivatedapianteedotatediattivitàantifungine,sonoancorapochi icompostisaggiatiperuneventualeusoneiconfrontidiM.oryzae,malgradoilvivointeressesuscitatonel settore medico, farmaceutico e agroͲindustriale. Esiste, infatti, una vasta letteratura che descrive molecole estrattedapianteagrarieomedicinaliadattivitàantifunginaneiconfrontididiversipatogenifunginiumanie vegetali(Arifetal.,2011).QuesticompostiisolatidadiversespecievegetalieanchenoticomefitoͲchimicio fitoͲcomplessisonoalmeno5000(Crozieretal.,2006). Si tratta essenzialmente di metaboliti secondari che le piante stesse producono a scopo difensivo nei confronti di diverse classi di microrganismi patogeni e insetti fitofagi, ma anche metaboliti implicati nella produzionedegliaromi,dellepigmentazionideifioriedialtriorganidellapianta. ͳͺ Leprincipaliclassidicompostiantifunginidioriginevegetaleadoggidescrittesonorappresentatedafenolie acidifenolici,flavonoidi,cumarine,chinoni,saponine,xantoni,terpenoidi,alcaloidieoliiessenziali(Harborne et al., 1999). Inoltre, questi composti possono anche avere natura proteica, come numerose lecitine e polipepetidi(Selitrennikoff,2001).Tuttequestemolecolehannodimostratoindiverseproveinvitroeinvivo attività biocida o biostatica (inibizione di attività enzimatiche) sia con il loro uso tal quale, o previa modificazionechimicaperlaloroattivazioneoinfinecomemodelliperlosviluppodialtremolecoleanaloghe, mapiùefficaci(Arifetal.,2011).AoggièstatadimostrataunanotevoleattivitàantifunginacontroM.oryzae sia in vivo che in vitro solo per due metaboliti appartenenti alla famiglia delle cumarine (decursina e decursinoloangelato),estrattidalleradicidiunapiantacoreanaAngelicagigas(Yoonetal.2011). In questo progetto sono state indagate per la loro nota attività fungicida (Tava e Avato, 2006) le saponine triterpenichedelgenereMedicagoe,inparticolare,quelleprodottedaerbamedica(MedicagosativaL.),la più importante leguminosa foraggeracoltivata in Italia, il cui areale di coltivazione coincide in larga misura conquellodeldistrettorisicolopadano.LesaponinepresentinelgenereMedicagosonometabolitisecondari costituitidaunamiscelacomplessadiglicosiditriterpenici.Questicompostihannodimostratodipossedere unampiospettrodiattivitàbiologiche,tracuiquellainibirelosviluppodipatogenivegetalifunginiebatterici, insetti fitofagi e microfauna del terreno, come i nematodi (Tava e Avato, 2006). L’attività biologica dei triterpeni che complessivamente costituiscono le saponine nel genere Medicago è in relazione con la loro struttura chimica: in particolare, le caratteristiche della parte agliconica della molecola (sapogenina) e la naturaeposizionedeglizuccheriadessalegati(Tavaetal.,2011).Inerbamedica,adesempio,sidistinguono saponine emolitiche e non emolitiche sulla base della loro capacità di provocare emolisi per rottura delle membrane cellulari. I due gruppi presentano diversi sostituenti ossidrilici (ͲOH) e carbossilici (ͲCOOH) in posizioniprecisedell’anellotriterpenico,comemostratonellafigura1. Saponine emolitiche COOR1 COOR1 HO OH ederagenina OH RO HOOC RO HOOC RO COOR1 HO acido medicagenico acido zanico R=R1=H Saponine non emolitiche sapogenina OH OR1 OH R= zuccheri R1=H saponina RO RO OH soiasapogenolo B OH soiasapogenolo A R=R1=zuccheri Figura1.PrincipalisaponineinMedicagospp. Ingenere,lesaponineemolitichesonopiùefficacirispettoallesaponinenonemolitiche,maancheall’interno delgruppoemoliticosonostateriscontratenotevolivariazionidiattivitàbiologica,ades.saponinedell’acido medicagenicopiùattivediquelledell’acidozanico(TavaeAvato,2006).E’dunqueimportanteperunuso ͳͻ efficiente e competitivo di questi composti naturali individuare quelli più attivi nei confronti di diversi patogeni. Unadelleattivitàdellatematicadelbiocontrollosviluppatanell’ambitodelprogettoBIOGESTECAmiravaalla selezionedimezzinaturalidibiocontrollodautilizzarenelladifesadelrisoneiconfrontidiM.oryzaeealla loroeventualemessaapuntoperunutilizzoabreveͲmediotermine.Tramitediversiapproccidianalisisono stateesploratetrepossibilisoluzionipotenzialmenteintegrabiliinun’unicastrategiadidifesa: ͲApplicazionedisaponine,sostanzenaturaliestrattedaMedicagospp.,anotaattivitàfungicida; ͲUtilizzodiVerdeviva,soluzionesalinaadazionefungicidae/obiostimolante; ͲIdentificazionedeigenichiavecoinvoltinellarispostadidifesadirisoabrusoneutiliperlosviluppodinuovi compostiadazionediprotezionee/odinuovevarietàresistenti. Dati i promettenti risultati raggiunti con le saponine, è stata svolta un’approfondita caratterizzazione molecolaredellaviabiosinteticadellesaponine,invistadiun’ottimizzazionedellalorosintesisiainpianta cheinsistemieterologhi(es.lieviti).Talecaratterizzazionehaprevistosial’identificazioneeanalisifunzionale di geni della via biosintetica delle saponine in Medicago spp. che l’individuazione di materiali vegetali diversificati per contenuto e composizione in saponine, per l’ottenimento di varietà commerciali destinate allaproduzionediquestesostanze. Per perseguire gli scopi previsti di questa attività, oltre all’approccio multidisciplinare già menzionato nell’introduzione generale, sono stati applicati approcci e metodi tra i più moderni ed innovativi, come il sistema di screening ad alta processività BLASTEST, l’analisi trascrittomica globale e l’analisi TILLING della variabilitàgenetica. ͲIlsaggioBLASTESTèunmetodomessoapuntopressoilaboratoridellaGenomicaRisodelPTPche,tramite l’infezionedipiantedi risocondiversi ceppi diM. oryzae e successiva fenotipizzazione dei sintomi fogliari, consentedivalutarel’incidenza/severitàdellamalattiae,quindi,dìestrapolareillivellodiefficaciainplanta di un trattamento fungicida o protettivo dopo la sua applicazione. Permette una valutazione qualitativa in funzione delle categorie di sintomi da 1 (assenza malattia) a 5 (grave incidenza malattia), e quantitativa, grazieallastimanumericadellefogliesintomatichediciascunacategoria,piantaperpianta. ͲPerlaricercadigenidirisocoinvoltinellarispostadidifesaèstataadottataun’analisitrascrittomicaglobale molto sensibile che permette di identificare liste di geni che vengono attivati o disattivati in funzione dell’infezione del fungo. Tali liste, analizzate con programmi bioinformatici ad elevata capacità di processamento di set di dati ampi, permettono di comprendere quali meccanismi molecolari e vie metabolichesonosignificativamentecorrelaticonlarispostadelrisoall’attaccodelbrusone,e,quindi,quali target siano di potenziale interesse per composti ad azione protettiva o biostimolante nel controllo del brusonedelriso,nonchépermiglioraregeneticamentelevarietàdiriso. ͲL’indaginemolecolaredellaviabiosinteticadellesaponineèstataeffettuatatramiteanalisidiunacollezione dimutantiTILLING(TargetingInducedLocalLesionINGenomes)costituitanellaspeciemodelloM.truncatula (Porceddu et al., 2008). La tecnologia TILLING (Henikoff et al. 2004) permette di identificare mutazioni nucleotidiche nella sequenza di geni putativamente coinvolti nella determinazione di un carattere di ʹͲ interesse, di individuare le piante che portano tale mutazione allo stato omozigote o eterozigote e di studiarne il fenotipo per determinare il ruolo del gene mutato. I vantaggi della tecnica TILLING sono: di forniresiamutazioninonsenso(knockͲout),chemutazionidisenso,diessereapplicabileamoltespeciedi interesseagrariosenzafarericorsoallatrasformazionegenetica,diprodurreun’altadensitàdimutazionied essere indipendente dalle dimensioni del genoma, dal sistema riproduttivo dell’organismo in esame e dal tempo di generazione. Un altro approccio che è stato applicato per l’analisi di variabilità genetica è l’ECOTILLINGviasequenziamentodell’interoframmentodeigenicandidati. Questoapprocciosibasasullaricercadimutazionispontaneecheesistonoindiversigenotipi/popolazionidi una stessa specie, sotto forma di polimorfismi di singoli nucleotidi (SNPs). L’analisi degli SNP può fornire informazioniimportantipermettereinrelazionelavariabilitàfenotipicaconlavariazionedisequenzadigeni putativamentecoinvoltinelladeterminazionedelcaratterestesso. SELEZIONEDIDIVERSIMEZZIDIBIOCONTROLLODELL’AGENTEDELBRUSONE L’obiettivo specifico di questa ricerca è la selezione e messa a punto di uno o più mezzi naturali di biocontrollo da utilizzare nella difesa del riso nei confronti di M. oryzae. A tal fine è stato applicato un approccio articolato in tre soluzioni complementari da utilizzare all’interno di un’unica strategia di lotta integrata. Da un lato, infatti, è stata studiata l’efficacia delle saponine di Medicago spp., a nota attività fungicida, su una miscela di isolati di M. oryzae, rappresentativi della biodiversità genetica del brusone nell’arealelombardoedalladiversavirulenzaverificatasudiungrupporappresentativodigenotipidiriso. L’efficacia delle saponine, saggiata tramite BLASTEST, è stata verificata su genotipi di riso dal diverso comportamento nei confronti del patogeno (suscettibile, mediamente suscettibile e resistente) e nell’efficienzad’usodellerisorseambientali(azoto,zolfoeidriche),perrisponderetotalmenteagliobiettivi delprogettoemegliointegrarneirisultatinellaprospettivadiunagestioneintegratadellacoltivazionedel risoinLombardia.LafenotipizzazionetramiteBLASTESTsuglistessigenotipièstatasvoltaanchepervalutare glieffettidelVerdeviva,unasoluzioneelettrochimicamenteattivataottenutadaKCledacquautilizzandoil sistema EVA System® 100 di Industrie De Nora S.p.A. In precedenti prove sperimentali, il Verdeviva ha dimostrato azione battericida/fungicida e capacità di stimolare le difese endogene di piante orticole: rappresenta,quindi,unapromettentealternativaostrumentointegrativoancheperilcontrollodiM.oryzae. Dall’altro lato, tramite analisi trascrittomica globale dopo l’infezione di riso con diversi ceppi di M. oryzae, sono stati identificati i geni chiave coinvolti nella risposta di difesa di riso al patogeno, utili per l’identificazionedinuovitargetperlosviluppodinuovemolecoleadazioneprotettiva/biostimolanteoper guidareiprogrammidimiglioramentogeneticoversovarietàpiùresistenti. Attivitàsvolte EfficaciadellesaponinediMedicagospp.neiconfrontidell’agentedelbrusonedelriso ʹͳ Lesaponinesonostateestrattedapartiaereeedapartiradicalidiunapopolazionedierbamedica(Ecotipo Romagnolo) notoriamente ad alto contenuto in queste sostanze, purificate e caratterizzate nella loro composizioneagliconicamedianteanalisigascromatografiche(Tavaetal.,1993;Tavaetal.,1998).Lemiscele di saponine grezze e alcune singole saponine in purezza ottenute mediante procedimenti di separazione cromatograficainfasenormale(geldisilice)einfaseinversa(RP18)(TavaeAvato,2006),sonostatevalutate per la loro attività in vitro contro M. oryzae tramite determinazione della MIC (minima concentrazione inibente)perselezionarelamiscelaoilcompostopiùefficacedautilizzarenelleproveinplanta.L’efficacia delle diverse miscele/singoli composti è stata paragonata con quella del flutriafol, principio attivo comunementeapplicatoinrisaianeiconfrontidiM.oryzae.Illavoroèstatosvoltoincollaborazioneconil DipartimentodiScienzadellaTerraedell’Ambiente,LaboratoriodiMicologiadell’UniversitàdiPavia. Nel contempo, è stata indagata la diversità genetica di una collezione di più di 200 isolati di M. oryzae, ottenuti da campioni di riso raccolti nell’areale lombardo in tempi recenti, per selezionare i ceppi di riferimentodautilizzarenelleproveinplanta.Perilfingerprintingdellacollezione,ovverol’analisimolecolare della diversità genetica sono stati utilizzati i marcatori microsatelliti, detti anche SSR (Simple Sequence Repeat). I marcatori SSR sono regioni di DNA non codificante caratterizzate dalla ripetizione di una stessa brevesequenza;ilnumerodiripetizionidiquestesequenze,cheèdiversotradifferentiindividui,dàoriginea polimorfismi. I SSR sono caratterizzati da un elevato grado di polimorfismo anche all’interno di una stessa specie e da un’ampia distribuzione nel genoma; queste caratteristiche li rendono particolarmente adatti all’analisi degli isolati di M. oryzae, che presentanoun’elevata similitudine perché in campo si riproducono principalmenteperviaclonale,ovveroasessuata.ISSRsonostatiapplicatiaglistudididiversitàgeneticadel brusonefindal2000eadoggisistimanoinpiùdi1000nelgenomadiMagnaporthe.Zhengecollaboratori (2008)hannosviluppatounsetdi176marcatoriSSRutilizzandoidatidisequenzadelgenomadiM.griseae costruito una mappa genetica. Gli stessi autori hanno anche sviluppato un database online dei SSR disponendoliall’internodelgenomaperfacilitarericerchedimappaggioeclonaggiogenicoinMagnaporthe. TratuttiiSSRdiMagnaporthegiàutilizzatiinprecedentistudididiversitàgeneticaedipopolazionedidiverse collezionidiM.oryzae(Kayeetal.,2003;Deanetal.,2005;Adreitetal.,2007;Salehetal.,2012)sonostati scelti25SSRdistribuitinei7cromosomi,datestaresullacollezionediisolatiitalianielombardidelprogetto BIOGESTECA.Gliisolatipresceltiperleprovediinfezioneinplantasonostatipreliminarmentesaggiatisuun gruppo di genotipi di riso a diverso livello di suscettibilità/resistenza per valutare la loro variabilità nella capacitàinfettiva.I9genotipidirisoutilizzatiperquesteprovedivirulenzaincludevano,inordinecrescente di resistenza, 3 varietà suscettibili (Maratelli, Vialone Nano, Arborio), 3 mediamente suscettibili (Carnaroli, Volano,Gladio)e3resistenti(Augusto,Salvo,GiganteVercelli).Sceltiiceppidiriferimentoedefinitalaloro virulenza,sonostateeffettuateprovepreliminariperla messaapuntodellamodalitàdiapplicazionedelle saponineeperottimizzarelametodologiadifenotipizzazione. Infine,sonostateeseguite2seriediprovediverificadellapotenzialeattivitàdicontrollodellesaponinesul brusone: la prima con il genotipo Maratelli altamente suscettibile al patogeno, utilizzando il formulato di flutriafolnellaconcentrazionenormalmenteutilizzataincampo(250mgLͲ1)cometestimonetrattato,mentre perlasecondaseriesonostatiimpiegatiilgenotipomediamentesuscettibileBaldoeilgenotiporesistente ʹʹ Selenio,perchéquesteduecultivareranorisultateinteressantinellealtretematichediprogetto(WP1,WP2, WP3)pergliaspettidialtaefficienzad’usodell’azoto,dellozolfoedell’acqua,alloscopodiintegrareirisultati delle diverse unità operative e tematiche del progetto BIOGESTECA. Tutte le prove hanno previsto l’applicazionedellesaponinesiainpreͲinfezione(24oreprima)siainpostͲinfezione(3giornidopoinfezione) allaconcentrazionedi10gLͲ1.Unamisceladiceppi,conunrappresentanteperciascungruppofilogenetico identificato con le analisi fingerprinting, è stata utilizzata per le infezioni. Ciascuna prova ha previsto tre replichebiologichecondotteatempidiversi,perleopportuneanalisistatistiche. ValutazionedeglieffettidellasoluzioneVerdevivasulbrusonedelriso LasoluzioneVerdevivaèstatasottopostaavalutazionedeglieffettisullepiantedirisoinfettateinpre(24 ore) e postͲinfezione (72 ore), alle stesse condizioni e con le stesse modalità del trattamento e fenotipizzazione delle saponine, applicando la soluzione alla concentrazione di 500 ppm. Dato il potenziale effetto biostimolante della soluzione è stata anche applicata a 24 e 72 ore postͲinfezione, per valutare un eventualeeffettoadditivodi2applicazionisuccessive. RicercadeigenichiavecoinvoltinellarispostadidifesadirisoaM.oryzae Perlaricercadeigenicoinvoltinellarispostadelrisoalbrusonesonostateeffettuateinfezionicon4diversi ceppidiMagnaporthedallecaratteristichediverse:iceppiM.oryzaeFR13,BR32eCL367isolatidarisooaltri cereali(entrambigraminacee)equindiingradodiinfettarequestiospiti,mentreilceppoM.griseaBR29è stataottenutadaunagraminaceainfestante(Digitariasanguinalis)equindinonrisultapatogenaperilrisoo icerealicoltivati.Inoltre,itreceppiospitemostranovirulenzadistinta,ovverochesidistinguonoinbaseal tipo di risposta (suscettibile/resistente) che generano nel riso. Più precisamente l’isolato FR13 è noto per essere virulento sul genotipo di riso in esame, Nipponbare, quindi capace di infettarlo. Gli altri due ceppi (CL367eBR32)infettanosoloigenotipichenoncontengonoicorrispondentigenidiresistenzaesonoquindi avirulentisuNipponbarechepresentaigenidiresistenzaconiugatiaigenidiavirulenzadiCL367eBR32.Di conseguenza, Nipponbare risulta resistente nei confronti di BR32 e CL367. Siccome M. grisea BR29 non infetta il riso, Nipponbare manifesta un fenotipo totalmente resistente dopo l’infezione con questo ceppo. Dallepiantineinoculatesonostatiprelevaticampionidifogliea2diversitempi(12e24oredopol’infezione) per identificare i geni coinvolti nella risposta di difesa a tempi precoci e tardivi. Le prove hanno incluso il controllo(mock),ovveropiantemantenutenellestessecondizioni,manebulizzateconlasoluzioneprivadi sporefungineperanalizzareillivellodiespressionebasaledeigeniinassenzadiinfezione. Le infezioni sono state svolte in 4 repliche e dopo verifica della qualità dell’RNA, sono stati analizzate 3 replichebiologichetramiteibridazioneconchipAffymetrix.Idatidiespressioneottenutisonostatisottoposti ad analisi statistica di significatività e multiple testing(FDR)per eliminare falsi positivi, tramite ilpacchetto software LIMMA di R (Bioconductor). L’analisi globale delle differenze tra le diverse interazioni è stata ʹ͵ effettuata tramite raggruppamento delle componenti similari o Hierarchical Clustering Analysis e Principal ComponentAnalysis(PCA).Sonostateottenutelelistedigenidifferenzialmenteespressiconunvaloresoglia disignificativitàstatisticapariadunrapportotrainfettato/controllomaggioredi+2(induzioneminimadi2 volterispettoalcontrollo)ominorediͲ2(repressioneminimadi2volte)eunvaloredisignificativitàstatistica (pͲvalue)di0.05.Talilistesonostateanalizzateperidentificareilnumerodigenispecificiperciascunasingola interazione. Il software MAPMAN è stato utilizzato per visualizzare le vie metaboliche attivate nel riso in rispostaai4ceppidibrusoneanalizzati.L’analisicomparativadeglielementiincomunetratuttiidatiottenuti dalle4interazioniometaͲanalisidelleliste,condottaconilpacchettosoftwareMAMAdiR,hapermessodi identificaredeigenicomuniedidedurrequalisianoglielementichiavedellarispostadelrisoaM.oryzae. Risultatiottenuti EfficaciadellesaponinediMedicagospp.neiconfrontidell’agentedelbrusonedelriso Le analisi preliminari di fingerprinting degli ceppi isolati di M. oryzae hanno evidenziato che 14 dei 25 SSR selezionati da precedenti studi risultavano polimorfici negli isolati della collezione in esame (Tabella 1). Gli altri 11, utili nell’analisi di isolati provenienti da altre regioni dell’Europa e del mondo, sono risultati monomorficie,quindi,noninformativiperdistinguereiceppidibrusoneprovenientidall’arealelombardo. Tabella1.Elencodeimicrosatelliti(SSR)polimorficiperlostudiodegliisolatidiM.oryzaeinesame. Conseguentementequesti14SSRsonostatiutilizzatiperanalizzaregliisolatilombardipiù5rappresentatidei principalilineagesdellabiodiversitàeuropeadiM.oryzae(IT10perlineageE1,IT02perE2,HN1perE3,SP06 per E4, IT03 per E5), per verificare l’appartenenza degli isolati dell’areale lombardo ai principali lineages europei,inaccordoconRoumenetal.(1997). L’analisi tramite Neighbor Joining delle distanze genetiche ottenute dai profili SSR, ha mostrato che la collezionesisuddividein5gruppiprincipali(A,B,C,D,E)echeesistonoalcuniisolatitotalmentedivergenti daglialtri(Figura2). ʹͶ Figura2.Alberodelladiversitàgeneticasenzaradice(formatocircolare)ottenutotramiteanalisiNJ(weighted analysis) delle distanze genetiche (Darwin 5.0) dei ceppi di M. oryzae (isolati lombardi) e ceppi E1ͲE5 rappresentativideiprincipalilineageseuropei(inrossoconfrecce). OsservandolaFig.2sinotachelacollezionediM.oryzaeinesamecondividesimilaritàgeneticaconilineages E1ͲE2(gruppoE),E4ͲE5(gruppoC),mentreilceppodiriferimentoHN01dellineageunghereseE3divergedai gruppiprincipali,cosìcomeprecedentementeosservatoinRoumenetal.(1997).E’diparticolareinteresse sottolineare che i gruppi A, B e D non includono nessun ceppo di riferimento, suggerendo l’esistenza di cluster che potrebbero rappresentare nuovi aplotipi di M. oryzae, caratteristici dell’areale lombardo. Probabilmente questi isolati hanno subìto una pressione selettiva ad opera di diversi fattori ambientali e rappresentano,quindi,interessanticandidatiperidentificareeventualivariantie/ocoͲevoluzionetragenidi avirulenza/resistenza. In base ai risultati delle analisi di diversità genetica è stata scelta una serie di isolati rappresentativideigruppiprincipali,dautilizzarenelleprovediefficaciadellesaponine. Questiceppisonostatiulteriormenteanalizzatiperverificareeventualidifferenzenellorolivellodivirulenza. TramiteinfezionedigenotipiadifferentespettrodisuscettibilitàaM.oryzae,èstatoosservatochei2isolati appartenenti ai gruppi EͲC mostravano un profilo di aggressività simile tra loro e coerente con il fenotipo atteso,mentreglialtri3risultavanodecisamentepiùvirulenti,infettandoinmodomoltograveanchequei genotipi generalmente considerati mediamente suscettibili o che mostrano solo limitate lesioni con ceppi menovirulenti.E’ipotizzabilechequestiisolatiabbianoacquisitonuovisistemidiattaccoogenidiavirulenza, che non presentano corrispondenti geni di resistenza nelle varietà in esame, tipiche rappresentanti del germoplasmadirisoitalianoe,quindi,lombardo.Diconseguenza,èstatoconclusochelamisceladegliisolati selezionatirisultavaidoneaperisuccessivitestinplanta,perchénonsolorappresentavaladiversitàgenetica dellacollezione,mapresentavaundiversificatospettrodivirulenza. I primi risultati dei test in vitro utilizzando singole saponine purificate e testate contro diversi isolati di M. oryzae hanno messo in evidenza una relazione strutturaͲattività: infatti, l’azione di biocontrollo è risultata maggiore per le saponine monodesmosidiche, che contengono cioè una sola catena glicosidica nella ʹͷ molecola, rispetto alle saponine bidesmosidiche, che invece ne contengono due. Sulla base di queste evidenze sperimentali si è provveduto a preparare una miscela di saponine la cui composizione fosse esclusivamentedicompostimonodesmosidici,medianteidrolisibasicaselettivadigruppifunzionali.L’attività biologicaditalemisceladisaponinemonodesmosidicheèstata,quindi,utilizzataperisuccessiviesperimenti inplanta. Precedenti ai test in planta, sono state le prove di solubilità delle saponine in etanolo e DMSO (solventi comunementeutilizzatiperscioglierequestemolecole)adiverseconcentrazioni,oppureinsoluzioneacquosa conl’addizionedigelatina,perdefiniremetodicheeprocedurediapplicazionegiàadattabiliaduneventuale utilizzoincampo,evitandol’usodisostanzedannoseperl’ambienteechepotesserointerferireconlavitalità delle spore di brusone. E’ risultato che le saponine sono facilmente solubilizzabili in soluzioni acquose contenenti gelatina (la stessa utilizzata per le infezioni con gli isolati di M. oryzae), previo riscaldamento. Questorisultatoèdigranderilevanzaperl’applicabilitàdellametodicaincondizionidicampo,perchéetanolo eDMSOsarebberoincompatibiliconunloroutilizzoediffusionenell’ambiente. PerleproveinplantaèstatomodificatoilprotocollodifenotipizzazioneBLASTESTpereffettuareunastima quantitativa degli effettidelle saponine.Dopo7giorni dall’infezione si osservano i sintomi fogliari secondo unascaladiincidenza/severitàdellamalattiachevada1(assenzadellamalattia)a5(graveincidenza),come mostratoinFigura3.Dalle5categoriediincidenzadellamalattiaèconseguentementeestrapolataevalutata l’efficaciadeltrattamentodellesaponinechevienedescrittacon3principaliclassi/livellidiprotezionevisibile dai sintomi sulla pianta: PͲ pianta protetta che include le categorie di sintomi 1 e 2, in NPͲ pianta non protetta per i sintomi 4 e 5, mentre la classe MPͲ pianta mediamente protetta equivale ai sintomi della categoria3.Talevisualizzazionepermettedidescriverepiùefficacementeechiaramenteirisultati. Figura3.Scaladiincidenzadellamalattia(da1a5)riconducibileaisintomifogliariosservabiliaseguitodi infezione con M. oryzae (sopra) e delle corrispondenti classi di protezione della pianta a seguito del trattamentoconsaponine(sotto),estrapolateinfunzionedellaseveritàdellamalattia. In queste prove, la valutazione degli effetti è stata effettuata sia tramite catalogazione della severità della malattiapertipologiadisintomidellasecondafogliasintomatica(secondolaprecedentescaladeisintomi)sia mediantecontadiciascunadiesse(piantaperpianta)nellerispettive5categorie.Diconseguenza,larisposta ʹ della pianta alle diverse applicazioni è riportata come valore medio del numero di foglie sintomatiche appartenentiaciascunacategorianelle3repliche.Ivaloridituttelecondizioni(trattamento/repliche)sono stati analizzati tramite analisi della varianza per valutare la robustezza dei risultati ottenuti, scegliendo un valoredipͲvalueminoredi0,001comesogliaminimadisignificativitàstatistica. Idatiottenutiinplantahannoindicatochel’applicazionedellesaponinecomportaunanettariduzionedella severitàdellamalattiareferibilealleclassi4e5eunacertavariabilitàdeisintomiriferibilialleclassi2e3(Fig. 4A).Uneffettosimileèosservabileconl’applicazionedelformulatodiflutriafol,mainmisuradigranlunga inferiore(Fig.4B)rispettoaquantoosservatodopoapplicazionedellesaponine. Figura 4. Percentuali (%) di foglie appartenenti alle classi di protezione P (protetta), MP (mediamente protetta), NP (non protetta) sul totale delle foglie analizzate a seguito dell’applicazione in condizioni controllatedisaponine(A)edelformulatodiflutriafol(B)inpre/postͲinfezionesulgenotipodirisoMaratelli altamentesuscettibile(valorimedidi3replichebiologiche). L’analisi ANOVA ha indicato che i due diversi trattamenti (fungicida e saponine) risultano altamente significativi(pͲvalue<0,001)rispettoalcontrollo(piantanontrattata).Iltrattamentoconlesaponinerisulta significativamente più efficace (pͲvalue<0,001), quando applicato in preͲinfezione piuttosto che in postͲ infezione (a/b in Fig. 4A), per un incremento netto anche della percentuale di foglie afferenti alla classe protetta(P),mentreilfungicidanonmostradifferenzesignificativetrapreͲepostͲinfezione(cinFig.4B). LasuccessivaprovasuigenotipiBaldoeSeleniohaevidenziatounrisultatoancorapiùincoraggiante(Fig.5): conBaldolariduzionedellapercentualedifoglieafferentiallecategoriediseverità4e5èmaggiorediquella osservataconMaratellieaddiritturadrasticaconSelenio.Inoltre,lefogliesenzasintomioconsintomilimitati aumenta fino a prevalere in Baldo ed essere dominante in Selenio. Appare, quindi, evidente che l’applicazionedellesaponinehauneffettodiprotezionedall’infezionediM.oryzaeneiconfrontidientrambii genotipi,connettevariazioniosservabiliinfunzionedellaresistenzadellavarietàconsiderata.Risultaaltresì confermato che il trattamento è più efficace in condizioni di preͲinfezione, con un maggior aumento della classePrispettoaquantoosservatoinpostͲinfezionesiainBaldocheinSelenio. ʹ Figura5.Percentuali(%)difoglieappartenentialleclassidiprotezioneP(protetta),MP(mediamenteprotetta), NP (non protetta) sul totale delle foglie analizzate a seguito dell’applicazione in condizioni controllate di saponineinpre/postͲinfezionesulgenotipodirisoBaldo,mediamentesuscettibile,eSelenio,resistente(valori medidi3replichebiologiche). EffettidellasoluzioneVerdevivasull’agentedelbrusonedelriso UnprimoBLASTESTpreliminarecondottosuMaratelliinparalleloconilformulatodelflutriafolhaverificato solounleggeroaumentodellaclasseMPmediamenteprotetta,rispettoalcontrollo(piantanontrattata).Siè osservata un maggiore effetto del Verdeviva quando applicato in postͲ rispetto al preͲinfezione, sempre a favore della classe MP, simile a quanto osservato con l’applicazione del formulato del flutriafol (dati non riportati in grafico). La successiva prova in postͲinfezione con i genotipi Baldo e Selenio ha evidenziato un effettodiprotezionemaggioreneiconfrontidientrambiigenotipi.Insintesi,l’efficaciadelVerdevivarisulta decisamentepiùrilevanteconSelenio(Fig.6);l’effettoadditivodelledueapplicazionesuccessive(24e72ore postͲinfezione), in accordo con una potenziale azione biostimolante del Verdeviva, è confermato e decisamentepiùmarcatonelBaldo,mentreinfluisceinmisuraminorenelSelenio.Sonovisibililievivariazioni degli effetti in funzione della tempistica di applicazione (24 o 72) nel Selenio. Ai tre i tempi e per i due genotipiladifferenzatrattatoecontrolloèstatisticamentesignificativaconvaloridipͲvalueminoridi0,001. Figura 6. Percentuali (%) di foglie appartenenti alle classi P (protetta), MP (mediamente protetta), NP (non protetta)sultotaledellefoglieanalizzateaseguitodell’applicazionedellasoluzioneVerdeviva24,72e24+72 ore postͲinfezione in condizioni controllate sul genotipo di riso Baldo, mediamente suscettibile, e Selenio, resistente(valorimedidi3replichebiologiche). ʹͺ RicercadeigenichiavecoinvoltinellarispostadidifesadelrisoaM.oryzae Una prima analisi preliminare dei Geni Differenzialmente Espressi (Differential Expressed Genes Ͳ DEG), ovveroindottiorepressiequindicoinvoltinellarispostadelrisoall’attaccodei4ceppidiMagnaporthe,ha rivelatoconsiderevolidifferenzetraleduetempisticheanalizzate(12e24orepostͲinfezione)etraiceppi ospite e non ospite. A 12 ore postͲinfezione (hpi), si nota una massiva risposta del riso in tutte e 4 le interazioni(Fig.7A);lepianteinfettateconFR13presentanoilmaggiornumerodigeniindotti(1012),quelle conBR29ilminore(616).ComeevidenziatodaidiagrammidiVenn(Fig.7B),unafrazioneconsistentedeigeni indottisonocomunialle4interazioni(32%perFR13,41%perBR32eCL367e53%perBR29),mentreuna differenziazioneèosservabilealivellodeigenirepressitraiceppidiM.oryzaeBR32,CL367eFR13rispettoal ceppoM.griseaBR29:quest’ultimo,infatti,condivideil65%deiproprigenirepressiconi3M.oryzae,mentre in questi ultimi la percentuale di geni repressi condivisi varia tra l’11 e il 15%. A 12 ore esiste, quindi, una potenziale distinzione della risposta del riso al ceppo incapace di infettare il riso rispetto ai tre ceppi potenzialmentepatogeni. A B Figura 7. Diagramma a barre (A) e diVenn (B)del numero di geni differenzialmente espressi durante le interazionitrarisoeiceppiM.oryzaeFR13(virulento),CL3.6.7eBR32(avirulenti)eM.griseaBR29(nonͲ ospite)a12e24orepostͲinoculo. A 24 ore postͲinfezione il profilo di espressione delle 4 interazioni si differenzia drasticamente, sia perché nellepianteinfettateconi2ceppiavirulentiilnumerodigenidirisoindottisiriducenettamente,siaperché nell’interazione con FR13 il riso aumenta enormemente la repressione genica (Fig. 7A). Inoltre, i DEG in comunedurantele4interazionisonoridottiapercentualimoltobasseperigeniindotti(4%perFR13,23% per BR32, 17% per CL367 e 13% per BR29) e praticamente nulle per quelli repressi (Fig. 7B). L’analisi di raggruppamento(hierarchicalclusteringanalysis)chepermettedievidenziaretralorosimilaritàedifferenze nei profili di espressione globali, ovvero di tutti i DEG che sono indotti/repressi in modo statisticamente significativo (pͲvalue <0,05 FDR), ha confermato che i profili di riso a 12 ore post infezione sono simili a seguitodiinterazioneconiceppipotenzialmentepatogeni(Fig.8A),mentreilprofilodiespressionedelrisoa seguitodiinfezioneconBR29siseparadaglialtricampioni. ʹͻ Ciò potrebbe essere legato, soprattutto ai due gruppi di geni (riquadri gialli in Fig. 8A) che mostrano una regolazioneoppostaaseguitodell’interazioneconilceppononinfettivoBR29,rispettoalleinterazionicongli altriceppidiM.oryzae.Taligenipotrebberocorrispondereagenichiavecoinvoltinellarispostaapatogeno nonspecificodelriso. A B Figura 8. Hierarchical clustering analysis a 12 (A) e 24 (B) ore postͲinfezione del numero di geni differenzialmente espressi (pͲvalue 0.005, FDR) durante le interazioni tra riso e i ceppi patogeni M. oryzae FR13(virulento),CL3.6.7eBR32(avirulenti)enonpatogenoM.griseaBR29. A 24 ore, la situazione si differenzia nettamente, infatti il profilo del controllo (mock) e del ceppo non specificodelrisoBR29sonomoltosimilitraloroesiraggruppanovicini(Fig.8Badestra),mentreglialtritre ceppispecificidelrisosonoseparatidaquestiultimieraggruppatitraloroinunasecondaramificazione(Fig. 8Basinistra).Aquestopuntodell’infezione(24ore),però,appareevidenteanchechelarispostadelrisonei confronti dei ceppi avirulenti si distingue anche da quella messa in atto rispetto al ceppo virulento FR13. Un’ulterioreconfermadiquestaosservazioneèstataottenutaattraversol’analisidellecomponentiprincipali oPrincipalComponentAnalysis(PCA),chespiegaleassociazioni/distinzionetragruppididatiinbaseallaloro distribuzionenellospazio.LaPCAdeidatiglobalidiespressionedelrisoa24orepostͲinoculoconi4ceppidi Magnaporthe(Fig.9)indicachelamaggioredifferenzaesistetrailgruppomock/BR29(bluerossoinFig.9)e i 3 ceppi specifici del riso (con il 30,5% della variabilità totale spiegata da questo confronto), quindi, come osservato precedentemente, questi due gruppi di interazioni rappresentano gli estremi nella risposta di resistenzadelrisoaMagnaporthe.InoltreancheladistinzionetraFR13(ingialloinFig.9)eiceppiavirulenti appare chiaralungo unadelle componentiprincipali(PC1),perchéFR13 è totalmenteseparatodagli altri2 ceppi (verdeͲviola in Fig. 9). Queste chiare differenze osservate a 12 e 24 e tra 12 e 24 ore postͲinfezione indicanochelacineticadiespressioneèunastrategiadidifesamessainattodalrisoinrispostaall’attaccodel patogenoeinfunzionedellavirulenzadelceppocheattaccaecercadipenetrarenellafogliadiriso. ͵Ͳ Figura9.PCAdeiprofiliglobalidiespressioneduranteleinterazioniconiceppiM.oryzaeFR13(virulento), CL3.6.7eBR32(avirulenti)eM.griseaBR29(nonpatogeno)a24orepostͲinoculo. Data l’importanza della cinetica temporale nella risposta del riso ai diversi ceppi analizzati, sono state ricercatenellelistedeiDEGdiciascunceppoleprincipaliproteineespresseaciascuntempo(12o24ore),per individuareigenicandidatidimaggioreimportanzadurantelarispostadelrisoadunasingolainterazione.E’ stato osservato che non esistono proteine espresse solo in BR32 o CL367 a 12 e/o 24 ore postͲinfezione, indicando che entrambi gli isolati condividono almeno uno o più vie metaboliche nella risposta di difesa al brusone.Questoèstatoconfermatodalfattoche,traigenicomunementeindottidai2ceppi,sonopresenti alcunidellaviabiosinteticadellefitoalessine(diterpeniaazioneantifungina,noteperlalorofunzionechiave nelladifesadelrisoedialtrepiantecoltivate.PerquantoriguardaFR13eBR29èstatopossibileottenerele listedigenispecificatamenteindottidurantequestedueinterazioni(Tabella2). Tabella 2. Elenco dei geni indotti singolarmente durante l’interazione tra riso e M. grisea BR29 (sopra)oM.oryzaeFR13(sotto)a12e24orepostͲinoculo.Intabellasonoriportatiivaloridiratio epͲvaluecorrispondentiperciascungene. ͵ͳ Questi corrispondono a geni generalmente coinvolti nelle reazioni di percezione dell’infezione fungina, distribuzionedelsegnaleall’internodellacellula(signalling)edirispostaalfungotramiterilasciodiproteine didifesa,odiproteinediresistenzaodicompostiantiͲstressossidativoefattoritrascrizionaliimputatialla regolazionedituttiimeccanismisopraelencati. Dopodiché, per ricostruire le diverse sequenze di reazioni metaboliche attivate dal riso in risposta a Magnaporthe, le liste complete dei geni differenzialmente espressi (DEG) delle 4 interazioni sono state analizzatetramiteilsoftwareMAPMAN,chepermettel’identificazioneelacollocazionedeiDEGall’internodi viebiochimiche/metabolichenoteecaratterizzate.ComesipuòvederedalFigura10,imeccanismimolecolari principalmente coinvolti nella risposta a stress biotico nel riso includono le vie di sintesi di: ormoni (specialmenteauxina, ABA ed etilene), enzimi coinvolti nella modificazione dellaparete cellulare(glucanasi ed enzimi proteolitici), enzimi antiossidanti (perossidasi, glutatione transferasi, ecc.), heat shock proteins (HSP)emetabolitisecondari.Inoltre,unruolomoltorilevantelorivestonoifattoritrascrizionalieigenidel signalling coinvolti nella regolazione e coͲregolazione a diversi livelli dei geni sopracitati. Dal confronto dei profili,appareevidenteche12oredopol’infezione(Fig.10inalto)igenicoinvoltinelsignallinggiocanoun ruolofondamentalenellarispostadelrisoagliisolatidi Magnaporthesiapatogenicheincapacidiinfettare l’ospite e M.oryzae avirulento e virulento, così come i metaboliti secondari e gli enzimi proteolitici. In paralleloancheleHeatShockProtein(HSP),imetabolitisecondarieglienzimiproteoliticisonoleclassiconil maggior numero di geni differenzialmente espressi. A 24 ore dopo l’inoculo (Fig. 10 in basso), questi geni vengonorepressiintutteleinterazioni,trannecheinBR29,indicandocheigenicoinvoltinelsignalling,nella sintesidimetabolitisecondariedellaproteolisi,giocanounruolocrucialeneldeterminareiltipodirisposta delrisoalpatogeno. Dall’osservazione di questi profili metabolici si deduce che le differenze nella risposta di difesa del riso durante le diverse interazioni non sono dovute a specifiche classi di geni e a pathway (perché la maggior partediessisonoincomune),masonodaimputarsiasingoligeniall’internodiquesteclassi/pathwayeal livello di induzione e/o repressione degli stessi. Per poter identificare quali fossero i geni chiave coinvolti nellarispostadelrisoaMagnaportheèstataeffettuataunametaͲanalisi(confrontoincrociato)dituttiidati diespressionediciascunadelle4interazioni,tramiteunsoftwarecheeffettual’analisiglobaledeidaticon diversialgoritmiperrestituireunalistadiDEGcomuni,precisaerobustaperchébasatasucalcolistatisticidi confrontosimultaneoditutteleinterazioni.Questoapprocciohaunacapacitàdianalisimoltoapprofondita, infatti permette di identificare geni di rilievo per le 4 interazioni, altrimenti non riconoscibili dal semplice confrontodelleliste.Inquestomodoèpossibilerecuperarequeigenicherimarrebberoesclusiperchénon esplicitamente coinvolti nel processo di difesa del riso. Contemporaneamente, lo stesso software esclude queigeniDEGchesonoregolatidurantel’interazioneperaltrecause,manonnecessariamenteimplicatinella rispostaaM.oryzae.Permaggiorrobustezzadeirisultati,sonostatiselezionatisoloqueigenicherisultavano essere statisticamente significativi contemporaneamente per 5 test statistici su 6 effettuati. I geni nella tabella 3 corrispondono a candidati chiave che meritano maggiori approfondimenti a livello genomico funzionalepercomprendereimeccanismimolecolarichesottendonolaresistenzadelrisoalM.oryzae. ͵ʹ Figura 10. Profilo MAPMAN delle vie metaboliche coinvolte nella risposta del riso agli isolati patogeni M.oryzaeFR13(virulento),CL3.6.7eBR32(avirulenti)eM.griseaBR29(patogenononspecificodelriso) a12(inalto)e24(inbasso)orepostͲinfezione.Quadratirossi:genirepressi;quadratiblu:geniindotti. ͵͵ Tabella3.ElencoottenutotramiteMETAͲANALISIdeigenicomuniespressidurantel’interazionedelriso con tutti e 4 i ceppi di Magnaporthe testati. In tabella sono riportati i nomi dei geni secondo la nomenclatura dell’ MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/) e sono specificatiivaloridisignificativitàstatisticacomerankratiodiciascungene. Tuttiquestigeniappartengonoallecategoriesopramenzionate,oltrecheallaviametabolicadellafotosintesi, degli aminoacidi, di degradazione delle proteine, indicando che altre classi di geni, precedentemente non caratterizzate, possono intervenire direttamente o indirettamente nel processo di difesa. E’ interessante notarecomeleproteinenonancoracaratterizzateenemmenosegnalate(expressedprotein)rappresentinoil 25%deltotaleepossano,quindi,rivestireunruolorilevantenellaresistenzadelriso.Taligenirappresentano targettotalmentenuoviedineditiperlosviluppopotenzialedimolecoleadazioneprotettiva/biostimolante perilriso.Questaanalisistatisticaoltrechemoltorobustasièdimostratasensibile,avendoidentificatoper unostessogenecoinvoltonellaresistenza,ancheunasuadiversaformadiprocessamentoosplicingform(in giallo nella tabella), un sistema cellulare che serve a modulare finemente la presenza di una proteina in funzionedidiversifattoridipressioneambientale.Irisultatiottenutidurantequestericerchehannoquindi permessodiidentificarenonsoloigenispecificatamenteespressidurantel’interazionedelrisoconBR29ed FR13, ma anche tutti quei candidati comuni che permettono di attivare l’insieme delle risposte innate e programmatedalrisoperdifendersidall’agentedelbrusone.Taligenicorrispondonoagenichiavecoinvolti nella risposta del riso a M. oryzae e ottimi candidati che meritano maggiore approfondimenti per meglio decifrare la complessità dei pathways metabolici, al fine di sviluppare nuove molecole ad azione protettiva/biostimolanteoperguidareiprogrammidimiglioramentogeneticoversolosviluppodivarietàpiù resistenti. ͵Ͷ CARATTERIZZAZIONEMOLECOLAREDELLAVIABIOSINTETICADELLESAPONINE Perquantoriguardalacaratterizzazionemolecolaredellaviabiosinteticadellesaponine,gliobiettivispecifici diquestaattivitàsonostatidiidentificareecaratterizzarefunzionalmentegenicoinvoltinellaviabiosintetica delle saponine in Medicago spp. allo scopo di acquisire strumenti molecolari di assistenza alla selezione e fornirelebasiperunaeventualesintesidispecifichesaponineinvitro(es.lievitigeneticamentemodificati). Inoltre, si mirava a costituire materiali genetici di Medicago con contenuti e composizioni specifiche di saponinedautilizzareperlacostituzionedivarietàadupliceattitudine:produzionediforaggioeproduzione di specifici metaboliti secondari. Per quanto riguarda lo studio della via biosintetica, le analisi sono state focalizzate sullo studio della variabilità genica dei geni chiave coinvolti nella biosintesi delle sapogenine, la parteagliconicadellesaponinetramiteanalisiTILLINGdellacollezionediM.truncatulapresentepressoCRAͲ FLC(Porcedduetal.,2008).Inparticolare,sonostatiinvestigatiicitocromiP450(CYP450)responsabilidelle reazionidiossidazioneinspecificipuntidelnucleotriterpenicochedalprecursorecomuneɴͲamirinaportano allediversesapogeninepresentinellaspeciemodelloM.truncatulaeinM.sativa.Perilmaterialevegetale sono state utilizzate delle famiglie S2 derivate da ibridazione interspecifica M. sativa x M. arborea (Sativa ArboreaCrossesoSAC)reincrociateperM.sativanondormiente(BinghameHaas,2005),perchélasintesi medianteincrociodispeciediverse,M.sativaeM.arborea,el’utilizzodivarietàfisiologicamentedifferenti (dormienti/nondormienti)all’internodiM.sativaèstatoconsideratounbuonpresuppostoperottenereun ampiagammadivariabilitàperilcontenutoinsaponine/sapogenine. Attivitàsvolte AnalisifunzionaledigenidellaviabiosinteticadellesaponineinMedicagospp. In collaborazione con la Piattaforma Genomica del Parco Tecnologico Padano sono state effettuate sette analisi TILLING della collezione di mutanti di M. truncatula già dimostratasi valida per l’identificazione e l’analisi funzionale del citocromo CYP716A12, responsabile del primo passaggio della biosintesi delle sapogenine emolitiche (Carelli et al., 2011). In questa indagine sono state ricercate mutazioni in cinque CYP450putativamentecoinvoltinellabiosintesidisapogenineeinungeneputativoimplicatonelcontrollo dellaviabiosintetica.Traigeniesaminatisonostatitrovatitremutanti;lelineecorrispondentisonostate allevate e caratterizzate chimicamente presso CRAͲFLC. Un solo mutante ha mostrato un fenotipo del tipo ‘knockͲout’ cioè assenza completa di una specifica sapogenina. Il gene corrispondente è stato clonato e espressoinlievito;lasuaattivitàèstatasaggiatainunsistemadimicrosomidilievitoneiconfrontididiversi substratiperstabilireilsuoruolospecificonellabiosintesidellesapogenine. ͵ͷ Individuazionedimaterialivegetalidiversificatiperlaproduzionedisaponine Il materiale utilizzato deriva da ibridazione interspecifica M. sativa x M. arborea (Sativa Arborea Crosses o SAC) seguita da reincrocio con M. sativa non dormiente cv. Sequel ottenuta da E.T. Bingham (Bingham e Haas,2005).PressoCRAͲFLCsonostateeffettuateduegenerazionidiselfing(S2)chehannoavutoloscopodi suddividereilpooldigeniinizialeindiversefamiglieeindividuientrofamiglia;durantequestafaseèstata mantenutalavariabilitàpresentenegliibridioriginaliperilcontenutoelacomposizionedellesaponinedelle foglie.Infine,diecifamiglieSACS2(278piantetotali)eilparentaleM.sativaMBxS(5pianteS2totali)sono state allevate per due anni in parcelle tubolari 80 x 8 cm (densità equivalente a 200 piante.mͲ2) all’interno dellequalièinseritountubodidiametro5cm,forato,cheospitalapianta(Fig.11).Ilcolorevariegatodei fiori,segregantenellefamiglieSAC,èunmarcatoredell’ibridazionetraM.sativa(fiorevioletto/azzurro)eM. arborea (fiore giallo). Nel 2° anno di prova (2011) e in corrispondenza del 3° taglio (luglio) le foglie di 62 piante rappresentanti le 10 famiglie SAC e il parentale M. sativa sono state prelevate per l’analisi delle sapogenine.Lostessoèstatofattoperleradicisecondariesviluppatesinell’intercapedinetraiduetubi,dopo prelievo dei tubercoli N2Ͳfissatori. Le sapogenine sono state identificate e quantificate mediante analisi gascromatografica(GCͲMSeGCͲFID)(Tavaetal.,1993;TavaePecetti,1998). Le stesse 62 piante analizzate per il contenuto/composizione in sapogenine sono state esaminate, per la variazione di sequenza (variabilità allelica) del gene codificante il citocromo CYP716A12, responsabile del primopassaggiodellabiosintesidellesapogenineemolitiche(Carellietal.,2011).Sulcampionedi62piante dellefamiglieSACS2èstatoestrattol’RNAtotaledafoglieeradicieusatoperesaminare,medianteanalisi quantitativa RealͲTime PCR, il pattern di espressione di CYP716A12 e di altri tre CYP450 putativamente coinvolti nella biosintesi delle sapogenine. Questi ultimi erano, contemporaneamente, oggetto dell’analisi TILLINGdellacollezionedimutantidiM.truncatula. Figura11.SACS2allevateinparcelletubolari;particolaridelcoloredeifiori. ͵ Risultatiottenuti AnalisifunzionaledigenidellaviabiosinteticadellesaponineinMedicagospp. Lalineamutante‘knockͲout’diM.truncatulaindividuatamediantel’analisiTILLINGhamostratounevidente riarrangiamento del profilo delle sapogenine, con la presenza di composti diversi rispetto al controllo (Fig. 12).E’interessantenotarechenonostanteilradicalecambiamentodicomposizionedellesapogeninenelle piantemutanti,lepiantestessesonorisultatefisiologicamentesimilialcontrollosiaperlacrescitacheperla capacità riproduttiva. L’analisi funzionale del gene è stata effettuata in vitro in un sistema di microsomi di lievitoesièpotutoassegnareunaprecisafunzionealgenenellaviabiosinteticadellesapogenine.Lelinee mutanti individuate per gli altri due CYP450 non sono risultate del tipo ‘knockͲout’: tutte le sapogenine presentinelcontrollosonostateritrovateancheneimutanti. Figura12.Gascromatogrammidellesapogenineestrattedafoglieeradicidellepiantemutanti(linearossa)e controllo(lineanera).Lefrecceindicanoipicchiaggiuntivipresentinelmutanterispettoalcontrollo. Individuazionedimaterialivegetalidiversificatiperlaproduzionedisaponine Le 10 famiglie SAC S2 hanno mostrato una significativa differenza per il contenuto e la composizione delle sapogenine, dovuta principalmente alla variazione delle sapogenine emolitiche nelle foglie (Fig. 13). La composizionedellafrazioneemoliticafogliareèrisultatavariabilesoprattuttoinrelazioneaiduecomponenti principali,l’acidomedicagenicoel’acidozanico:ilprimohapresentatouncontenutomassimo(12,31mg/g s.s.fogliare)nellafamiglia94.111eunminimo(0,59mg/g)nellafamiglia29.010;ilcontenutodelsecondoè oscillato da 7,18 mg/g (famiglia 120.165)a 0,96 mg/g (famiglia 29.010) (Fig. 11). L’acido medicagenico e le saponinedaessoderivatehannotralepiùalteattivitàbiologicheedibiocontrollo(TavaeAvato,2006).E’ evidentedunquel’interesseacostituirematerialivegetaliadaltocontenutodiquestospecificocomposto:la famiglia94.111,adesempio,hapresentatolivellidiacidomedicagenicocircadoppirispettoaivalorimassimi riportati in letteratura per erba medica. Il contenuto di acido medicagenico fogliare è risultato inoltre altamente conservato tra generazioni diverse della famiglie SAC, indicando l’elevata ereditabilità di questo carattere. ͵ Mediante incroci tra ed entro famiglia fra individui con contenuti simili di specifiche sapogenine da foglie, sono stati prodotti une serie di ibridi semplici. Tali ibridi, moltiplicati per alcune generazioni, costituiranno delle sintetiche geneticamente in equilibrio, e dunque continuamente riproducibili, caratterizzate da una produzionestabiledilivellispecifici(elevati/ridotti)diacidomedicagenico. Foglie 18 Spg emolitiche 14 14 12 12 10 8 Spg non emolitiche 16 m g /g s .s . m g /g s .s . 16 Spg emolitiche Radici 18 Spg non emolitiche 10 8 6 6 4 4 2 2 0 0 M BxS SAC S2 1 2 0 .1 6 8 1 2 0 .1 6 5 1 0 0 .1 5 7 1 0 0 .1 5 6 9 4 .1 1 1 8 5 .0 8 8 8 5 .0 8 2 2 9 .0 1 0 6 .0 0 2 6 .0 0 1 M BxS SAC S2 1 2 0 .1 6 8 1 2 0 .1 6 5 1 0 0 .1 5 7 1 0 0 .1 5 6 9 4 .1 1 1 8 5 .0 8 8 8 5 .0 8 2 2 9 .0 1 0 6 .0 0 2 6 .0 0 1 Figura13.Contenutoinsapogenineemoliticheenonemoliticheinfoglieeradicidelle10famiglieSACedel parentaleM.sativaMBxS(generazioneS2).SACS2:mediadelle10famiglieSAC. La variazione del contenuto/composizione delle sapogenine emolitiche nelle radici è risultata inferiore rispetto a quella delle foglie (Fig. 14). Inoltre, non è stata trovata alcuna correlazione per il contenuto di sapogeninetrafoglieeradici;idueorganisicomportanodunquecomecompartiindipendentiperlasintesie il controllo delle sapogenine emolitiche. Questo risultato è interessante sia dal punto di vista delle conoscenzesullabiologiadellapiantasiaperisuoirisvoltiapplicativi;poichéinfattilesaponinesonoparte deimeccanismidirispostadellapiantaadinfezionifungine,laradice,dacuidipendelacapacitàdiriprodurre foglie e steli dopo ogni taglio (ricaccio) e in ultima analisi la sopravvivenza della pianta, ha un livello di protezioneelevatoanchequandolesapogeninedellaparteaereasonoridotte(es.famiglia29.010,Fig.14). 16 Foglie 16 med zan 14 hed Radici med 14 zan soyaA 12 soyaB m g /g s .s . m g /g s.s. 10 8 6 12 soyaA 10 soyaB 8 6 4 4 2 2 0 0 29.01 94.111 100.157 Famiglie SAC S2 120.165 29.010 94.111 100.157 120.165 Famiglie SAC S2 Figura 14. Contenuto delle principali sapogenine in quattro famiglie SAC S2: sapogenine emolitiche (ederagenina,acidomedicagenicoeacidozanico)enonemolitiche(soiasapogenoloAeB). ͵ͺ Le sapogenine non emolitiche, pur essendo anch’esse coinvolte nella risposta della pianta a stress biotici, hannomostratounaridottavariabilitàsianellefogliechenelleradici.Nonèchiaroqualisianoleragionidi una differenza così evidente nella variabilità delle due frazioni; si può tuttavia osservare che il principale componente delle saponine non emolitiche, il soiasapogenolo B, è presente in tutto il genere Medicago e diffusoinaltreleguminose(es.trifogli,pisello,fagiolo,soia),suggerendounaorigineevolutivapiùanticadella viabiosinteticadellesapogeninenonemoliticherispettoaquelladelleemolitiche. L’insiemediquestirisultatisottolinealagrandecomplessitàsottostantealterminecomune‘saponine’:una complessità chimica, derivante dalla diversità delle strutture molecolari; una diversità biochimica e molecolare, derivante dall’esistenza di vie biosintetiche specifiche per le due frazioni emolitica e non emolitica;unadiversitàdidistribuzione,edunquedisintesiedicontrollo,all’internodellapianta. A quali meccanismi si può ricondurre la variabilità trovata nelle famiglie SAC per il contenuto e la composizionedellesapogenineeinparticolareperlafrazioneemolitica?Percercareunarispostaaquesta domandaabbiamoesaminatolapossibilitàdiunavariazionedisequenza(variazioneallelica)nelcitocromo CYP716A12,genechiavenellabiosintesidiquestafrazione.UngeneortologoaCYP716A12diM.truncatula èstatoindividuatoinM.sativa:ilgenehamostratoil97%diidentitàelastessastrutturaesoni/intronidiMt CYP716A12.Oltrealle62pianteS2sonostateanalizzatelesequenzediM.arboreaediM.sativacv.Sequel; lesequenzediduegenotipidiM.truncatula,depositatenellabancadatiinternazionaledellesequenze,sono stateintrodottecomeriferimento.Frale62pianteS2sonostatiindividuati7polimorfisminucleotidici(Single Nucleotide Polymorphism o SNP) di cui solo uno nella sequenza codificante. La sequenza dell’ enzima è altamente conservata in SAC, M. sativa e M. truncatula (100% di identità); M. arborea presenta il 96% di identitàconilgruppoprecedente,manessunoSNPresponsabiledeicambiamentidiaminoacidiètrasmesso al materiale SAC. In conclusione, la sequenza di CYP716A12 in SAC deriva principalmente da M. sativa e produce una proteina uguale in tutte le piante esaminate: difficilmente dunque può essere alla base della variabilitàtrovataperilcontenutoinsapogenineemolitiche. AbbiamoquindiesaminatoilivellidiespressionediquattroCYP450nellefamiglieSACS2nell’ipotesichealla base della variabilità trovata per il contenuto in sapogenine ci potesse essere un diverso controllo dei meccanismi di traduzione dal gene alla proteina. Il parentale M. sativa MBxS è stato utilizzato come riferimento per il calcolo dell’espressione nelle famiglie SAC. Oltre a CYP716A12 sono stati scelti altri tre CYP450putativamentecoinvoltinellabiosintesidellesapogenine.Lamaggiorpartediquestigenihamostrato unavariazionesignificativadiespressione,positivaonegativa,rispettoalparentaleM.sativasianellefoglie chenelleradici,malavariazionetrafamiglienellefoglieèrisultatanonsignificativa,ancheperlanotevole variabilitàdellepianteindividualientrofamiglia.Inconclusione,un’alterazionesignificativadelcontrollodei CYP450esaminatirispettoalparentaleM.sativaèpresenteinSAC,manonsistrutturainunadifferenzatra famiglie come avviene per il contenuto di sapogenine emolitiche. L’insieme di questi dati suggerisce che il controllo della via biosintetica delle sapogenine sia principalmente del tipo postͲtraduzionale o postͲ trascrizionale,aventecioècomeoggettol’RNAmessaggeroolaproteina. ͵ͻ Ricaduteoperative Lamessaapuntodimezzidibiocontrollodelbrusonedaapplicareincondizionidicamponellerisaiedella Lombardia è sicuramente di interesse attuale sia per i significativi benefici produttivi, che per gli effetti positivi a livello ambientale, con la riduzione dei danni a medio e lungo termine causati dall’utilizzo di fungicididisintesielapreservazionedell’ecosistemarisaia. Gliaspettiinnovativi“teorici”delleattivitàdelprogettosonolaricercadiunasoluzionedidifesacompatibile neiconfrontidiM.oryzaedelriso,attraversol’utilizzodimolecolederivatenondasintesichimica,maisolate dapianteeinparticolaredaspeciecoltivatenellestessezonerisicole,comenelcasodellesaponinedierba medicaodallostessoriso,comenelcasodeicomposticoinvoltineimeccanismididifesaalpatogeno.E’stato dimostrato che, in condizioni sperimentali, specifiche componenti delle saponine di erba medica, in particolareappartenentiallafrazioneemolitica,sonoefficacinelcontenimentodeidannidovutianematodi sudiversiospiti(D’Addabboetal.,2011).DuranteilprogettoBIOGESTECAlesaponinehannomostratouna notevoleefficacianeiconfrontidiM.oryzae,suggerendounpossibileutilizzoditalimolecolesuvastascala, previavalutazionedelleloroproprietàtossicologicheneiconfrontidellecomponentibioticheambientaliedel loro comportamento nelle matrici acqua e suolo come richiesto dalle vigenti normative in materia di autorizzazione dei prodotti fitosanitari (Regolamento CE 1107/2009). Le saponine, una volta autorizzate, potrebbero essere impiegate nell’ambito di strategie di Protezione Integrata del riso. L’applicazione delle saponine, però, implicherebbe la necessità di una produzione massiva di queste sostanze; conseguentemente, sono stati affrontati diversi aspetti relativi all’incremento della loro sintesi in piante di erba medica. Sono stati ottenuti materiali vegetali derivati da ibridazione interspecifica M. sativa x M. arborea che hanno mostrato una variabilità per il contenuto di sapogenine emolitiche più ampia di quella finora evidenziata in M. sativa e, in particolare, un contenuto più elevato di acido medicagenico, uno dei compostiapiùaltaattivitàbiologica.Questimaterialisonolabasepercostituirepopolazionicheproducano stabilmentelivellideterminatidispecifichecomponentidellesaponinee,inparticolare,diquelleapiùalta attività di biocontrollo. Materiali di questo tipo possono essere utilizzati dall’industria per l’estrazione dei composti di interesse o direttamente in azienda, in particolare nel settore biologico, per il controllo di parassiti del suolo e delle colture. Mediante l’analisi di una collezione di mutanti sono stati conseguiti significativi avanzamenti nella conoscenza della via biosintetica delle sapogenine emolitiche, con l’individuazionediunnuovogeneelasuacaratterizzazionefunzionale.Inoltre,questeconoscenzemolecolari costituisconolabaseperl’individuazionedimarcatorimolecolari(es.SNP)cheaiutinolasceltadellepiante individuali,diminuendotempiecosti(analisichimiche)deiprogrammidiselezioneeperiltrasferimentodella via biosintetica o di parte di essa in sistemi diversi dalla pianta (es. lieviti geneticamente modificati) per la produzioneinbioreattoridiquestesostanze. Inoltre, nell’ambito del progetto BIOGESTECA è stato verificato che anche la soluzione Verdeviva potrebbe essereun’utilemezzochepotrebbecontribuirealcontrollodelbrusonedelriso,perchéafrontediunaminor efficacia, presenta una elevata compatibilità ambientale, che ne permetterebbe diverse applicazioni senza effetticollateraliindesiderati. ͶͲ DatalapotenzialeattivitàbiostimolantedelVerdeviva,inlineaconunastrategiediProtezioneIntegratadel riso, sarebbeauspicabile un suo utilizzo ad integrazione delle stesse saponine, per aumentare le difese del risoefarfronteaepisodioaumentidisuscettibilità,incoincidenzadicondizioniambientalinonordinarieo particolarmentefavorevoliallosviluppodelfungo. Sempreinun’otticadiDifesaIntegratarientranolericerchedeigenichiaveimplicatinellarispostadidifesa delrisoaM.oryzae.ConlericerchesviluppatenelcorsodelprogettoBIOGESTECAsièpotutodecifrarecheè fondamentale l’aspetto della tempistica della risposta del riso all’attacco del fungo, sia esso specifico della specie o meno, e che quindi le classi di geni coinvolte nel signalling e nella regolazione fine degli eventi metabolicisuccessiviall’infezionesonoitargetdimaggioreinteresseperlosviluppodimolecoleadazione protettivasenonaddiritturabiostimolantedelledifesestessedellapianta.Parimenti,sonostatiidentificati alcunigenicoinvoltinellasintesidimetabolitisecondariedellaproteolisichegiocanounruolocrucialenel determinare un fenotipo resistente della pianta; l’identificazione di questi geni apre la vie alla ricerca di nuovestrategiee/omolecoledautilizzarenelladelrisoneiconfrontidiM.oryzae.L’insiemeol’usoalternato di queste soluzioni di biocontrollo rappresentano il vero strumento per rendere sostenibile, competitiva e vantaggiosalaproduzionedelrisopertuttalafilierarisicolalombarda. Conclusioni • L’utilizzo di miscele di saponine opportunamente trattate è una soluzione promettente per la difesa biologicaneiconfrontidell’agentedelbrusonedelrisoconefficaciaparagonabileaquelladeifungicididi sintesi. Qualora venissero autorizzate, è possibile ipotizzare un uso di queste sostanze in ambito agroͲ industriale. • L’utilizzo di saponine è auspicabile anche in un’ottica di ecosostenibilità globale, perché risponde alle esigenzediridottoconsumodellerisorseambientalidisponibili. • L’utilizzodisaponinerispondeanchealleesigenzediunarisicolturacherispondealleavversitàbiotiche (quindiancheaM.oryzae)conunapprocciodiDifesaIntegrata,cheprevedeilricorsoadiversistrumenti (miglioramento genetico insieme all’applicazione di saponine e di prodotti biostimolanti) per ottenere un’efficaceprotezionesenzaricadutesull’ambiente. • LasoluzioneVerdevivasièdimostrataunstrumentoalternativoeintegrativoperilcontrollodelbrusone el’innalzamentodelledifeseinnatedelriso. • L’uso della soluzione Verdeviva sarebbe integrabile all’uso delle saponine o altri fungicidi naturali in un’otticadidifesaintegrata. Ͷͳ • Le ricerche sui geni chiave coinvolti nella risposta del riso a M. oryzae hanno aperto la via all’identificazionedeiprodottichepotrebberoindurrelerisposteinnatedellapiantaequindiintegrarsiconle misure di protezione appena citate ben rispondendo al sistema di protezione del riso in chiave di Difesa Integrata. • La sintesi mediante incrocio di specie diverse, M. sativa e M. arborea, e l’utilizzo di varietà fisiologicamentedifferenti(dormienti/nondormienti)all’internodiM.sativasièrivelatounostrumentoutile perampliarelavariabilitàdelcontenutoedellacomposizionedellesapogenineneimaterialiderivati(SAC). • L’utilizzodell’autofecondazioneèstataefficacenelsuddividerelavariazionepresentenegliibridiinizialiin famiglie S2 caratterizzate da differenti profili di sapogenine emolitiche fogliari. L’acido medicagenico, componentedellafrazioneemoliticaeunodeicompostidimaggiorinteresseperlasuaattivitàdiinibitoria neiconfrontidipatogenifungini,èrisultatoaltamenteereditabileedunquegeneticamentestabilizzatonelle famiglieinquestione. • Questi materiali sono attualmente utilizzati in un programma di miglioramento genetico per la costituzione di varietà di erba medica specializzate nella produzione di metaboliti secondari di interesse agrario,agroͲindustrialeeindustriale. • LacollezionedimutantiTILLINGnellaspeciemodelloM.truncatulasièrivelataunostrumentoefficace perl’individuazionedigeniimplicatinellaviabiosinteticadellesapogenine.Leconoscenzeottenutepossono esserefacilmentetrasferiteaM.sativa,specieagronomicamenteedeconomicamentemoltopiùimportante, come visto per tutti i CYP450 studiati nel progetto. In questo modo è possibile creare un circuito molto efficacedicollegamentofraconoscenzedibaseericercaapplicata. 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ͶͶ Maisriccoinantiossidanti:un’opportunitàperilcontenimentodell’usodi agrofarmaci Ipartedell’attività RobertoPilu1,KatiaPetroni2,ElenaCassani1,ChiaraLago2,ValentinaCalvenzani2,MichelaLandoni2, MonicaFornari2,ChiaraTonelli2 1 2 DipartimentodiScienzeAgrarieeAmbientaliProduzione,Territorio,Agroenergia,UNIMI, DipartimentodiBioscienze,UNIMI, IIpartedell’attività AnnamariaVercesi,GemmaAssante,GiovanniVenturini,DaianaSalomoni,SilviaLauraToffolatti,Paola Campia,LalehBabazadeh,EmilioFasoli DipartimentodiScienzeAgrarieeAmbientaliProduzione,Territorio,Agroenergia,UNIMI Introduzioneallatematica IlmaisèunadellepiùimportanticolturedelmondoequantitativamenteèlaprincipaleinItalia:circail10% delprodottoraccoltoentradirettamenteoindirettamentenellacatenaalimentareumana.InItalia,lacoltura è particolarmente intensa nelle regioni settentrionali (Piemonte, Lombardia, Veneto, Friuli Venezia Giulia, EmiliaRomagna)eneicomprensoridipianuradelCentroͲSud,dovemaggiorisonoledisponibilitàidriche.In particolare nella nostra Regione, la coltura del mais interessa una superficie di circa 235mila ettari, occupandoil26%dellasuperficienazionaleinvestitaconquestacoltura.Dallafinedeglianni‘70afine’90,le produzioni sono passate da 50 a 100 quintali per ettaro, permettendo un grande sviluppo del comparto zootecnico nella pianura padana, dove rappresenta di gran lunga la fonte primaria di calorie nell’alimentazione animale, sotto forma di granella, pastone e silomais. Infatti l’utilizzo del mais in Italia è ripartitoall’82%adusozootecnico,12%alleindustrieamidiere,4%aldirettousoumanoeal2%peraltriusi industriali.AlivellodiComunitàEuropealamaggiorpartedelmais“daindustria”vienemacinato“adumido” perlaproduzionediamidoederivati(65Ͳ70%),mentrelarestantequotaèlavorata“asecco”perricavarne prodottivari,qualisemolati,farine,fiocchi,ecc.Conlamacerazione“adumido”,lagranellavienemaceratae trattataconanidridesolforosaefermentilattici.Tuttociòalloscopodifacilitarelasuccessivaestrazionedei granuli di amido. L’acqua di macerazione può essere destinata alla fermentazione oppure, dopo concentrazione, all’industria mangimistica. La granella inumidita subisce una prima macinatura per la separazione del germe, dalla cui lavorazione si ricava l’olio. Dalla lavorazione del mais, oltre a prodotti alimentari,siricavanocarta,bioplasticaesolventiesemprepiùinfuturo,ilmaisverràutilizzatoancheper ottenereenergia.Comericordatoinprecedenzailmais,sottoformadigranella,sfarinatooinsilato(derivante dalla spiga o dalla pianta intera), rappresenta una delle materie prime più utilizzate per l’alimentazione animale. Esso, infatti, è il principale componente della dieta per i suini avicoli e ruminanti. In presenza di Ͷͷ condizioni ambientali favorevoli, il mais può essere infettato, in campo e durante la fase di immagazzinamento, da funghi con conseguente perdita di produzione e deterioramento della qualità della granella a causa dell’accumulo di micotossine. Le micotossine sono metaboliti secondari a basso peso molecolare caratterizzate da tossicità nei confronti dell'uomo e degli animali. Negli areali maidicoli della pianuraPadanaiprincipalifunghitossinogenielecorrispondentimicotossineritrovatinelmaissono: ͲAspergillusLinkeaflatossine. ImicetiafferentialgenereAspergillussisviluppanogeneralmenteacaricodeiresiduicolturalieraramente provocanodannidirilevanteentità.LespeciepiùdiffusesumaisappartengonoallasezioneFlavidelgenere AspergilluseinparticolareallespecieA.flavusLinkeA.parasiticusSpeare(Giornietal.,2007).A.flavusè stato riscontrato più frequentemente in annate caratterizzate da piovosità scarsa e temperature elevate. Lesionidovuteainsetti,uccelliegrandinerendonolapiantapiùsuscettibileaimarciumidaA.flavus.Isintomi sulle spighe infette sono localizzati soprattutto nella parte apicale e sono caratterizzati dallo sviluppo di micelio di colore verdeͲgiallastro che diventa più scuro col passare del tempo. Le colonie fungine che si isolanodalleareesintomatichedellaspigaincolturapuraappaionocomeriportatonellaFig.1. Figura1.ColoniediA.flavussuMEAFigura2.ColoniadiFGCsuPDA Leaflatossine,micotossineprodottedaimicetidellasezioneFlavi,sonostateisolateperlaprimavoltanegli anni '60 del secolo scorso a seguito del decesso nel Regno Unito di migliaia di tacchini a causa di questi composti presenti nella farina di arachidi utilizzata per l'alimentazione dei volatili (Blount, 1961). Tra le 18 aflatossineidentificatefinora,innatural'aflatossinaB1(AFB1)èstatarilevatapiùdifrequenteeinmaggiore quantitànellederratecontaminate.L'Agenziainternazionaleperlaricercasulcancro(IARC)hastabilitoche AFB1 rientra nel Gruppo 1 delle sostanze cancerogene per la sua manifesta capacità di provocare cancro epatico(IARC,1993).L’UnioneEuropea(UE)hastabilitoimassimilivellidicontaminazionedaaflatossine(da 5a10ng/g)nelmaisprimadellalavorazione(CE,RegolamentoNo.165/2010). ͲFusariumgraminearumcladeetricoteceni Il marciume rosso della spiga di mais (GER) è causato da specie afferenti al genere Fusarium Link in particolare al clade F. graminearum (FGC). La specie maggiormente associata a GER nel mais italiano è F. graminearumsensustrictoSchwabementreF.culmorum(W.G.Sm.)Sacc.,F.sporotrichioidesSherb.eF.poae (Peck) Wollenw. sono state isolate meno frequentemente (Logrieco et al., 2002). FGC è favorito da Ͷ temperature pari a 24Ͳ25 °C e da un elevato contenuto di umidità nella granella. GER è favorita da elevati livelli di umidità durante l’emissione delle sete, da temperature moderate e abbondanti precipitazioni durante la maturazione delle cariossidi. FGC infetta l’ospite principalmente attraverso le sete e meno frequentementeattraversolesionidovuteadinsetti(Bakanetal.,2002).Isintomisullaspigasonolocalizzati soprattuttonellaparteapicaledovesisviluppaunmiceliodicolorerosaͲrosso.IceppidiFGCchesiisolanoda spigherecantisintomidimarciumerossoallevatiincolturapuraappaionocomeriportatonellaFig.2. LemicotossinecollegateallaGERsonoprincipalmenteitricoteceniditipoAeB.ItricoteceniAincludonola tossina TͲ2 e HTͲ2, i tricoteceni B sono rappresentati principalmente dal deossinivalenolo (DON) e le sue formeacetilate3ͲAcDONe15ͲAcDON.Itricotecenisonoassociatiasintomidiintossicazioneneglianimaliche vanno da disturbi gastrointestinali all’anoressia (Pestkal e Smolinski, 2005). E’ probabile che i tricoteceni causino i medesimi sintomi sugli umani ma la loro cancerogenicità è tuttora discussa. I livelli massimi di contaminazioneammessiinUEnelmaiseneglialtricerealivannoda200a1750ng/gperitricoteceniB(CE, RegolamentoNo.1126/2007)eda15a100ng/gperitricoteceniA(CE,RaccomandazioneNo.165/2013). ͲGibberellafujikuroicladeefumonisine In Italia settentrionale il marciume rosa della spiga (FER), associato alla presenza di FUM, è causato prevalentemente da specie afferenti al clade G. fujikuroi (GFC) del genere Fusarium. All’interno di GFC il principale agente eziologico di FER è F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg, mentre secondari appaiono F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg e da F. subglutinans (Wollenw. & Reinking) P.E.Nelson,Toussoun&Marasas(Logriecoetal.,2002).F.verticillioidespuòinoltrecolonizzaretuttalapianta dimaissenzadarluogoadalterazioniapparenti.LecondizionifavorevoliaFERsonotemperatureparia27°C (Rossietal.,2009)eperiodisiccitosidurantelefasidiriempimentodellecariossidiseguitidaperiodipiovosi pocoprimadellaraccolta(Munkvold,2003).FERsipresentasucariossididistribuiteinordinesparsooppure ingruppidicariossidispessoricopertedamiceliobiancoͲrosato(Fig.3A).F.verticillioidessvernasuiresiduidi mais della stagione precedente presenti nel suolo e produce un’elevata quantità di spore, sia micro sia macroconidi,facilmentedispersidalventoeprincipaliresponsabilidell’infezione(Fig.3Be3C). A B C Figura3.ColoniadiF.verticillioidessuPDA(A);MacroconididiF.verticillioides(B);Microconidiestrutture conidioforediF.verticillioides(C). Numerose specie di insetti fitofagi tra i quali la piralide del mais (Ostrinia nubilalis Hübner, ECB) possono disperdereiconididiF.verticillioides(Dowd,2003).Ilfungopuòinoltrecontaminareilsemeesvilupparsifino araggiungerelacariosside.L'importanzadellesingolevied'ingressodeiconididiF.verticillioidesnellaspiga Ͷ variadaregionearegionema,insiemeallelesionidainsetti,l’infezioneattraversolesetehaunruolomolto importante nel ciclo infettivo contrariamente alla trasmissione sistemica del fungo all’interno della pianta (Munkvold,2009). Le fumonisine (FUM) comprendono almeno 28 composti che, a differenza di altre micotossine, non hanno strutturaciclicaesonosolubiliinacqua.SololeFUMB,inparticolareleFUMB1 eB2 ,sonostaterinvenute nelle derrate. Le FUM provocano leucoencefalomalacia nei cavalli e nei conigli ed edema polmonare e idrotoraceneisuini.Inaggiuntaèstatosuppostouncollegamentotral’assunzionecontinuativadiFUMeil cancroesofageonell’uomo(Richard,2007). LoIARChaclassificatoleFUMnelgruppo2B,cuiappartengonosostanzeprobabilmentecancerogene(IARC, 2002). I livelli massimi consentiti per le FUM nella granella di mais e nei prodotti derivati nell’UE sono compresitra4000e200ng/g(CE,RegolamentoNo.1126/2007). La presenza di F. verticillioides (Venturini et al., 2011) e il ripetuto accumulo di FUM su mais coltivato in pianura Padana (Torelli et al., 2012) compromettono la possibilità di ottenere granella di elevata qualità e salubrità. Alla data odierna non è ancora stata individuata un’efficace strategia di riduzione della contaminazione da FUM in mais. Alcune pratiche agronomiche come l’anticipo della semina, corrette irrigazioniefertilizzazioniabbinateallariduzionedeidannicausatidainsettipossonocontribuirealimitare l’incidenzadeimarciumidellaspigael’accumulodiFUM(Maioranoetal.,2009).Sumaisnonèattualmente registrato alcun fungicida attivo nei confronti di Fusarium spp., anche se sperimentalmente interventi fungicidiall'emissionedelleseteoamaturazionelatteoͲcerosadellaspiga,incombinazionecontrattamenti antipiralide, hanno garantito una riduzione della FER e della contaminazione da FUM (Folcher et al., 2009; Mazzoni et al., 2011). Lo sviluppo di cultivar di mais meno suscettibili ai funghi tossinogeni potrebbe contribuirearidurrelacontaminazionedamicotossinecomeriportatorecentementepergenotipiingradodi accumularegrandiquantitàdipigmentiflavonoidichepossiedonocapacitàantiossidante. Gliantiossidanticontenutinellespecievegetalidestinatealladietaumanasidividonoincompostinutrienti (comevitaminaCecarotenoidi)enonnutrienti(flavonoidiecompostifenoliciingenere).Essisonoingrado di prevenire il danno cellulare causato dalle specie attive dell’ossigeno e dai radicali liberi che si formano durante il metabolismo aerobico o per effetto di fattori di stress esogeni, grazie alla loro prerogativa di ossidarsifacilmenteediventarecosìbersagliopreferenzialeditalispecieattivedell’ossigeno. Inparticolare,iflavonoidisonocompostichedeterminanoalcunifraglisvariatipigmentidelmondovegetale. Sonomolecoleidrosolubili,chesiritrovanoinformaglicosilataall’internodelvacuolo;sullabasedellaloro struttura chimica, esse vengono raggruppate in diverse classi, di cui le più importanti sono flavanoni, flavonoli,isoflavonoidieantociani.Questicompostipresentanounastrutturadibase,costituitadaunanello a15atomidicarbonio,derivantedaunareazionedicondensazionechecoinvolgefenilalaninaeacetato. Le antocianine rappresentano una classe di metaboliti secondari che vengono sintetizzati esclusivamente nelle piante conferendo il colore rosso ai tessuti dove vengono accumulate oltre ad esplicare diversi altre funzioni fisiologiche (Taylor and Grotewold 2005). Diversi studi indicano che queste molecole possiedono attività antiossidante e che, se assunte nella dieta, possono esplicare importanti effetti salutari su diverse patologieumaneeanimali,qualicancroepatologiecardiache(Hagiwaraetal.2001;Tsudaetal.,2003;Lila Ͷͺ 2004;Guerraetal.2005;TaylorandGrotewold2005;Kay2006;Lalaetal.,2006).Inparticolare,èstato osservatochetopinutriticonvarietàdimaisasemecoloratorisultanomaggiormenteprotetticontroobesità e iperglicemia in regime di dieta ipercalorica ad elevato contenuto di grassi (Tsuda et al. 2003) o contro l’insorgenza di cancro indotto da agenti cancerogeni (Hagiwara et al. 2001). E’ stato inoltre messo in evidenzacomeleantocianineesercitinouneffettoantimicrobicoconunasignificativariduzionedellasintesi di aflatossine in vitro (Norton, 1999). Anche se la pianta di mais è in grado di accumulare antocianine in diverse varietà locali, attualmente gli ibridi presenti sul mercato e utilizzati in tutto il mondo accumulano quantità trascurabili di antocianine nella pianta e nella granella. Nel mais i diversi geni coinvolti nella via biosintetica che porta all’accumulo di pigmenti di tipo flavonoide, vengono attivati da due classi di geni regolatori:lefamigliedigeniC1/Pl1eR1/B1.Laproduzionedipigmentiinunqualsiasitessutodellapianta richiede, generalmente, l’interazione di un membro di ciascuna famiglia (Chandler et al., 1989; Pilu et al., 2003;Petronietal.,2000).Datalagrandevariabilitàgeneticaesistenteinquestaspecie,diversiallelideigeni regolatori della via biosintetica delle antocianine sono stati caratterizzati e sono noti conferire una forte pigmentazioneinvaritessutidellapianta:B1(booster),Pl1(purpleplant),R1(redcolor),eP1(pericarpcolor) (Chandleretal.,1989;Coneetal.,1993;Grotewoldetal.,1994;Piluetal.,2003).Inparticolare,glialleliB1e Pl1quandopresentinellostessogenotipo,induconoungrandeaccumulodiantocianineinvaritessutidella pianta(radici,stocco,foglie,antere,tutolo,pericarpoeparzialmentenellefoglie)conferendouncolorerosso intenso,R1conferiscel’accumulodipigmentiantocianinell’aleuroneeP1conferiscel’accumulodiflobafeni nellagranella(Fig.4.) Figura4.Differentepigmentazionepresenteneisemidimais.Semiincoloridelgenotipor1b1pl1(A)e coloratiportantiR1(B),P1(C)eB1Pl1(D). Tuttiquestiallelisonodominantiequindiingradodiagireancheinsingoladose,prestandosibenealivello genetico per la costituzione di sementi ibride. Attualmente, nessun ibrido utilizzato nel mercato mondiale accumulapigmentonellagranella;soloalcunevarietàcoloratevengonoutilizzatelocalmenteinCentroeSud America,principalmenteperl’alimentazioneumana. L’utilizzo di ibridi in grado di accumulare antiossidanti in maniera naturale potrebbe apportare un grande beneficio in tutta la filiera agroalimentare sia per quanto riguarda la presenza di questi importanti fitonutrienti che per la sicurezza alimentare in particolare per quanto riguarda FUM, come recentemente pubblicatodalnostrogruppodiricerca(Piluetal.2011). Ͷͻ Obiettivi Gli obiettivi di questa attività di ricerca sono stati quelli di costituire e studiare genotipi di mais ricchi in flavonoidicapacidilimitarel’accumulodimicotossine(inparticolarefumonisine)inmaisalfinedimigliorare lasicurezzaalimentarelimitandol’utilizzodiagrofarmaci.Laprimapartedell’attivitàhariguardato 1.lacostituzionedeigenotipiingradodiaccumularealtilivellidiflavonoidi/antociani 2.lasceltadelgenotipomiglioremedianteanalisichimicheemolecolari 3.laproduzionediunibridopigmentatoedelsuorispettivocontrolloincoloredautilizzarenellevarieprove inpienocampoenellediverseannate. 1.Lacoltivazionedelmaisèstatacondottanell’aziendaagricola഼AngeloMenozzi഼dell’UniversitàdegliStudi diMilano,aLandriano(PV)inunappezzamentodicirca1.6ettari.L’attivitàdibreedingèstataeffettuatanei mesi di giugno e luglio utilizzando degli isolatori (sacchetti di carta) che hanno permesso di controllare gli incrocitraivarigenotipiodimporrel’autofecondazione(Fig.5). Figura5.Attivitàdibreedingeproduzionedigranellasementiperglialtripartnersdelprogetto. Gli incroci effettuati (iniziati anni fa nell’ambito di altri progetti internazionali) hanno permesso tramite procedurediselezioneconnotedi“pedigree”dicostituirenuovelineeisogenichedastudiareinquantotalie da utilizzare come parentali per la costituzione di ibridi (Fig.6.). Durante la costituzione delle linee, la selezione è stata effettuata per il contenuto di antocianine/flavonoidi, germinabilità, vigore della pianta e peso granella per spiga. L’attività di breeding è stata coadiuvata anche dall’utilizzo di marcatori molecolari strettamente associati ai geni regolatori utilizzati in questo lavoro. Ad esempio per quanto riguarda la costituzionedellalineaB1B1Pl1Pl1(BPl)sonostatiutilizzatiimarcatorimicrosatelliti,nc009associatoaPle umc1776associatoaBalfinediseguirelesegregazioniel’effettivafissazioneinomozigosinellalineaBPl ottenuta(Fig.7). ͷͲ Figura6.Schemasemplificatodelleprocedureconnotedi“pedigree”utilizzatoperlacostituzionedinuove lineeedialcuniibridiprodotti. Figura 7. Utilizzo dei marcatori molecolari (microsatelliti) per coadiuvare il lavoro di breeding. In figura è riportatolacostituzionedellalineaBPlcoadiuvatadaimarcatorimolecolariSSRnc009(associatoaPl)e umc1776(associatoaB). ͷͳ 2.Lasceltadelgenotipomiglioredaportareavantiperlesuccessiveproveinpienocampoèstatabasatasul profilo di accumulo delle antocianine e dei flavonoidi effettuata inizialmente con l’analisi TLC (Thin Layer Chromatography) e successivamente approfondita mediante l’utilizzo dell’HPLC (High Performance Liquid Chromatography)comeriportatoinFigura8.Leantocianinesonostatequantificatespettrofotometricamente mostrando che i genotipi in grado di accumulare i più alti livelli di pigmenti (principalmente cianidina e in alcuni casi pelargonidina) sono stati i genotipi portanti BPl e il mais di origine tropicale “morado” coltivato tuttorainCentroAmerica(Fig.9). E’stataanchevalutatalacapacitàantiossidanteespressacomeTEAC(Troloxequivalentantioxidantcapacity) chehamessoinevidenzaunarelazionetrailcontenutodiantocianineelacapacitàantiossidantedeigenotipi oggettodiquestostudio(Fig.10).Lostudioeffettuatohacontribuitoagettarelebasiperulterioriutilizzidi questi materiali genetici come fonte di geni in grado di conferire alti livelli di antiossidanti ad esempio nel campodellamangimisticaenelladirettaalimentazioneumana(e.g.maisdapolenta,scoppioedolce). 3.Comunquetraivarigenotipistudiatiilmaterialecheèstatoselezionatoedutilizzatonellasecondaparte delprogettoèstatalalineaportantel’alleleP1(Pericarpcolor1)checonferiscecolorazionerossadellaspiga perl’accumulo,principalmentenelpericarpo,deiflobafenichesonopolimerideiflavanͲ4Ͳols. Figura8.Asinistraèmostratal’analisiTLCeffettuatasugliestrattialcoliciottenutidallafarinadeisemidei genotipicostituitimostratiinaltoadestra(asinistrasonostaticaricatiglistandards).Inbasso,asinistra, sipuo’osservarelastessalastracromatograficaespostaagliUV.Inbassoadestraèmostratoilprofilo HPLCdeipigmentiaccumulatidalgenotipoBPl. ͷʹ Figura9.Quantificazionedelleantocianinepresentinellafarinaottenutadaivarigenotipi. Figura10.AnalisidellacapacitàantiossidanteespressacomeTEAC(Troloxequivalentantioxidantcapacity). InparticolareèstatosceltounalleleditipoP1Ͳrr(ingradodicoloraresiailpericarpocheiltutolo)perchédati preliminari ottenuti precedentemente dal nostro gruppo di ricerca suggerivano un possibile effetto sul contenutodifumonisinenellagranella(Piluetal.2011).Alfinedistudiarel’effettodellapresenzadiquesto allelesulleinfezionifunginedellaspigadimaissonostaticostituitidueibridiatreviedifferentisoloperla presenzadell’alleleP1(Fig.11). ͷ͵ Figura 11. Produzione della semente ibrida a tre vie differente solo per la presenza di P1. Negli schemi d’incrociop1eP1indicanorispettivamentedellelineeomozigoti. Perquantoriguardalasecondapartediattivitàvoltaallostudiodell’ibridopigmentatoselezionatoedelsuo controlloincoloresonostatiallestitinel2011Ͳ2012,4campisperimentali,situatineicomunidiAlbairate(MI), Arcene(BG),Olmo(LO),Landriano(PV,2011)eRodigo(MN,2012)alfinedianalizzarelacontaminazioneda Fusarium spp. e Aspergillus spp. nei due genotipi. Inoltre i campi sono stati suddivisi in parcelle in presenza/assenza del trattamento antipiralide per stabilire la relazione tra l’attacco di questo insetto e le infezionifungine. Leanalisieffettuatehannoriguardato: 1.contaminazionedaFusariumspp.dellesete; 2.diffusionedeimarciumifunginiedelleinfestazionidaECBsuspiga 3.infezionifunginelatentinellecariossidiasintomatiche; 4.accumulomicotossine. Nel 2013 l’effetto del genotipo (ibrido pigmentato vs ibrido incolore) è stato valutato presso l'azienda sperimentaledelDiSAAaLandriano(PV),utilizzandocomestrategiaantipiralideunaretedipolietileneche ricoprivalaspigaeinoculandosperimentalmenteF.verticillioidesnelcanaledellesete. Risultatiottenuti 1.ContaminazionedaFusariumspp.dellesetenelmaiscoloratoeincolore. Nelle due annate prese in considerazione solo funghi tossinogeni afferenti al genere Fusarium sono stati isolati dalle sete. I più contaminati sono stati i frammenti derivanti dalle sete esposte, mentre i frammenti dallesetecopertedallebratteesonorisultatisporadicamenteinfettidaceppiafferentiaGFC.FGCèstatopiù frequentemente isolato nel 2011, GFC nel 2012. Più del 50% dei ceppi afferenti a GFC appartengono alla ͷͶ specieF.verticillioides.LepopolazionidiFusariumisolatedaidueibridimostranoanalogacomposizione(Fig 12). F Figura12.ContaminazionedellesetedaFusariumspp. 2.Dannidapiralideemarciumifunginisuspighedimaisincoloreecolorato,trattatoenontrattato. L'infestazione da ECB ha interessato il 58% delle spighe valutate nel 2011 e l’82% delle spighe nel 2012. I marciumi,inambedueleannaterappresentatiquasiinteramentedaFER,eranodiffusisul30%deicampioni nel2011esul38%nel2012.Sui2genotipinonsonostaterilevatedifferenzesignificativenella%dispighe danneggiate da ECB e dai marciumi, mentre il trattamento antipiralide ha ridotto solo la diffusione dell’infestazione che è passata dal 66% nel mais trattato al 75% nel non trattato. Abbinando presenza di flavonoidietrattamentoantipiralide,la%didiffusionediECB(DP%)diminuiscesignificativamente:leparcelle di mais colorate trattate hanno avuto infestazioni da ECB più contenute rispetto a quelle non trattate di ambedueigenotipi(Fig13A).Soltantonel2011sièosservataunadifferenzatralaparcellacoloratatrattatae nontrattata.Nei2annilaFERèstatadeterminataessenzialmentedaF.verticillioideseF.proliferatum.Solo nel2012leparcelledelgenotipocoloratosonorisultatesignificativamentemenoinfetterispettoallaparcella incolorenontrattata(Fig.13B). ͷͷ Figura13.(A)DiffusionedannidaECB(DP%)e(B)diffusionemarciumi(DM%) 3.Infezionifunginelatentiecontaminazionedamicotossinenellagranella Ceppi afferenti ad Aspergillus sez. Flavi, potenziali produttori di aflatossine, sporadici nel 2011, sono stati isolati nel 2012 in tutti i campi e con elevata frequenza a Rodigo (MN) e Olmo (LO). Ciononostante la contaminazione da aflatossine non ha mai raggiunto livelli preoccupanti. Le infezioni latenti dovute a GFC sono risultate preponderanti. La % di contaminazione delle cariossidi rilevata nel 2011 nei siti sperimentali (31%)èstatainferioreaquellariscontratanel2012(41%).Ingeneralenéiflavonoidinéiltrattamentohanno ridotto significativamente le infezioni latenti da GFC. Solo nel 2012 le cariossidi del genotipo pigmentato eranomenocontaminatedaGFCrispettoaquelledimaisincolorenontrattato(Fig.14A).Lamaggioranza dei ceppi isolati da granella asintomatica afferivano alle specie F. verticillioides e F. proliferatum, note produttrici di fumonisine. Le fumonisine, frequenti e in concentrazioni variabili, hanno raggiunto livelli mediamentepiùelevatinel2012.Néilgenotiponéiltrattamentohannoinfluenzatoingeneraleillivellodi FUM(Fig. 14B).Al contrario sono state osservate differenze significative tra le località sia nel2011 sia nel 2012. Dai dati raccolti è emerso che l’interazione genotipoXtrattamentoXlocalitàXannata induce una diminuzionesignificativadelladiffusionedellapiralideedellacontaminazionedafumonisine.Inparticolare,il fattoregenotipointeragisceconlalocalitànelridurreladiffusionedellapiralideedell’infezioneasintomatica daGFCeconl’annataneldeterminareunacontrazionediFEReinfezionelatente. ͷ Figura14.(A)InfezionilatentidaGFC(GFC%)e(B)ConcentrazioniFUMnellagranella(mg/kg) 4.Effettodeisoliflavonoidisull’interazioneF.verticillioidesͲmais Per eliminare l’effetto localitàXannata sull’interazione F. verticillioidesͲmais incolore e colorato, sono state effettuateinoculazionisperimentalisuentrambiigenotipiaLandriano(PV),proteggendolespigheprescelte conretiantiinsettoalfinediridurrel’infestazionedaECB.Lapresenzadiflavonoidinelpericarpoharidotto ladiffusioneelagravitàdiFERrispettoaquantoosservatosullespighepriveditalicomposti(Figura15). ͷ Figura15.DiffusioneegravitàFERnelleparcelleinoculateconF.verticillioides Ricaduteoperative IflavonoidinelpericarpodelmaissonopotenzialmenteingradodiridurrediffusioneegravitàdiFERnella spiga.L’efficaciadeiflavonoidinelproteggerelagranelladimaispuòvariaresignificativamenteinfunzione dell’annata,dellalocalitàedell’incidenzadell’infestazionedapiralide.Inannatecaratterizzatedaandamenti meteorologici non particolarmente favorevoli a piralide e GFC, l’effetto dei flavonoidi, abbinato alle buone pratiche colturali, è sufficiente a garantire un accettabile stato sanitario della granella, che al contrario in presenza di elevate presenze dell’insetto e condizioni siccitose in concomitanza dell’emissione delle sete, deveessereadeguatamenteprotettaneiconfrontidelfitofago. Conclusioni Oltreallepraticheagronomiche(Maioranoetal.2009)eaitrattamentiinsetticidineiconfrontidiO.nubilalis (Mazzoni et al., 2011), la resistenza nei confronti dei funghi tossinogeni agenti di marciumi, dovuta a flavonoidioacerepresentineglistratipiùsuperficialidellacariosside,puòcontribuireamigliorarequalitàe quantitàdellaproduzionemaidicolalombarda.Dalleproveeffettuateèemersoche: ͲlacomunitàfunginaassociataallaspigadimaisèdominatadalgenereFusariumedinparticolaredaGFC, mentreAspergillussez.Flavièunacomponenteminoritaria; ͲlamaggiorpartedegliindividuiafferentiaGFChaspiccatepotenzialitàtossinogeneilche,insiemeconla ͷͺ diffusione,rendeprobabilel’accumulodifumonisinenelmaislombardo; Ͳ GFC è in grado di infettare la cariosside attraverso le sete specialmente in presenza di condizioni meteorologichefavorevoli(vedi2012) ͲiflavonoidisonoingradodilimitarediffusioneegravitàdiFERinassenzadialtrifattoripredisponentiquali lesionidainsetti; Ͳ nella definizione di strategie di protezione integrata, l’utilizzo di mais ricchi di flavonoidi può contribuire, insieme con altre misure agronomiche e fitoiatriche, al miglioramento qualiͲquantitativo della produzione maidicola. 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Fusarium verticillioides contamination patterns in Northern Italianmaizeduringthegrowingseason.PhytopathologiaMediterranea,50,110Ͳ120 TsudaT., HorioF., UchidaK., AokiH., OsawaT., (2003) Dietary cyanidin 3ͲOͲɴͲDͲglucosideͲrich purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in mice. The Journal of nutritionvol.133,no7,pp.2125Ͳ2130 ͳ Peptidiendogenidelsemeadattivitàbiocida AlessioScarafoni,LauraAzzini DipartimentodiScienzepergliAlimenti,laNutrizioneel'Ambiente,UNIMI Introduzioneallatematica Durante la germinazione il seme e il suolo circostante costituiscono un habitat ricco per lo sviluppo e l’interazione microbica. La principale fonte d’energia per i microrganismi in questo habitat è il carbonio rilasciato dal seme nel suolo circostante. Alcuni microrganismi hanno una funzione benefica nei confronti delle piante, ma altri risultano essere patogeni. Il seme in corso di germinazione è particolarmente vulnerabileall’attaccodellespeciepatogene.Laconciachimicadellesementi,inparticolarequelledimais,è un trattamento protettivo effettuato con sostanze biocide (insetticidi e fungicidi) allo scopo di contrastare preventivamentepatogenipresentinelterrenooneglistratisuperficialideltegumentodelsemeriducendoi danni che questi possono arrecare al seme stesso o alla giovane plantula che si svilupperà. Per contro, il ricorsoallaconciahaimportantiripercussioniambientali,comerecentementeipotizzatoperiprincipiattivi nicotinoidi. Il seme di mais conciato con questi prodotti, si pensa possa causare mortalità e spopolamenti deglialveari,comegliapicoltoriconapiaridislocatiinareemaidicoledelnordItalialamentanonelperiododi semina della coltura. Al di là di casi particolari di tossicità acuta per l’ambiente, i concianti vanno ad aggiungersi ai presidi fitosanitari di sintesi che immessi in agricoltura possono accumularsi nei suoli e nelle acquesuperficialiedifalda,conunimpattonegativoanchesullasalutedell’uomo.Alfinediridurrel’utilizzo di agrofarmaci di sintesi, il biocontrollo in agricoltura può essere effettuato in modo sostenibile utilizzando sostanzenaturalipercontrollaregliorganismichedanneggianoiraccoltioutilizzandoorganismibeneficiad attivitàantagonistaneiconfrontideipatogeni,oppurescegliendoopportunamenteigenotipidellepiantepiù adattiallerealtàambientalilocalipersfruttarelecapacitàdiresistenzaallemalattiedellepiantestesse. Un’alternativa per limitare l’uso di sostanze biocide durante la conservazione e la germinazione dei semi è quelladisfruttarelenaturaliresistenzedellapianta.Perfareciòoccorreidentificareicompostiallabasedi taliproprietààe,attraversosuccessiviprogrammidiincroci,crearenuovevarietàingradodiesprimereadalti livellilemolecoleresponsabilideglieffettididifesa. Durante le prime fasi della germinazione, i semi sono in grado di rilasciare essudati nel loro intorno (spermosfera)contenentidiversitipidimolecole,siaditipoorganicoabassopesomolecolaresiapeptidie proteineintere,chemostranoattivitàantimicrobicaingradodiinibirelacrescitadispeciefungine(Nelson, 2004). Ciò è stato dimostrato in diverse specie, sia monocotiledoni che dicotiledoni. Le proteine maggiormente rappresentate negli essudati del seme sono enzimi e proteine bioattive (come ad esempio chitinasi, inibitori delle xilanasi fungine, defensine, etc) che mostrano specifiche attività antimicrobiche in gradodiinibirelacrescitadispeciepatogene(Wangetal.2002).Inoltre,èstatodimostratochealcunipeptidi chevengonosecretidalsemesitrovanogiàaccumulatinelsemestessoprimadelsuocontattoconl’acqua ʹ delsuolo,altrivengonosintetizzatiexnovoduranteleprimefasidellagerminazione,altriancorasioriginano, nelle fasi più avanzate, dalla digestione endogena di proteine di riserva già presenti nei semi, come ad esempioleviciline(Marcusetal.,1999),globulinepresentiindiscretequantitàanchenelsemedimais. Non è ancora noto se i semi di mais possiedano tale tipi di meccanismi per proteggere i primi stadi della germinazione. E’ comunque stato dimostrato che nel seme già prima della germinazione sono presenti proteineabassopesomolecolareingradodiinibirelacrescitafungina(Sernaetal.,2001). Attivitàsvolte Scopodiquestapartedelprogettoèstatal’identificazionedivarietàdimaischefosseroingradodisecernere nel loro intorno durante le prime ore dalla semina polipeptidi in grado di inibire funghi patogeni, in particolare quelli produttori di aflatossine e fumosine, le cui tossicità nei confronti dell’uomo e dei mammiferi, sono note da tempo. E’ stato altresì scopo del progetto la caratterizzazione delle proteine medianteindaginimolecolariditipoelettroforeticoeproteomico. IncollaborazioneconilDrRobertoPilusonostateselezionate11lineedimaistraquellepiùcomunemente utilizzate nei programmi di miglioramento genetico e tra quelle che presentassero una storia naturale particolarmenteadattivaneiconfrontidiavversitàambientali,comeperesempioilfamosomaisdiStoro,un maisdialtaqualitàutilizzatoperlaproduzionedifarinadapolenta. L’attività sperimentale svolta nella prima parte del progetto ha portato all’identificazione delle condizioni sperimentalidaadottareperselezionarelevarietàchemegliosonoingradodidifendersiinmodoautonomo daeventualiattacchifungini.Sonostatequindisvolteprovedigerminazionecontrollatavolteariprodurrele condizioni ambientali più favorevoli al rilascio da parte del seme di molecole con attività antifungina. Al termine di questa fase sperimentale, i semi di ciascuna varietà sono stati posti a germinare in presenza di acqua(0.5mL/seme)incondizionidisterilitàeatemperaturacontrollata(18°C)per32ore.Inoltre,irisultati ottenuti hanno mostrato che gli essudati raccolti dopo 32 ore sono molto più efficaci nell’inibire la germinazionedeiconididiquelliraccoltiatempimaggiori(peresempiodopo72oredall’imbibizione). Risultatiottenuti Tra tutte le undici varietà solo tre (linee R2680, R2830, R2869, rispettivamente indicate per brevità con le sigle “H”, “C” ed “I”) hanno prodotto, nelle condizioni sperimentali adottate, essudati in grado di inibire la germinazionedeiconidididuespeciefunginepatogene,AspergillusflavuseFusariumverticillioides.Irisultati diquesteprovebiologichesonoriportatinegliistogrammidellaFigura1,cheriportano,comespecificatoin dettaglionelladidascalia,lepercentualidiinibizionevalutatemedianteletturadelladensitàotticainpiastrea 96 pozzetti. Ogni punto sperimentale è stato condotto in triplo. Le prove di inibizione di germinazione dei conidi sono state svolte in collaborazione con i Dr. Giovanni Venturini e Gemma Assante, appartenenti all’unitàdiricercadiquestoprogettocoordinatadellaProf.A.Vercesi.Unavarietà(corrispondenteallalinea H,selezionataaStoro)sièmostrataparticolarmenteattivaneiconfrontidiF.verticillioides. ͵ Figura 1. Attività antifungina degli essudati confronti di Fusarium verticillioides ed Aspergillus flavus su micropiastre da 96 pozzetti. La crescita di ciascun ceppo è stata valutata ad intervalli di tempo prestabiliti confrontandoivaloridiassorbanza(492nm)altempozeroconl’assorbanzalettaallafinediogniperiododi incubazione.Questometododianalisiadampiospettrohapermessodivalutareinmodorapidolacapacità degliessudatidiinibirelacrescitafungina. NeigraficodiFigura2sonomostratiirelativirisultati(linearosa),confrontaticonilcontrollodicrescita(linea blu).Inquestocasolavalutazionedellainibizioneèstatacondottamediantecontaalmicroscopiodelnumero diconidigerminatidopociascuntempodall’iniziodellageminazionedeiconidi. Figura2.QuantificazionedellacapacitàdiinibizionedellagerminazionedeiconididiF.verticilloidesmediante contadirettaalmicroscopioottico:perquestaprovaèstatosceltol’ssudatochepiùinibivalacrescitafungina (H).Laprovaèstatasvoltaa24°Cdigiornoea10°Clanotte,leletturesonostateeffettuateogni2ore(18 oretotali);èchiaralacapacitàinibitoriadell’essudatoH(PDB=controllo). In seguito a tali risultati, utilizzando un approccio sperimentale analogo, abbiamo dimostrato che negli essudativièlapresenzadinumeroseproteine,alcunedellequaliancheadaltopesomolecolare.Questidati Ͷ sono riportati nella Figura 3, che mostra i tracciati elettroforetici degli essudati evidenziati mediante una reazione specifica in grado di rivelare la presenza di proteine. Il dato è estremamente interessante, soprattuttoseconfrontatoconirisultatidelleprovebiologiche,inquantotuttelevarietàdimaisanalizzate sono in grado di rilasciare nel mezzo di germinazione diversi tipi di proteine, ma solo tre, lo ricordiamo, mostranoattivitàinibitorianeiconfrontidellespeciefunginesaggiate.Lanostraesperienzapregressaciha portatoaritenereaquestopuntoche,inanalogiaconquantoavvieneinaltrespeciediinteresseagronomico, comeperesempionellupino(Scarafonietal.2013),cheipeptidieproteinecheverrebberorilasciatinella spermosfera al momento della germinazione appartengano alle classi delle albumine e delle globuline. Si tratterebbeperlamaggiorpartediproteinecoinvoltenelleattivitàmetabolichedelseme,maperalcunedi esseèstataipotizzataancheunafunzionediriserva.Comevedremoinseguito,questaipotesinonaderisce allarealtàcheabbiamopoiriscontratoperilsemedimais. Figura 3. Tracciati elettroforetici SDSͲPAGE degli essudati prodotti durante la germinazione di 11 varietà di mais.Lacolorazionedeipolipeptidiseparatièstataottenutamediantelametodica“SilverStaining”,ingrado dirivelaresololemolecoleproteiche.Icampionisonoidentificabilidallesiglecorrispondentiallelettereda “A”a“M”. Durante questa ultima fase sperimentale è emerso che la comparsa delle singole proteine trovate negli essudatiavvieneconunatempisticabenprecisa.Perstudiarepiùindettaglioquestoaspettoabbiamomesso apuntounprotocollodigerminazionechehaprevistolaraccoltaelasostituzionedelmezzodigerminazione ogni12ore(Figura4). I tracciati elettroforetici degli essudati raccolti dopo 4, 8, 12 e 32 ore sono qualitativamente diversi gli uni dagli altri, e quindi si può evincere che le diverse proteine vengono secrete in momenti diversi. Esse, comunque, riescono a permanere intatte fuori dal seme almeno fino a 32 ore. Dobbiamo comunque rimarcare le estremamente esigue quantità di materiale proteico trovato. Per ottenere i tracciati mostrati abbiamoinfattiutilizzatogliessudatiprodottida200semi. PerottenereitracciatielettroforeticichemostriamoatitolodiesempionellaFigura5èstatanecessariauna fase di messa a punto della metodica, in particolare sono stati definiti sistemi tampone più efficienti per l’estrazione delle proteine, e sono state definite le procedure più adatte alla purificazione della frazione proteica da altri composti (polisaccaridi e molecole organiche a basso peso molecolare) mediante tecniche ͷ biochimicheseparativetradizionali.Questiinterventihannopermessodiottenerematerialeproteicoconle caratteristiche di purezza idonee alla esecuzione di analisi elettroforetiche bidimensionali (IEF/SDSͲPAGE). Abbiamosceltoquestatecnicainvirtùdelsuoaltopoterediscriminante,ingradoquindidiseparareanche centinaiadiproteinepresenticontemporaneamenteinunamiscela. Figura4.Schemasperimentaleadottatodurantelasecondafasedellasperimentazione Leproteinecosìseparatesonoaltresìidoneeallasuccessivaanalisiinspettrometriadimassa,chepermette, mediante strumenti di bioinformatica, di stabilire l’identità di ciascuna proteina. Questo tipo di caratterizzazionemolecolaredelleproteinesecretedaisemiciavrebbepermessoquindidifornireunnuovo tasselloalleconoscenzescientifichedeimeccanismididifesamessiinattodaiseminelleprimissimeoredella germinazione. ItrecampionimostraticomeesempionellaFigura5mostranochiaramentecheleproteine(visibiliciascuna come una singola macchia) sono diverse per ciascun campione, suggerendo diverse caratteristiche fenotipichedelfenomeno. Figura5.Analisielettroforeticabidimensionaledelleproteineessudatedaisemiditrevarietàdimais. Leproteinesonostateprimaseparateinbaseallalorocaricaelettrica,misuratasullascaledelpH,epoiin baseallaloromassamolecolare(Mr) Durante l’ultima frazione del lavoro di ricerca, come anticipato, la attività sperimentale ha avuto come obiettivolaidentificazione,mediantespettrometriadimassaeanalisibioinformatiche,diquestepolipeptidi, per comprendere quali proteine del seme sono coinvolti direttamente nella difesa del seme germinante e quindi per contribuire ad orientare eventuali interventi volti alla selezione di nuove varietà con una potenziataattivitàantifunginanaturale. Abbiamoristrettoinquest’ultimafrazionedelprogettoquasiesclusivamentelasperimentazionesullavarietà H, che si era mostrata particolarmente attiva nei confronti di F. verticillioides. In particolare, sono stati analizzaticampioniraccoltidopo4,8,24e32oredall’iniziodellageminazione.Neiprimiduecampioninon siamoriuscitiadevidenziarenessunaproteina,probabilmenteperviadelleesiguequantitàpresenti,conle metodichesperimentalicheabbiamoutilizzato.Neinegliultimiduecampionisiamoriuscitiadanalizzareed identificarenumeroseediverseproteine.Ma,connostrostupore,nonabbiamoriscontratonessunaproteina proveniente dal seme di mais, bensì attribuibili a specie batteriche caratteristiche della flora endofitica del seme(Liuetal.,2012),quali,manonsolo,PantoeaedEnterobacter. Conclusioni Irisultatidellanostraattivitàdiricercahannoevidenziatochenellecondizionesperimentaliadottateeconle metodicheutilizzatenonsonoevidenziabilimisurabilifenomenidirilasciodiproteineendogenedapartedel semedimaisgerminante,alcontrariodiquantoosservatoinaltrespecie.Glieffettidiinibizionedellacrescita fungina, che in un campione è stato particolarmente significativo potrebbero essere attribuiti a molecole organiche a basso peso molecolare, il cui studio era fuori da quanto prefissato in fase di progetto, o alla presenzadiunparticolareassettodellapopolazioneendofiticadelseme.Nonsipossonoescluderefenomeni disinergiadelleduefrazioni. Bibliografia Liu, Y., Zuo, S., Xu, L., Zou, Y., Song, W. (2012). Study on diversity of endophytic bacterial communities in seedsofhybridmaizeandtheirparentallines.ArchivesofMicrobiology,194,1001Ͳ1012. Nelson, E.B. (2004). Microbial dynamics and interactions in the spermosphere. Annual Review of Phytopathology42,271–309. 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Wang,X.,Thoma,R.S.,Carroll,J.A.,Duffin,K.L.(2002).Temporalgenerationofmultipleantifungalproteinsin primedseeds.BiochemicalBiophysicalResearchCommunications292,236–242. ͺ Selezioneecaratterizzazionedicolturebattericheconattività antagonista EleonoraRolli,RamonaMarasco,ElenaCrotti,FrancescaCappitelli,SaraBorin,DanieleDaffonchio DipartimentodiScienzepergliAlimenti,laNutrizioneel'Ambiente,UNIMI Introduzioneallatematica Ogniannogliagricoltoriaffrontanoperditedovuteadagentipatogenichevarianodal10%al40%[Vercesi and Cravedi, 2011]. I cereali, ed in particolare il mais e il riso, sono le colture più soggette all’attacco di fitopatogenisianellafasedicoltivazionechenellefasisuccessiveallaraccolta.Inquestocontesto,negliultimi decenni per mantenere un’alta resa e al tempo stesso una buona qualità del prodotto, gli agricoltori sono staticostrettiadutilizzareelevatequantitàdiagrofarmacidisintesi,qualifungicidiedinsetticidi.InItalia,nel 2011,sonostatidistribuiti142.425.026Kgdiprodottifitosanitari,deiquali4.860.517Kgdifungicidisoloin Lombardia[ISTAT,2011]. I fitopatogeni, oltre a causare perdite del raccolto provocano numerose contaminazioni da micotossine, composti altamente tossici che possono avere forti ripercussioni sia sulla catena alimentare umana che su quellaanimale[VercesiandCravedi,2011].Adogginonesisteunmetodoefficaceperl’abbattimentodelle tossine ed è per questo motivo che risulta prioritario prevenire le contaminazioni controllando in maniera ecoͲsostenibilel’attaccodapartedeifitopatogeni,siaalivellodicampocheinpostraccolta. Unanuovasoluzionechepotrebbesoddisfarequesteesigenzeèl’utilizzodibatteripromotoridellacrescita vegetale (PGPB) aventi attività antagonista nei confronti dei fitopatogeni. L’impiego di microrganismi naturalmente associati alle colture vegetali ed in grado di contrastare lo sviluppo di fitopatogeni è una strategiaimportantenell’ambitodiun’agricolturasostenibile.IPGPBsonoingradodiesercitareun’attivitàdi stimolazioneindirettadellacrescitadellepiante,avendoattivitàantagonistaneiconfrontidiclassidiversedi fitopatogeni,risultanoquindiutilinellaprotezionedellecoltureepotrebberotrovareimpiegoinapproccidi lotta integrata. L’attività antagonista comprende diversi meccanismi, quali la competizione per nicchie o substrati, la produzione di inibitori allelochimici appartenenti alle classi dei siderofori, enzimi litici (1,3Ͳ glucanasi,chitinasi),antibiotici,batteriocineecianidi[Weller,2007;Berg,2009]. Apparequindiinteressantelapossibilitàdiprocedereadunostudiodiscreeningedieventualeisolamentodi microrganismi dotati di tale capacità. Obiettivo di questo attività è stato quindi quello di isolare e caratterizzareceppibattericiconattivitàantagonistaneiconfrontidialcunespeciebatterichedifitopatogeni cheinteressanomaiseriso.Irisultatidiquestolavoropermetterannodiottenereeselezionarespecificiceppi microbici che da soli o in coͲcoltura potranno essere sfruttati come antiparassitari biologici in grado di proteggerelecolturedimaiserisodall’attaccodispecificimicrorganismifitopatogeni.L’applicazioneditali preparatiallecoltureavrebbelapotenzialitàdiridurrel’apportodiantiparassitarichimiciallecolture. ͻ Attivitàsvolte Nelmesediluglio2011èstatoeffettuatoilcampionamentodipiantedimaiserisoprelevandocampionidi tessutiradicaliesuolorizosferico,utilizzatiperl’isolamentodibatteridasaggiareperl’attivitàdibiocontrollo controfitopatogeneirilevantiperlestessecolturecerealicole. In laboratorio i campioni di tessuto radicale e suolo rizosferico sono stati processati entro 24 ore dalla raccolta per l’isolamento dei microrganismi associati. Il suolo rizosferico, strettamente adeso alle radici è statoseparatodaquest’ultimeattraversoilmetodo“pullandshake”.Leradicisonoquindistatesterilizzatein superficie attraverso cicli di trattamento con etanolo ed ipoclorito di sodio per eliminare i microrganismi adesisullasuperficieradicaleepermetteresuccessivamentelostudiodellecomunitàbattericheendofiteche colonizzano l’interno dei tessuti radicali [Su net al., 2009]. I campioni vegetali così trattati sono stati usati come inoculi per l’isolamento su terreni colturali specifici per (i) Attinobatteri [Locci, 1989] (ii) batteri con attività ACC deaminasica (come precedentemente descritto nelle Attività del WP2 e WP3). L’interesse si è focalizzato su questi gruppi procarioti in quanto gli attinomiceti sono noti per essere coinvolti nella produzionedisostanzebioattiveconampiospettrodiattivitàfungicida[Barakateetal.,2002;ElͲMehalawyet al.,2004;JainandJain,2007],edibattericonattivitàACCdemminasicasononotiperillorocoinvolgimento neiprocessidifitostimolazioneediprotezionedellacrescitavegetale. E’statacosìgenerataunacollezionemicrobicadicirca300isolatibattericiendofitierizosfericiprovenientida piantedimaiserisodasaggiareinvitrocomepotenzialiagentidibiocontrollo.Lapossibilitàdidisporredi ceppi con attività polivalente, fitostimolante (ACC deamminasi) e contemporaneamente anche di biocontrollo,rappresenterebbeinfattiungrandevantaggioperlafuturaapplicazioneincampo. I batteri delle collezioni microbiche generate sono stati saggiati in vitro contro 2 patogeni fungini e 1 patogeno batterico. In particolare sono stati selezionati: (i) quattro diversi ceppi fungini appartenenti alla specieFusariumverticillioides(ceppo2,3,10,12),agentepatogenodelmarciumedellagranelladimais[Bush et al., 2004], (ii) due ceppi fungini di Magnaporthe orzyae, agente patogeno della “blast desease” nel riso [Wilson and Talbot, 2009], e (iii) un ceppo del patogeno batterico Acidovorax avenae agente eziologico di diversefitopatiecomelastrisciabattericadelriso,ilmarciumedelmaiselasterilitàdellapannocchiadelriso [Song et al., 2004]. Per valutare l’attività di biocontrollo della collezione batterica ottenuta, sono stati condottitestdiinibizionedelpatogenoinvitrotramiteilsistema“dualcultureassay”perilqualeaiduelati estremidiunapiastrada9cmcontenenteterrenocolturaleagarizzatosterileèstatoinoculatoilpotenziale antagonista.Lacolturabattericaèstatalasciatacrescereper2giorniaggiuntiviprimadiinocularenelcentro dellapiastrailfungopatogeno[Bergetal.,2001].Inquestamanierasiassicuralasintesidapartedellacoltura batterica di eventuali molecole bioattive contro il patogeno, sintesi che avviene generalmente nella tarda faseesponenziale/fasestazionariadellacrescita,trattandosigeneralmentedimetabolitisecondari.Dopo14 gironidicoͲculturaantagonistaͲpatogenoèstatovalutatoilpotenzialeeffettodibiocontrollodegliisolatidi interessetramitemisuradellapresenzadiuneventualealonediinibizioneodellariduzionedellacrescitadel fungo(raggiodicrescitainpiastra). Ͳ Ibatterichehannodimostratoattivitàdibiocontrolloneiconfrontideifunghipatogenisonostatisottopostia saggi in vitro per valutare le potenziali attività coinvolte nell’antagonismo quali la produzione di siderofori [SchwynandNeilands,1997],ilrilasciodiesoenzimiqualiproteasiechitinasi[NielsenandSørensen,1997],la sintesidisostanzetossichequaliammoniaca[CappuccinoandSherman,2005).]ecianati[Lorck,2004].Tali saggicontribuirannoallacomprensionedelmeccanismoallabasedell’antagonismo. Infine, i batteri coinvolti nei processi di biocontrollo sono stati identificati mediante il sequenziamento del gene16SrRNA. Risultatiottenuti La collezione di isolati batterici ottenuta da piante di riso e mais è stata saggiata in vitro per valutare il potenzialedibiocontrolloinessapresente.Inparticolareèstatasaggiatalacapacitàdegliisolatidiinibirela crescita di (i) due patogeni fungini, quali Fusarium verticillioides e Magnaporthe orza e (ii) di un patogeno batterico,qualeAcidovoraxavenae. I risultati mostrano che nessuno dei batteri con attività ACC deaminasica ha dimostrato attività di biocontrolloneiconfrontideiquattroceppidiF.verticillioides,adifferenzadegliattinobatteri.Inparticolare solo i ceppi MͲACT1, MͲACT2 e MͲACT3, sono in grado di inibire la crescita di più ceppi di F. verticillioides contemporaneamente.Inparticolare,idatimostranocheilceppoMͲACT1,affiliatiallaspecieBurkholderia ambifariaèingradodiinibirelacrescitadituttiequattroiceppifunginitestati,ilceppoMͲACT2,anch’esso affiliatoallaspecieBurkholderiaambifaria,èattivocontro3ceppifungini,mentrel’isolatoMͲACT3,affiliato al genere Streptomyces, è risultato attivo solo contro 2 ceppi. In Figura 1 è riportato il grafico relativo all’inibizionedellacrescitadeiquattroceppimediatodagliattinobatteriisolatidapiantedimais. Figura 1. (A) Effetto di inibizione della crescita dei quattro ceppi di Fusarium valutato come raggio di crescita del fungo in piastra. TͲtest ***= p<0,001; CP= controllo positivo, crescita del fungo in piastra senza sfida di antagonismo. (B) Effetto di inibizione della crescita dei quattro ceppi di Fusarium valutato come percentuale di inibizione. (C) Immagini relative al test inpiastra. ͳ Alcontrario,nellacollezionebattericaisolatadapiantediriso,siaattinobatterichebattericonattivitàACC deaminasica (ACCd) hanno presentato attività di inibizione in vitro nei confronti della crescita di Magnaporthe orzyzae. In particolare, cinque ceppi di attinomiceti, tutti affiliati al genere Arthrobacter, e 8 ceppiACCdappartenentiaigeneriBacillus,Enterobacter,PantoeaeKluyvera,hannomostratounariduzione dellacrescitaneiconfrontidialmenounodeidueceppidiM.oryzae.Lepercentualidiinibizionedellacrescita mediatedaquesticeppivarianodal22%al46,4%pergliattinobatteri(Figura2)edal9,9%al38%nelcasodi batteriACCd(Figura3). Figura 2. Effetto di inibizione della crescita del (A) ceppo A e del (B) ceppo B di M. oryzae da parte di attinobatterivalutatocomeriduzionedelraggiodicrescitadelfungoinpiastra.Sottoaigraficidellemisure sono riportate le rispettive percentuali di inibizione della crescita. TͲtest ***= p<0,001; **= p<0,01; CP= controllo positivo, crescita del fungo in piastra senza sfida di antagonismo. (C) Immagini relative al test in piastra. Figura3.Effettodiinibizionedellacrescitadel(A)ceppoAedel(B)ceppoBdiM.oryzaedapartedibatteri conattivitàACCdeamminasica,valutatocomeriduzionedelraggiodicrescitadelfungoinpiastra.Sottoai grafici delle misure sono riportate le rispettive percentuali di inibizione della crescita. TͲtest ***= p<0,001; **=p<0,01;CP=controllopositivo,crescitadelfungoinpiastrasenzasfidadiantagonismo. ʹ E’stataquindisaggiatalacapacitàdi100ceppidiattinobatterie29ceppiACCd,tuttiisolatidapiantediriso sottoposteadiversiregimicolturali,diinibirelacrescitadelpatogenobattericoAcidovoraxavenae.Irisultati preliminarimostranocome13attinobatterisianoingradodiinibirelacrescitainvitrodiquestopatogenocon uneffettodiinibizionecheproducealonidiinibizionevariabilitra0,30±0,08a0,85±0,06mm(Figura4) 1 Alonediinibizione(mm) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Figura4.EffettodiinibizionedellacrescitadelceppobattericoAcidovoraxavenaedapartediattinobatteri, valutatocomeriduzionedellacrescitabattericainmillimetri(mm). I16ceppibattericichehannomostranoattivitàdibiocontrolloinvitroneiconfrontidipatogenifunginisono statisottopostiatestvoltiacomprendereimeccanismidiinibizionedellacrescita.Sonostatevalutateinvitro la capacità di produrre enzimi litici quali proteasi, cellulasi e glucanasi, la produzione di sostanze tossiche qualiammoniacaelaproduzionedimolecolechelantiperilferro,cheimpedisconol’assimilazionediquesto elemento essenziale per la crescita e proliferazione dei patogeni fungini. Tali saggi contribuiranno alla comprensione del meccanismo alla base dell’antagonismo. Le attività più diffuse risultano essere la produzione di ammoniaca effettuata da 14 ceppi e la sintesi di siderofori effettuata da 12 ceppi. Nessun ceppo si è dimostrato in grado di produrre cellulasi e glucanasi mentre 5 ceppi sono risultati in grado di produrreproteasi(Tabella1).SullabasedeitestPGPeffettuati,lasintesidiammoniacaèrisultatal’attività principale di interferenza sulla crescita fungina, attività presentata da circa l’80% dei ceppi che hanno mostratoantagonismoneiconfrontideifitopatogenisaggiati. Inoltre,idatiottenutifinoadoraevidenzianounastringenteselettivitàesercitatadallapiantaneiconfronti delle popolazioni associate in quanto solo i ceppi isolati dall’apparato radicale di una coltura presentano attivitàantagonistaversoilpatogenocheaffliggelastessaspecievegetale.Infatti,comemostratoinTabella 1,soloiceppibattericiisolatidamaissonoingradodiesercitareun’attivitàdibiocontrolloversoFusarium, patogeno fungino anch’esso isolato da piante di mais. Lo stesso vale per il modello riso, dove solo i ceppi naturalmenteassociatiaquestacolturasonocapacidiinibirelacrescitadiM.oryzae. ͵ Tabella1.IdentificazionefilogeneticaetestPGPdeibatterichehannomostratoattivitàdibiocontrollonei confronti dei ceppi di Fusarium e Magnaporthe saggiati. In grassetto sono evidenziate le attività PGP dei ceppipiùattivinell’attivitàdibiocontrollo. Ricaduteoperative L’usodiagrofarmacidisintesihasicuramenteaiutatol’agricolturainquestosecolo,maancheinquestocaso confortiripercussionisull’interoecosistemaagricolo.L’elevatocostodeiprodottifitosanitariedillorocritico impattoambientalerendonoprioritarialamessaapuntodistrategiealternativedidifesadellepiantetesea ridurre,senonescludere,l’impiegodiquestiprodotti.Finoadoggilestrategiealternativeedecosostenibili adottatesifondanoessenzialmentesuiprincipidilottaagronomicabasatasullasceltavarietaleesulcontrollo dellaconcimazioneazotata.Ulterioriprospettivesonorecentementeemerseinseguitoall’individuazionedi microrganisminaturalmenteassociatiallepianteedingradodicontrastarelosviluppodiagentifitopatogeni esercitando una funzione di biocontrollo attraverso fenomeni di competizione per nicchie ecologiche e substrati,produzionediinibitori,sostanzeallochimiche,antibiotici,cianidiedenzimilitici.Esistonoindicazioni semprepiùchiareriguardantiilruolodiquestibatteri,naturalmenteassociatiallepiante,nell’esercitareun effettodiprotezioneneiconfrontidifitopatogenisiadinaturabattericachefungina.Ilpresentestudiosiè concentratopertantosull’isolamentoelacaratterizzazionedibattericoinvoltineiprocessidibiocontrollodei principalipatogenidelriso(Magnaportesp.)edelmais(Fusariumsp.)riscontratiinLombardia,focalizzando leprocedurediisolamentosuduecategoriedibatteripotenzialmenteantagonisti.Sonostatiinfattiutilizzati terrenicolturaliperselezionare(i)attinobatteri,giànotiinletteraturaperleloroattivitàdibiocontrolloverso molteplicifitopatogeni,e(ii)battericonattivitàACCdeaminasicachegrazieallepotenzialitàdipromozione dellacrescitavegetalepotrebberoesseresfruttatiperlaformulazionediprodotticonattivitàdibiocontrollo, Ͷ ealtempostessobiofertilizzante,inpraticheagricolesostenibilicontribuendoaridurrel’utilizzodisostante disintesi. Laselezionedibatteriassociatiapiantedirisoemaishapermessodivalutareilpotenzialedibiocontrollonei confronti di patogeni fungini e batterici associati alle diverse varietà cerealicole studiate e alle diverse pratichecolturaliconloscopodiindividuareceppiantagonistiingradodiminimizzareleperditeproduttivee capaciquindidicontribuirealmiglioramentocomplessivodellaproduttivitàcerealicolaLombarda. Irisultatiottenutidaquestostudiomostranocomelestessepiantesianoingradodiselezionarecomunità battericheconunintrinsecaattivitàantagonistaneiconfrontidelleprincipalifitopatologiecapacidiinfettare le stesse varietà vegetali. È infatti da sottolineare il fatto che non è stato trovato nessun ceppo isolato da piantedimaiscapacediinibirelacrescitadeifitopatogenifunginidelriso,eviceversa.Gliisolatiselezionati costituisconoquindiuninteressantepresuppostoperlacostituzionediformulaticonattivitàdibiocontrollo specificheingradodiproteggerelediversecolturecerealicoledaiprincipalipatogenidiinteresse,riducendo così la richiesta di apporti di agro farmaci di sintesi. Allo stesso tempo le potenzialità di promozione della crescitavegetaledeiceppiselezionatirappresenterebbeunvaloreaggiuntoalprodottochepotrebberivelarsi moltoutilenelleapplicazionidicampo. Conclusioni Irisultatiquiriportatimettonoinevidenzailgrandepotenzialedibiocontrollodellacollezionediceppiisolati da endosfera e rizosfera di riso e mais. In particolare, i risultati mostrano una stringente specificità di inibizionedellacrescitadelpatogenoasecondadellapiantadiorigine.Infatti,soloiceppiisolatidall’apparato radicalesiadelrisosiadelmaispresentanoattivitàantagonistaversoilpatogenoisolatodallastessacoltura. Nel caso del riso, l’attività antagonista nei confronti di M. orza risulta presente in attinomiceti affiliati al genere Arthrobacter (4 ceppi) e in 8 ceppi batterici con attività ACCͲdeaminasica identificati come appartenenti ai generi Bacillus, Klebsiella, Enterobacter, Pantoea e Kluyera. Al, contrario, nel caso del mais solo tre ceppi hanno presentato attività di biocontrollo nei confronti di F. verticillioides, appartenenti ai generibattericiBurkholderiasp.eStreptomycessp.. Grazieaitestinvitroèstatopossibilestabilirequalefossel’attivitàantagonistamaggiormenterappresentata tra gli isolati e quindi possibile responsabile dell’inibizione stessa. Nel dettaglio, la sintesi di ammoniaca risulta essere il meccanismo più diffuso coinvolto nell’interferenza sulla crescita fungina, seguito dalla produzione di siderofori e proteasi. Al contrario, enzimi idrolitici come glucanasi e cellulasi non sembrerebberoesserecoinvolteneiprocessidiinibizionemediatidaquestibatteri. Future ricerche dovranno approfondire le conoscenze sulla diversità metabolica e genetica dei ceppi che hannodimostratoinvitroedinvivoattivitàPGP,perunafuturaapplicazioneincampodiformulatibatterici con attività biofertilizzanti e di biocontrollo. L’utilizzo di microrganismi PGP si presenta quindi come uno strumentopotenzialmenteefficacenellimitarel’utilizzodifertilizzanti,fitofarmaciel’irrigazionedisupporto, contribuendo ad alleviare le conseguenze negative dei problemi climatici ed ambientali nell’ambito dell’odiernaagricoltura. ͷ Bibliografia BarakateM.,Y.Ouhdouch,K.Oufdou,C.Beaulieu(2002)CharacterizationofrhizosphericsoilStreptomycetes fromMoroccanhabitatsandtheirantimicrobialactivities.WorldJ.Microbiol.Biotechnol.18:49–54. BergG.,FritzeA.,RoskotN.,SmallaK.(2001)Evaluationofpotentialbiocontrolrhizobacteriafromdifferent hostplantsofVerticilliumdahliaeKleb.J.App.Microb.91:963–971. BergG.(2009)PlantͲmicrobeinteractionspromotingplantgrowthandhealth:perspectivesforcontrolleduse ofmicroorganismsinagriculture.App.Microb.Biotech.84:11–18. BushB.J.,M.L.Carson,M.A.Cubeta,W.M.Hagler,G.A.Payne(2004)InfectionandFumonisinProductionby FusariumverticillioidesinDevelopingMaizeKernels.GeneticsandResistance94:88Ͳ93. 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