Università degli studi di Urbino “Carlo Bo”
FACOLTA’ DI SCIENZE E TECNOLOGIE
Corso di Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e Molecolare
LATTE BOVINO CRUDO DEL MONTEFELTRO:
ANALISI DELLA CAPACITA’ ANTIOSSIDANTE TOTALE
Relatore : Chiar.mo Prof.
Tesi di Laurea Specialistica di:
Ferdinando Mannello
Michela Toro
Anno Accademico 2006-2007
INDICE
PARTE GENERALE
CAPITOLO I : IL LATTE BOVINO
1.1 - Fisiologia della lattazione.................................................................................pag.
1.1.1 - La ghiandola mammaria …………………………………………….pag.
1.1.2 - Mammogenesi ………………………………………………………pag.
1.1.3 - Lattogenesi…………………………………………………………..pag.
1.1.4 - Eiezione del latte…………………………………………………….pag.
1.1.5 - Sintesi del latte………………………………………………………pag.
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1.2 - Composizione biochimica e cellulare del latte bovino....................................pag. 18
1.2.1 - L’acqua……………………………………………………………...pag. 18
1.2.2 - Le proteine………………………………………………………......pag. 19
1.2.3 - I lipidi………………………………………………………………..pag. 20
1.2.4 - I glucidi……………………………………………………………...pag. 21
1.2.5 - I sali minerali………………………………………………………..pag. 21
1.2.6 - Le vitamine………………………………………………………….pag. 22
1.2.7 - I parametri qualitativi del latte………………………………………pag. 23
1.3 - Trattamenti del latte per la commercializzazione............................................pag. 26
1.3.1 - Processi industriali…………………………………………………..pag. 26
1.3.2 - Normativa in vigore……………………………………………….....pag. 31
1.3.3 - Durata del latte pastorizzato………………………………................pag. 33
CAPITOLO II : IL LATTE BOVINO CRUDO
2.1 - Proprietà nutraceutiche..................................................................................pag. 37
2.1.1 - Proteine bioattive…………………………………………………..pag. 37
2.1.2 - Zuccheri ed altri componenti bioattivi……………………………..pag. 43
2.2 - Effetti benefici su alcune patologie umane....................................................pag. 44
2.2.1 - Osteoporosi…………………………………………………………pag. 44
2.2.2 - Patologie cardiovascolari…………………………………………...pag. 45
2.2.3 - Infiammazioni………………………………………………………pag. 46
2.2.4 - Neoplasie……………………………………………………………pag. 47
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CAPITOLO III : BILANCIO TRA STRESS OSSIDATIVO E COMPOSTI
ANTIOSSIDANTI
3.1 - Lo stress ossidativo......................................................................................pag. 49
3.1.1 - I radicali liberi e gli antiossidanti …………………………………pag. 49
3.1.2 - Bilancio dello stress ossidante ……………..……………………..pag. 53
PARTE SPERIMENTALE
CAPITOLO IV : SCOPO DELLA RICERCA
4.1 - Scopo della ricerca......................................................................................pag. 58
CAPITOLO V : MATERIALI E METODI
5.1 - Campioni di latte crudo...............................................................................pag. 60
5.2 - Metodo ORAC............................................................................................pag. 61
5.3 - Dosaggio dei tioli totali...............................................................................pag. 62
5.3.1 - Procedura di dosaggio........................................................................pag. 62
5.3.2 - Principio del metodo..........................................................................pag. 62
5.4 - Dosaggio delle proteine totali.....................................................................pag. 63
5.5 - Separazione elettroforetica delle proteine contenenti cisteine
ed identificazione con AEDANS...............................................................pag. 63
5.6 - Analisi statistiche........................................................................................pag. 64
CAPITOLO VI : RISULTATI
6.1 - Risultati.......................................................................................................pag. 66
CAPITOLO VII : CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
7.1 - Considerazioni conclusive...........................................................................pag. 71
BIBLIOGRAFIA
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PARTE GENERALE
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CAPITOLO I : IL LATTE BOVINO
1.1 - FISIOLOGIA DELLA LATTAZIONE
1.2 - COMPOSIZIONE BIOCHIMICA E CELLULARE
1.3 - TRATTAMENTI DEL LATTE PER LA COMMERCIALIZZAZIONE
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1.1 - FISIOLOGIA DELLA LATTAZIONE
1.1.1 - LA GHIANDOLA MAMMARIA
Anatomia macroscopica
La mammella è una grossa ghiandola, tipica dei mammiferi, che elabora il latte. Il numero, la
forma, il volume e la posizione variano a seconda della specie. Le ghiandole mammarie si
sviluppano centralmente, lungo due linee paramediane che vanno dal cavo ascellare alla regione
inguinale. Sono presenti in numero 6-8 per lato nel maiale, 1 nella cavalla, nella capra e nella
pecora e 2 nella vacca.
Nella descrizione anatomica macroscopica vanno considerate tre componenti principali:
- la pelle - è fine e coperta di peli delicati e radi, con ghiandole sudoripare e sebacee. A livello del
capezzolo, la cute è più resistente. Il capezzolo, generalmente conico, ha un apice perforato da
uno o più fori lattiferi, sbocchi dei condotti escretori.
- le fasce mammarie - la ghiandola è accolta dal tessuto sottocutaneo, delimitato da fasci
connettivali.
- il corpo ghiandolare - la mammella è una ghiandola tubulo-alveolare composta, a secrezione
apocrina (lipidi) e merocrina (protidi). La ghiandola mammaria consta di più lobi, separati da
tessuto connettivo, infiltrato da notevoli quantità di tessuto adiposo. I dotti escretori di ciascun
lobo fanno capo ad un condotto lattifero, o lobare, che si apre alla base del capezzolo, nel seno
lattifero o galattoforo, il quale si porta in superficie mediante un dotto papillare. Si hanno
ghiandole del tipo semplice (nei ruminanti), che hanno un solo dotto papillare ed un seno lattifero
nel quale affluiscono più dotti lobari, o composto (negli equidi carnivori), che ha più seni lattiferi
con propri dotti [1].
La mammella della bovina è suddivisa in due metà distinte, separate da tessuto connettivo e dai
legamenti sospensori mediani. Ciascuna metà è costituita da due ghiandole, anteriore e
posteriore, dette comunemente quarti o quartieri. I quarti sono completamente separati tra di loro.
La capacità dei quarti posteriori è generalmente superiore rispetto a quelli anteriori (60% i
posteriori, 40% gli anteriori). La selezione ed il miglioramento genetico e morfologico
dovrebbero ridurre le differenze di capacità tra i quarti posteriori ed anteriori. La mammella è
principalmente sostenuta da una fascia di tessuto connettivo presente in ciascuna metà mammaria
e formata dalla fusione dei legamenti sospensori mediano e laterale. I legamenti sospensori
laterali costituiscono il principale sostegno della mammella, in quanto non contengono fibre
elastiche, e perciò non si distendono. Al contrario, tali fibre sono presenti nel legamento mediano
che, potendosi perciò distendere, consente alle mammelle di proiettarsi verso l’esterno. Quando
entrambi i legamenti cedono, la mammella diventa pendula, e si abbassa verso il terreno. In
questo caso, oltre a diventare più vulnerabile agli agenti fisici e microbiologici e di lesioni al
capezzolo, diventa problematico posizionare correttamente il gruppo di mungitura e permettere
un funzionamento accettabile da parte della guaina. Il sistema vascolare, che permette al sangue
di raggiungere la mammella, è così composto: il sangue proveniente dal cuore va dall’aorta
all’arteria iliaca interna ed all’arteria iliaca esterna, dove la prima, con tre diramazioni, irrora la
ghiandola nel ramo posteriore, caudale e craniale, e la seconda vascolarizza l’altra metà della
mammella. I nervi della mammella hanno origine mista, e sono i mediatori del riflesso che
stimola la discesa del latte, dando luogo alla liberazione dell’ossitocina da parte della post-ipofisi,
non svolgendo, così, un ruolo diretto nella secrezione del latte. I capezzoli sono la componente
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fondamentale della mammella per la corretta scelta del tipo e forma di guaina da adottare in
allevamento. Nella bovina, il numero normale è di quattro mammelle funzionali. La forma è
variabile, da quella cilindrica, cioè con diametro costante per l’intera lunghezza, a quella affusata o
conica, nel qual caso l’estremità libera è molto più sottile rispetto alla base. La lunghezza è
anch’essa estremamente variabile. La cute è sottile, e sprovvista di peli e ghiandole cutanee. Nella
parete è contenuto un plesso vascolare che si riempie di sangue sotto pressione quando i capezzoli
sono stimolati, favorendone in tal modo l’erezione che, a sua volta, facilita il deflusso del latte a
seguito della mungitura, sia manuale che meccanica. La cisterna del capezzolo (sinus papillaris) è
rivestita da un epitelio a doppio strato di cellule, con una topografia variabile. Nel punto di fusione
fra la cisterna del capezzolo e della mammella può essere presente una plica anulare, che è appena
percettibile oppure fortemente rilevata e, in quest’ultimo caso, impedisce la comunicazione fra le
due cavità. E’ causato molte volte dalla testa della guaina non adatta. L’epitelio di rivestimento può,
in alcuni casi, risultare di tipo squamoso in corrispondenza delle creste e delle pliche. Queste
modificazioni cellulari potrebbero rappresentare una reazione ad eventuali traumi di mungitura.
Infatti, l’epitelio della cisterna del capezzolo ed i sottostanti tessuti possono reagire a tali traumi
attraverso la formazione di tessuto cicatriziale. Quest’ultimo, se circoscritto, può provocare la
formazione di un’escrescenza, che si proietta nel lume, ostacolando il flusso di latte, oppure, in casi
di traumi gravi, può ostruire l’intera cavità del capezzolo. La cisterna mammaria (sinus lactiferus)
appare estremamente variabile per dimensioni e forma, ed al suo interno sono presenti i grossi dotti,
in numero da 8 a 12, che si dipartono dalla cisterna mammaria per seguire il contorno esterno del
quarto corrispondente, estendendosi nel parenchima ghiandolare.
Lo stretto canale situato all’estremità del capezzolo è denominato dotto capillare o, più
comunemente, canale striato. Da diverse indagini fatte, la lunghezza di tale canale, sia dopo
l’abbattimento che su animali vivi, con l’introduzione di una sottile cannula di plastica o con una
tecnica radiografica, oscilla tra gli 8 ed i 10,5 mm. Il diametro del canale striato non è uniforme per
tutta la sua lunghezza: 0,55 mm in prossimità dell’orefizio, 0,66 mm nella zona mediana e 0,82 mm
nell’estremità prossimale (Fig. 1).
Fig. 1 - Struttura macroscopica della
mammella.
In condizioni normali, il canale striato presenta alcune strutture anatomiche che fungono da barriera
alla penetrazione dei microrganismi. L’efficienza di tale strutture appare massima alla prima
lattazione e si affievolisce gradualmente in quelle successive, con la conseguenza di maggior casi di
mastite causate da mungitura errata e mal comportamento delle guaine. Il rivestimento interno del
canale striato è costituito da un epitelio pavimentoso stratificato, che subisce continui processi di
cheratizzazione, dal quale deriva del materiale di tipo sebaceo, che si distacca e riempie il lume del
canale. Questo materiale sebaceo contiene acidi grassi a lunga catena in elevata concentrazione, che
agiscono come batteriostatici nei confronti di alcuni agenti patogeni. In condizioni normali, questi
impediscono la moltiplicazione e la sopravvivenza dei microrganismi penetrati nel canale striato
(Fig. 2). Il canale striato termina in una serie di pliche, dette “Rosette di Furstenberg”, la cui
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funzione è di trattenere il latte nell’intervallo fra le mungiture. Il canale striato, inoltre, è circondato
da un vero sfintere, costituito da un muscolo liscio, disposto longitudinalmente con fibre circolari.
Un capezzolo è indicato beante quando il muscolo sfintere risulta incapace di mantenere la chiusura
ermetica del canale. Diverse indagini indicano che esiste la predisposizione ad una maggiore
incidenza di infiammazioni mammarie e successive mastiti in quei quarti che hanno il canale del
capezzolo beante [2].
Fig. 2 - Canale striato, posto
all’estremità del capezzolo.
Struttura microscopica
Negli animali in lattazione, il parenchima comprende gli alveoli, in corrispondenza dei quali viene
secreto il latte, e il sistema dei dotti, tramite il quale il latte raggiunge le cisterne. Gli alveoli sono
strutture minute, di forma sferoidale o piriforme, costituiti da un solo strato di cellule epiteliali, e
riuniti in grappoli, o lobuli, di 200 elementi circa, che sono separati da setti fibrosi. Più lobuli
formano i lobi. Il tessuto connettivo che separa i lobi è collegato ai legamenti, con i quali forma il
legamento sospensore. Gli alveoli ed i dotti sono ricoperti dalle cellule mioepiteliali, di forma
stellata, ricche di miofilamenti. Ogni alveolo è avvolto da uno stroma delicato, che contiene una
fine rete capillare. Un epitelio bistratificato riveste le cisterne del capezzolo, del latte e dei dotti.
Vascolarizzazione
Negli animali ad alta produzione si forma un litro di latte in seguito al passaggio di 500 litri di
sangue attraverso la ghiandola mammaria; negli animali a bassa produzione, invece, sono necessari
1000 litri. La maggior parte del sangue arriva tramite le due arterie pubende esterne, che, alla base
della mammella, danno origine alle arterie mammarie craniale e caudale. Il sistema venoso è
costituito da queste due vene, che passano nel canale inguinale e si anastomizzano con le vene
addominali sottocutanee e con la vena perineale. Tali anastomosi danno luogo al cosiddetto circolo
venoso alla base della mammella.
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Innervazione
Nervi mammari riconoscono una componente di fibre sensitive somatiche ed una di fibre motrici
simpatiche. La componente simpatica innerva le cellule mioepiteliali dei dotti e delle cisterne. Le
fibre sensitive sono presenti a livello capezzolare.
Apparato di sospensione
La cute svolge un ruolo non determinante nei meccanismi di sospensione, ma è importante la sua
azione protettiva generale. Il peso viene sostenuto da due strutture, costituite dai legamenti larghi
sospensori mediani e laterali, dei quali i primi partono dalla linea alba e si estendono fra la metà
destra e sinistra, mandando dei sepimenti all’interno e permettendo di attutire gli shock meccanici
della deambulazione, mentre i secondi vanno dal legamento sub-pelvico alle fasce laterali della
mammella. Funzionalmente, tra i legamenti larghi laterali e mediani si costituiscono delle strutture
atte ad impedire lo schiacciamento delle formazioni alveolari poste più in basso. Con l’età, dopo più
lattazioni, queste strutture perdono l’elasticità e tendono ad allungarsi, provocando l’insorgere della
mammella pendula.
1.1.2 - MAMMOGENESI
Periodo embrionale e fetale
Il tessuto ghiandolare della mammella origina, a livello embrionale, dall’ectoderma. Le varie fasi
della sua morfogenesi sono simili in tutti i mammiferi: dapprima compaiono due creste
ectodermiche parallele, lateralmente alla linea mediana-ventrale del feto, dette linee del latte, che
successivamente perdono la loro continuità e formano una serie di cellule ectodermiche, in
posizione e numero variabile a seconda della specie. Da questi noduli derivano le gemme
mammarie, di forma prima lenticolare poi sferica e quindi conica. Nelle bovine, la parte terminale
della gemma si allunga a formare il cordone mammario primario, che si canalizza, ed il lume così
formato si dilata e forma una piccola cisterna del latte. Verso il 4-5 mese si origina una rudimentale
cisterna del capezzolo, e dalla cisterna del latte si originano dei cordoni secondari, i futuri dotti.
Alla nascita, in genere, la mammella ha una struttura del tutto rudimentale ed è formata dai
capezzoli, dai dotti papillari, da cisterne non ben sviluppate, dai dotti e da qualche alveolo.
Successivamente, l’accrescimento della mammella segue, fino alla pubertà, quello generale
corporeo (accrescimento isometrico). Alla nascita, i dotti sono ancora confinati in una zona limitata
attorno alla cisterna del latte, ma lo stroma è comunque completamente sviluppato. A 13 settimane
di vita, il tessuto stromale ha assunto la caratteristica forma della mammella.
Periodo post-natale
Con l’inizio dell’attività ovarica, la mammella cresce in misura maggiore del resto del corpo
(accrescimento allometrico), in quanto ogni ciclo apporta un lieve aumento della ghiandola, fino ad
un periodo massimo di 36 mesi nella bovina. L’accrescimento più evidente si osserva in
gravidanza; all’inizio è molto lento, ma successivamente aumenta fino al momento del parto,
quando l’organo acquista la piena funzionalità. Il cuscinetto adiposo viene riassorbito e sostituito da
strutture ghiandolari.
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Ormoni
Gli ormoni che agiscono nella mammella, a seconda della loro azione, vengono schematicamente
divisi in masteoplastici e galattopoietici. Nella realtà biologica, i due processi sono interdipendenti e
spesso un singolo ormone li esplica entrambi. Fra gli ormoni che sviluppano la ghiandola vengono
inclusi gli estrogeni, il progesterone, la prolattina, l’ormone della crescita ed il lattogeno placentare.
Gli ormoni ovarici risultano indispensabili per la crescita mammaria, mentre gli estrogeni
sembrano indurre un accumulo di recettori per il progesterone e la prolattina, che sono responsabili
della moltiplicazione cellulare. Gli ormoni dell’ipofisi anteriore e quelli placentari sembrano essere
più importanti, in quanto, se non presenti, annullano l’efficacia degli ormoni steroidei. La placenta
dei ruminanti sintetizza e secerne un ormone lattogeno, detto PL (Placental Lactogens), che risulta
simile dal punto di vista chimico e biologico alla prolattina ed all’ ormone della crescita.
1.1.3 - LATTOGENESI
La lattogenesi è un processo di differenziazione, attraverso il quale le cellule alveolari mammarie
acquistano la capacità di secernere il latte. Si hanno due stadi: nel primo si osservano le
differenziazioni citologiche ed enzimatiche delle cellule, mentre nel successivo si dà l’avvio alla
sintesi del secreto mammario. Il progesterone (P4) ha un ruolo inibitorio sulla lattogenesi, in quanto
limita la secrezione di prolattina, per cui pare chiaro che la sua caduta al termine della gravidanza
costituisce uno dei segnali per l’avvio della sintesi del latte. Il P4, inoltre, inibisce la sintesi di
α-lattoalbumine e di conseguenza del lattosio, in mancanza del quale viene impedito il passaggio di
acqua all’interno della cellula secernente, inibendo così la sintesi del latte. Il ruolo del P4 durante la
lattazione è scarso, in quanto è in gran parte sequestrato nel grasso del latte. Contrariamente a
quanto avviene durante la gravidanza, in cui alti tassi di P4 competono con i corticosteroidei sui siti
attivi recettoriali delle cellule secernenti, in lattazione sono invece i corticoidi ad occupare i
recettori mammari. Gli estrogeni hanno invece un effetto positivo sulla lattogenesi, in quanto
mediano un aumento della prolattina in circolo. La prolattina (PRL), infatti, è un fattore
indispensabile, che sblocca la sintesi delle caseine; questa induzione si accompagna ad un accumulo
di RNA nella cellula e ad una accelerazione della trascrizione dei geni corrispondenti. Nelle bovine,
la concentrazione di PRL è correlata positivamente alla produzione lattea, ma i coefficienti risultano
bassi. La secrezione di PRL è influenzata dalla temperatura, dalla stagione, dal fotoperiodo e dagli
stimoli portati al capezzolo, che comportano un aumento dell’ormone. Nei ruminanti, la lattazione è
sostenuta soprattutto dall’ormone della crescita (GH), e la quantità di PRL libera diminuisce
gradatamente col progredire della lattazione, in quanto la prolattina può esplicare la sua azione solo
se viene a contatto con i recettori della cellula mammaria. Stabilito il legame PRL - recettore, il
complesso si porta all’interno della cellula, dove determina una serie di reazioni, tra le quali un
aumento del RNA-ribosomiale, con un concomitante aumento dell’RNA-messaggero delle caseine,
il che controlla l’espressione genica delle proteine del latte. Molti di questi effetti sono amplificati
dai corticosteroidi e dall’insulina, ed inibiti dal progesterone. L’ormone della crescita, nei
ruminanti, ha un evidente effetto galattopoietico; si ritiene che agisca in modo indiretto, e la sua
azione sarebbe mediata da fattori di crescita (somatomedine), oppure dalla stessa capacità lipolitica
dell’ormone, che provocherebbe incremento dei precursori del latte in circolo. L’aumento del livello
produttivo, dopo trattamento esogeno con GH, si aggira attorno al 20% o più, se si usa ormone di
sintesi. Gli ormoni corticosteroidei amplificano l’azione della prolattina nella sintesi delle caseine
(meno nei ruminanti). Gli ormoni tiroidei, durante la lattazione, sono ridotti proporzionalmente
all’aumentare della produzione lattea, in quanto diminuiscono le concentrazioni di T3 e T4
(ipotiroidismo). Le concentrazioni di insulina sono negativamente correlate alla produzione lattea,
in quanto è bassa nella prima fase di lattazione ed elevata nell’ultima.
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9 COLOSTRO
Il secreto che si ottiene subito dopo il parto ha caratteristiche particolari e viene chiamato colostro.
E’ dotato di una certa azione lassativa, che serve per far espellere al neonato il meconio presente
nell’intestino. Il colostro differisce dal latte in quanto contiene più alto tenore in proteine, sodio e
cloro, ed un più basso tenore in lattosio e potassio. Il valore calorico è il doppio di quello del latte,
per il suo elevato contenuto in sostanze azotate, mentre nel latte è il grasso a fornire la maggior
quota di calorie. La differenza maggiore è nel diverso contenuto in immunoglobuline. Nei neonati,
infatti, il sistema immunocompetente è ancora rudimentale ed incapace di funzionare
adeguatamente. Negli ungulati (bovino, ovino, equino, suino), dato il tipo complesso di
placentazione, le grosse molecole immunoglobuliniche non passano la barriera placentare. Per
questo motivo, il colostro di queste specie animali possiede grosse concentrazioni di IgG. Nel
colostro c’è un fattore che impedisce la normale digestione delle immunoglobuline, l’assorbimento
avviene nel digiuno attraverso la via linfatica, ed il passaggio attraverso la barriera intestinale può
avvenire nelle prime 24 ore dopo il parto, poiché la permeabilità dell’epitelio, poi, tende a ridursi.
Dei 50-150 mg/ml di immunoglobuline presenti nel colostro di vacca, l’85-90% sono IgG, il 7%
circa IgM ed il 5% IgA. Le origini delle IgG è totalmente ematica, ed il passaggio dal sangue al
colostro avviene con un meccanismo di trasporto intracellulare (recettori-pinocitosi-endocitosiesocitosi). Le IgA e le IgM, invece, vengono sintetizzate dalle plasmacellule che si trovano nelle
adiacenze dell’epitelio secretorio.
1.1.4 - EIEZIONE DEL LATTE
Un riflesso neuroendocrino è preposto all’allontanamento del latte dalla ghiandola ed è costituito da
un arco riflesso, dove la componente afferente è data dagli stimoli nervosi, mentre quella efferente
dall’ossitocina. La deformazione dei meccanocettori capezzolari, determinata dalla suzione o dalla
mungitura, provoca l’insorgenza di impulsi nervosi, che vengono trasmessi attraverso i nervi
mammari al midollo, nel quale viaggiano nel tronco dorsale spinale fino all’ipotalamo, ed in
particolare a livello delle cellule neurosecretrici dei nuclei sopraottico e paraventricolare,
responsabili della sintesi dell’ossitocina. L’ormone, legato ad una specifica proteina (neurofisina I),
con il circolo giunge alla ghiandola dove, liberato dalla componente proteica, si lega a specifici
recettori delle cellule mioepiteliali e ne determina la contrazione, che, pur causando un
considerevole aumento della pressione endomammaria, non riesce a superare la resistenza opposta
dallo sfintere del dotto papillare capezzolare, la quale può esser vinta grazie all’aiuto della suzione o
con il vuoto che viene creato in prossimità dello sfintere della mungitrice meccanica o con la
compressione esercitata dalle dita del mungitore, che mima quanto fisiologicamente avviene con la
suzione. Il riflesso può esser rafforzato e condizionato da azioni ripetitive che accompagnano la
mungitura (vista del vitello, rumori della sala di mungitura, ecc..); tuttavia, impulsi di origine
corticale possono inibire, essendo collegate ai nuclei dell’ipotalamo. Attività stressanti, che
comportano liberazione di catecolamine, provocano una riduzione della liberazione di ossitocina.
Un’aumentata attività del simpatico, inoltre, comporta un’inibizione sulla espulsione del latte.
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1.1.5 - SINTESI DEL LATTE
Le cellule alveolari secretorie della ghiandola mammaria (Fig. 3) hanno una notevole attività
metabolica. Nel loro citoplasma presentano una forte specializzazione, per meglio ottimizzare
l’efficienza e non avere interferenze nei vari passaggi.
Fig. 3 - Cellula alveolare secretoria della
ghiandola mammaria
I precursori, provenienti dai componenti della dieta (Fig. 4), vengono trasportati attraverso la
membrana basale cellulare, mentre il nucleo provvede alla sintesi di RNA-messaggero ed RNAribosomiale. Il reticolo endoplasmatico ha un sistema di canali, che dal nucleo pervade tutto il
citoplasma, il quale provvede alla sintesi delle proteine e dei fosfolipidi, alla esterificazione degli
acidi grassi per la formazione dei acilgliceroli ed alla loro dissaturazione. L’apparato del Golgi
sintetizza il lattosio; in esso avviene la glicosilazione e fosforilazione delle proteine. I mitocondri
producono energia, sottoforma di ATP, e sono deputati alla formazione dei precursori degli acidi
grassi e degli aminoacidi non essenziali.
Fig. 4 - Passaggi schematici della
conversione dei componenti della
dieta i componenti del latte
Nel citoplasma avviene la formazione dell’α-glicerofosfato, la sintesi degli acidi grassi,
l’attivazione degli aminoacidi per la sintesi proteica e la produzione del NADPH. I microtubuli ed i
microfilamenti contribuiscono al meccanismo secretorio del latte. La membrana, con la sua
permeabilità, influenza il passaggio di molecole, degli elettroliti e di acqua, sia in entrata che in
uscita dalla cellula e nei medesimi organuli citoplasmatici. Il glucosio, contrariamente al lattosio,
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attraversa la membrana del Golgi; il citrato esce dal mitocondrio, ma non ci rientra. La quantità e la
qualità dei substrati disponibili per la sintesi del latte influenzano il livello secretivo, oltre,
naturalmente, al numero ed all’attività metabolica delle cellule alveolari. E’ importante il flusso
mammario, che nei soggetti in piena lattazione raggiunge il 15% della gittata cardiaca (Tab. 1). I
principali substrati ematici che la mammella utilizza sono il glucosio, gli acidi grassi, i minerali e
l’acetato. La bovina utilizza l’acetato come fonte energetica.
Costituenti
Acqua
Glucosio
Lattosio
Aminoacidi liberi
Caseine
β-lattoglobulina
α−lattoglobulina
Immunoglobuline
Albumina
Triacilgliceridi
Fosfolipidi
Acido citrico
Acido orotico
Calcio
Fosforo
Sodio
Potassio
Cloro
Sangue (g/dl)
91
0.05
0
0,02
0
0
0
2,6
3,2
0,06
0,25
tracce
0
0,01
0,01
0,34
0,025
0,35
Latte (g/dl)
86
tracce
4,6
tracce
2,8
0,32
0,13
0,07
0,05
3,7
0,035
0,18
0,008
0,13
0,10
0,05
0,15
0,11
Tab. 1 - Confronto tra i
costituenti del sangue e quelli
del latte bovino
Biosintesi del grasso
I grassi presenti nel latte forniscono la quota maggiore di energia per il neonato e sono secreti sotto
forma di globuli, compresi in una membrana che li rende compatibili alla fase acquosa del latte. I
grassi sono la maggior componente del latte e sono composti prevalentemente da trigliceridi, in
misura pari al 97-98% (Fig. 5). Il latte di vacca contiene circa l’1% di altri tipi di grassi (0,28-0,59%
diacilgliceridi, 0,2-1% fosfolipidi e 0,02-0,04% monoacilgliceridi).
Fig. 5 - Formula generale di un
trigliceride, dove i gruppi R1, R2 ed R3
rappresentano acidi grassi con catene
carboniose di varia lunghezza
13
Circa il 50% del grasso deriva direttamente dai grassi a lunga catena della dieta, delle sintesi
ruminali e dei lipidi di riserva corporea. Il rimanente 50% deriva dalla neosintesi a partire dagli
acidi grassi volatili acido acetico e OH-butirrato, prodotti dalle fermentazioni ruminali. Le tabelle 2
e 3 mostrano la sorgente e la composizione degli acidi grassi presenti nel latte bovino.
Acido grasso
Neosintei %
C4-C10
100
0
C12
80-90
10-20
C14
30-40
60-70
C16
20-30
70-80
C18
0
100
Numero
atomi di
carbonio
C4:0
C6:0
C8:0
C10:0
C12:0
C14:0
C16:0
C18:0
C18:1
C18:2
C18:3
Nome
dell’acido
grasso
Butirrico
Capraico
Caprilico
Caprico
Laurico
Miristico
Palmitico
Stearico
Oleico
Linoleico
Linolenico
%
molare
nel latte
10
3
1
2
3
9
21
11
31
5
<1
da VLDL (Very Low Density Lipoprotein)
Tab. 2 - Sorgente
degli acidi grassi ne
latte bovino.
Tab. 3 - Composizione degli
acidi grassi nel latte bovino.
La maggior parte degli acidi grassi volatili di origine vegetale della dieta sono a lunga catena ed
insaturi. I microrganismi ruminali hanno la capacità di renderli saturi e ciò spiga l’alto tenore di
acidi grassi saturi presenti nel latte di vacca (Fig. 6). Gli acidi grassi a lunga catena vengono
assorbiti dall’intestino e legati a proteine, per essere così messi in circolo, attraverso il sistema
linfatico. Nel sangue vi sono 100 mg/l di lipoproteine: 92% HDL (Higt Density Lipoprotein), e 7%
LDL (Low Density Lipoprotein). Circa il 60-80% dei trigliceridi è rimosso dalle lipoproteine da un
enzima di membrana (lipoprotein-lipasi) ed assorbito dalla cellula mammaria.
Fig. 6 - Biosintesi degli acidi
grassi contenuti nel latte.
14
Neosintesi di acidi grassi
La neosintesi degli acidi grassi (Fig. 7) coinvolge l’acetilCoA, a partire dall’acido acetico,
utilizzato come substrato per la sintesi del malonilCoA, necessario per la formazione di catene
lunghe e per l’approvigionamento del NADPH per le fasi di riduzione della reazione. Il glucosio,
nei non ruminanti, è la fonte principale per la produzione di acetilCoA e NADP, e inoltre fornisce lo
scheletro carbonioso per la sintesi dei trigliceridi. Il glucosio viene degradato nei mitocondri a
piruvato, e poi convertito in acetilCoA, che, non essendo in grado di attraversare la membrana
mitocondriale, viene trasformato in ossaloacetato, che è, invece, in grado di diffondere rapidamente
nel citoplasma. Qui, un enzima libera l’acetilCoA . Il NADPH, nei non ruminanti, deriva dalla via
del pentoso-fosfato, dal ciclo del piruvato-malato e dalla isocitrato-deidrogenasi. Nei ruminanti,
invece, il glucosio non è utilizzato per la sintesi degli acidi grassi. L’attività dell’ATP-citrato-liasi è
bassa, e piccole quantità di acetilCoA derivano dal citrato extramitocondriale. Il ciclo del piruvato–
malato è adeguatamente presente nei tessuti. L’attività dell’acetilCoA-sintetasi, nei ruminanti in
genere, è maggiore, e fornisce quantità adeguate di acetilCoA a partire dall’acido acetico derivato
dalla fermentazione ruminale. Il primo passaggio della sintesi di acidi grassi è la conversione di
acetilCoA a malonilCoA, per mezzo dell’enzima acetilCoA-carbossilasi. L’allungamento della
catena richiede più molecole di acetilCoA attivato a malonilCoA. Questa reazione è catalizzata da
una sintetasi. Il palmitato (16 C) è il principale prodotto della neosintesi di acidi grassi. L’acido
acetico provvede al 35-45% del carbonio presente negli acidi grassi totali del latte, e da circa l’80%
di quelli di neosintesi. Il β-idrossibutirrato entra direttamente nella composizione dei trigliceridi del
latte come butirrilCoA (4 C), o viene convertito ad acetilCoA nei mitocondri. Il β-idrossibutirrato
provvede a circa l’8% dei grassi totali ed al 16-20% degli acidi grassi a catena corta di neosintesi.
Fig. 7 - Sintesi degli acidi grassi.
Sintesi dei trigliceridi
Gli acidi grassi presenti nei trigliceridi del latte hanno tre fonti principali di origine:
- non ruminanti - dal glucosio, che, con la glicolisi, viene scisso in piruvato, che entra nel ciclo
dell’acido citrico, con formazione di acetilCoA;
- dai trigliceridi presenti nel circolo ematico, come lipoproteine a bassa densità LDL;
- ruminanti - la fonte maggiore è la sintesi a partire dall’acetato e butirrato , che derivano
dall’attività microbica ruminale.
15
La biosintesi dei trigliceridi avviene preferibilmente con la via del α-3-glicerofosfato, formato
all’interno della cellula alveolare prevalentemente da glucosio, attraverso la via dell’esosofosfato.
Nei ruminanti, la quantità del glicerolo derivante dallo zucchero è pari al 60%. Gli acidi grassi liberi
vengono attivati nella via dell’α-fosfoglicerato. Dall’acidofosfatidico, dopo la rimozione del gruppo
fosfato, si ottiene l’1,2-diacilglicerolo, e, successivamente, con l’aggiunta di un’altra molecola di
acetilCoA, si ha il triacilglicerolo. A questo vengono poi aggiunti i tre acidi grassi per formare i
trigliceridi (Fig. 8).
Fig. 8 - Tappe principali per la sintesi di
una molecola di trigliceride.
Biosintesi del lattosio
Solo la ghiandola mammaria è in grado di produrre il principale carboidrato del latte, ed anche
quello più presente in natura. Il lattosio è costituito da una molecola di glucosio ed una di galattosio,
con legame β tra il carbonio 1 del galattosio ed il carbonio 4 del glucosio (Fig. 9).
Fig. 9 - Struttura chimica di una molecola di
lattosio.
La prima reazione necessaria per la sintesi di lattosio (Fig. 10) è irreversibile, ed avviene nel
citoplasma. Le successive tre reazioni sono in equilibrio, sono reversibili, e dipendono dalle
concentrazioni del precursore e del prodotto finale. La quinta, ed ultima, reazione avviene
nell’apparato del Golgi, e necessita della presenza di ioni magnesio: il glucosio e l’UDPgalattosio
sono trasportati al suo interno, e sono trasformati in lattosio, sotto controllo positivo da parte della
prolattina e negativo dal progesterone.
16
Fig. 10 - Le 5 tappe necessarie per la
biosintesi di lattosio nel latte.
L’enzima necessario per la sintesi del lattosio è formato da due proteine, la udp-galattosiltrasferasi,
legata alla membrana del Golgi, e l’α-lattoalbumina libera. Il vantaggio del lattosio rispetto al
monosaccaride glucosio sta nel fatto che dà il doppio delle calorie ed esercita metà della pressione
osmotica, a parità di peso molecolare. Nella ghiandola mammaria dei ruminanti, il glucosio deriva
dal circolo ematico per il 65-75% [1].
Biosintesi delle proteine
I precursori delle proteine provengono dagli aminoacidi delle proteine alimentari, che sono
degradate nell’intestino. Uno schema generale per la sintesi delle proteine del latte prevede:
1. passaggio dei precursori (aminoacidi) dal sangue al liquido extracellulare;
2. assunzione cellulare di aminoacidi tramite carrier specifici per gruppi di aminoacidi, con
richiesta di energia;
3. attivazione del sistema di trascrizione dei geni che codificano la sintesi del latte in RNAmessaggero;
4. Trasporto, da parte dell’RNA-messaggero, dell’informazione dal nucleo ai ribosomi
dell’ergastoplasma;
5. in presenza di ATP, formazione dei composti aminoacil-RNA-transfer, specifici per singoli
aminoacidi.
6. traslocazione delle proteine verso la membrana apicale, tramite l’apparato del Golgi.
7. passaggio delle proteine attraverso la membrana, per pinocitosi inversa.
17
1.2 - COMPOSIZIONE BIOCHIMICA E CELLULARE
Fisicamente, il latte è costituito da una soluzione acquosa di sali, carboidrati ed altri composti, fra
cui globuli lipidici in emulsione ed una miscela di proteine in dispersione colloidale. Il valore
calorico del latte secreto in tutte le specie deriva in misura costante dalla somma delle calorie
fornite dalle proteine e dai glucidi (50-100kcal/100ml); il restante valore energetico, fino ad arrivare
anche a 500 kcal/dl, è fornito dai grassi.
Questo alimento si caratterizza per gli apporti in proteine di elevata qualità biologica (lattalbumina e
caseina) ed in calcio, nutriente essenziale che deve essere assunto giornalmente con gli alimenti. Il
calcio contenuto nel latte è particolarmente facile da assorbire e da utilizzare, contrariamente a
quello presente in certi prodotti vegetali, in particolare nei cereali. Alcune sostanze di cui sono
ricchi i prodotti vegetali (come l’acido fitico e l’acido ossalico), infatti, tendono a legare il minerale,
rendendolo più difficilmente utilizzabile per il nostro organismo.
Il fosforo è un altro importante minerale presente nel latte; è importante che il calcio ed il fosforo
siano fra loro in un rapporto eguale o superiore all’unità. Infatti, una eccessiva introduzione di
fosforo, associata a diete troppo ricche di proteine, può portare a consistenti perdite di calcio, che
possono causare anche la demineralizzazione delle ossa.
In quasi tutti gli alimenti di più largo consumo, come cereali, patate, legumi, carne e uova, il fosforo
prevale sul calcio; il latte e i prodotti lattiero-caseari, invece, sono fra i pochissimi cibi che
contengono più calcio che fosforo e svolgono un ruolo di riequilibrio in diete che altrimenti
sarebbero rachitogene.
Un litro di latte crudo intero contiene mediamente 35 grammi di proteine, 37 grammi di grassi, 45
grammi di zuccheri e 10 grammi di sali minerali.
1.2.1 - L’ACQUA
Costituisce circa il 60% del corpo umano, quindi risulta essenziale per la sopravvivenza del
nostro organismo. E’ possibile digiunare per periodi molto prolungati senza incorrere in gravi
complicazioni irreversibili, ma sono sufficienti 48 ore di mancato apporto idrico per incorrere
in alterazioni metaboliche di rilievo. Il fabbisogno medio giornaliero di acqua è di circa 2,5
litri, dei quali il primo 50% viene assunto tramite i cibi di una normale dieta bilanciata e la
restante percentuale tramite ingestione diretta del liquido. L’acqua non apporta calorie e quindi
non fa ingrassare, anzi dovrebbe essere bevuta abbondantemente durante le diete dimagranti,
incrementando così l’eliminazione delle tossine. E’ particolarmente importante bere acqua al
mattino ed alla sera prima di coricarsi, in modo tale da stimolare l’attività renale. Si consiglia
di bere con moderazione durante i pasti e più abbondantemente al termine dei periodi digestivi,
il che migliora globalmente l’efficienza digestiva dello stomaco. L’acqua è presente nel latte in
ragione di oltre l’80%.
18
1.2.2 - LE PROTEINE
Le proteine del latte, rappresentate dall’80% da caseina e dal 20% dalla lattalbumina,
assicurano un terzo del fabbisogno giornaliero medio. Le caseine si suddividono in quattro
sottotipi: α1 (38%), α2 (10%), k (13%) e β (38%). Esiste anche una frazione γ, che costituisce
un frammento della β (Tab. 4). Queste frazioni proteiche sono aggregate tra loro a formare dei
granuli insolubili, denominati micelle. Dopo separazione delle caseine, rimangono in soluzione
le proteine del siero β-lattoglobulina (50%) e le α-lattoalbumine (20%), che giocano un ruolo
fondamentale nella sintesi del lattosio. Proteine minori sono enzimi che derivano dal sangue e
dagli organi che questo per fonde, o dalle cellule secretici stesse.
Tab. 4 - Frazioni proteiche contenute
nel latte bovino.
Le proteine del latte contengono nelle giuste quantità e proporzioni tutti gli aminoacidi di cui
l’organismo ha bisogno, ed in particolare quegli aminoacidi essenziali che l’organismo non è
in grado di fabbricare (Tab. 5).
Tab. 5 - Aminoacidi contenuti nel latte
bovino e suino.
Questi aminoacidi contribuiscono attivamente al processo rinnovativo dei tessuti e delle cellule
del nostro organismo. In alcuni casi estremi, come in caso di digiuno prolungato, possono
essere anche una fonte di energia di riserva e possono fornire fino a 4 kcal per ogni grammo di
proteina. Il fabbisogno giornaliero medio è di circa 1 grammo di proteine per ogni kg di peso
corporeo. Le proteine possono essere classificate in due tipi fondamentali:
•
•
Proteine di origine animale: vengono definite ad alto valore biologico e sono presenti
nelle carni, nelle uova, nel latte, e nei loro derivati.
Proteine di origine vegetale: sono presenti nei legumi e nei cereali.
Si consiglia l’uso giornaliero al 50% di entrambi i tipi di proteine [3].
19
1.2.3 - I LIPIDI
I lipidi, o grassi, sono i nutrienti ad alto potere calorico. Infatti, 1 grammo di grasso fornisce
circa 9 kcal. I grassi introdotti nel corpo umano vengono raccolti all’interno dei tessuti adiposi,
pronti per essere utilizzati ad ogni fabbisogno energetico delle cellule. I lipidi svolgono anche
altre funzioni, quali la termoregolazione del corpo umano ed il mantenimento
dell’aggregazione delle vitamine liposolubili. Possono essere classificati in:
•
•
Grassi saturi : presenti specialmente negli alimenti di origine animale (carni, salumi,
burro, formaggio e latte).
Grassi insaturi : presenti negli alimenti di origine vegetale (olio di semi, di oliva e
pesce).
Il 99% dei lipidi è riunito in globuli, con diametro variabile tra 0,2 e 15 nm, che sono
circondati da una membrana formata da proteine specifiche, fosfolipidi, glicoproteine,
colesterolo, caroteni e gliceridi ad alto punto di fusione. Le proteine di membrana
costituiscono l’1% delle proteine totali. Questi lipidi sono formati principalmente da glicerolo
esterificato con acidi grassi saturi, con numero pari di atomi di carbonio da 2 a 20, e da acidi
grassi insaturi. I trigliceridi sono tra questi i più abbondanti (97-98%). Nei ruminanti, sono
particolarmente importanti gli acidi grassi a catena corta (ad esempio, l’acido butirrico).
In una dieta normale, si raccomanda un apporto di grassi giornaliero pari al 30% del
fabbisogno calorico totale. E’ bene, comunque, evitare un uso eccessivo di lipidi, preferendo
comunque, se possibile, quelli di origine vegetale.
Le percentuali di grassi saturi presenti nel latte sono variabili (Tab. 6) ed in funzione del tipo
medesimo di prodotto (latte scremato, in polvere, ecc.). I grassi presenti nel latte di mucca
sono per due terzi saturi, caratterizzati da buona digeribilità, e con ridotte attitudini ad elevare i
livelli di colesterolo nel sangue [4].
Nella vacca, la mammella può sintetizzare acidi grassi partendo dall’acido acetico, proprionico
e butirrico.
Specie
Acqua Grassi Caseina proteine
del siero
Coniglio 67,2
15,3
9,3
4,6
Cavallo
88,8
1,9
1,3
1,2
Bovino
87,3
3,9
2,6
0,6
Pecora
82
7,2
3,9
0,7
Capra
86,7
4,5
2,6
0,6
Cane
76,4
10,7
5,1
2,3
Suino
81,2
6,8
2,8
2
Foca
34,6
53,2
4,6
4,3
Elefante 78,1
11,6
1,9
3
Lattosio ceneri kcal/100g
2,1
6,2
5
4,8
4,3
3,3
5,5
0,1
4,7
1,8
0,5
0,8
0,9
0,8
1,2
1
0,5
0,7
202
52
70
102
70
139
102
516
143
Tab. 6 - Composizione del
latte di alcune specie animali.
20
1.2.4 - I GLUCIDI
Nel latte, i carboidrati sono rappresentati unicamente dal lattosio, che non si trova in nessun
altro alimento ed e’ importante per lo sviluppo del tessuto nervoso nei primi mesi di vita [4].
Comunque, sono state messe in evidenza piccole quantità di glucosio e galattosio libere,
glicopeptidi e glicoproteine, la presenza dei quali riflette la complessità del secreto mammario.
I glucidi rappresentano la principale fonte energetica immediatamente disponibile alle esigenze
energetiche del corpo umano. In una dieta bilanciata, i glucidi devono rappresentare il 55%
delle calorie introdotte giornalmente. Essi hanno potere calorico pari a 4 kcal/g. Possono essere
classificati in:
•
•
Glucidi semplici : presenti nello zucchero, nella frutta, nel miele, nelle bibite e nel latte
(glucosio, fruttosio e galattosio).
Glucidi complessi : presenti nelle farine, nel pane, nei legumi, nella pasta, nelle patate
e nel riso (amido).
Si consiglia l’uso giornaliero del 90% di glucidi complessi ed il restante 10% di glucidi
semplici. Il latte contiene una buona percentuale di glucidi semplici.
1.2.5 - I SALI MINERALI
I sali minerali svolgono importantissime funzioni di sostegno e di regolazione dell’equilibrio
idrosalino ed osmotico, e di catalisi nei processi metabolici. Essi sono, quindi, dei fattori
essenziali per il buon funzionamento dell’organismo. I sali minerali devono essere introdotti
giornalmente nel nostro organismo, anche se ne sono necessarie piccole quantità. Se un
determinato soggetto si alimenta con una dieta varia e razionale, il fabbisogno giornaliero di
sali minerali è sicuramente pienamente soddisfatto. I sali minerali sono danneggiati dal calore
e dalla luce, quindi vengono parzialmente persi durante la cottura dei cibi. La tabella 7
riportata una semplice guida ai minerali, presenti in quantità variabili e differenti nel latte.
Minerali
Sigle
Sintomi di carenza
Calcio
Ca
Arresto della crescita, rachitismo, osteomalacia e convulsioni
Fosforo
P
Debolezza, demineralizzazione delle ossa e perdita di calcio
Magnesio
Mg
Blocco della crescita, disturbi del comportamento e spasimi
Sodio
Na
Crampi muscolari, apatia mentale e appetito ridotto
Potassio
K
Debolezza muscolare e paralisi
Cloro
Cl
Crampi muscolari, apatia mentale e appetito ridotto
Zolfo
S
Relativi alla mancanza di aminoacidi solforati
Ferro
Fe
Anemia da carenza di ferro (ipocromia)
Zinco
Zn
Arresto della crescita e ipogonadismo
Iodio
I
Ipotiroidismo (diminuzione del metabolismo)
Rame
Cu
Anemia
Fluoro
F
Deterioramento dei denti
Manganese
Mn
Non accertati
Cromo
Cr
Riduzione della capacità di metabolizzare il glucosio
Selenio
Se
Non accertati
Molibdeno
Mo
Non accertati
Tab. 7 - Guida ai minerali presenti
nel latte.
21
I sali minerali sono divisi tradizionalmente in macroelementi (calcio, magnesio, fosforo, sodio,
potassio e cloro) e microelementi (rame, ferro, zinco, manganese, cobalto, fluoro, selenio, iodio ed
altri). Nel latte, il calcio è il più abbondante tra tutti gli elementi, anche se solo il 25% è in forma
solubile, mentre il rimanente è combinato con caseinati, fosfati e citrati; il magnesio ed il fosforo
sono in forma insolubile, mentre il sodio, il potassio ed il cloro sono in soluzione.
1.2.6 - LE VITAMINE
Le vitamine sono essenziali per il normale funzionamento dell’organismo umano, in quanto
intervengono in tutte le reazioni che avvengono nel nostro corpo. Il nostro organismo non è in
grado di sintetizzarle (tranne alcune eccezioni) e pertanto devono essere introdotte con gli
alimenti. Esse si dividono in idrosolubili e liposolubili: le prime possono essere sciolte in
acqua, e quindi facilmente eliminate, mentre questo non è possibile per le seconde che, se
assunte in eccesso, possono dare ipervitaminosi. Percontro, una carenza spinta di vitamine
(avitaminosi) determina delle malattie ben definite per ogni singola vitamina. Le carenze
vitaminiche sono molto diffuse, anche nei ricchi paesi occidentali, infatti esse possono essere
determinate da diete troppo monotone, da diete dimagranti squilibrate, da diminuito
assorbimento intestinale, da repentino aumento del fabbisogno (crescita, gravidanza,
allattamento), da uso ed abuso di farmaci e da fattori patologici (alcolismo, malattie infettive,
tumori, ecc.). La cottura prolungata dei cibi o la loro esposizione prolungata alla luce del sole
possono danneggiare alcuni tipi di vitamine. Di seguito viene riportata una semplice guida alle
vitamine (Tab. 8), quasi tutte presenti in quantità variabili e differenti nel latte.
Vitamine
Sintomi da carenza
C
Scorbuto, perdita dei denti, pelle secca e ruvida,
(Acido ascorbico) piaghe ed emorragie
B1
(Tiamina)
Beri-beri, confusione mentale, crampi, debolezza
muscolare e dilatazione cardiaca
B2
(Riboflavina)
Lesioni alla pelle e sensibilità alla luce
PP
(Niacina)
Lesioni alla pelle, sensibilità alla luce, pellagra,
demenza, lingua liscia, diarrea, confusione mentale e
irritabilità
Idrosolubili B6
(Piridossina)
Lesioni alla pelle, lingua liscia, convulsioni,
vertigini, anemia e calcoli renali
Folacina
(Acido folico)
Anemia megaloblastica, lingua liscia e diarrea
B12
(Cobalamina)
Anemia megaloblastica ipercronica, anemia
perniciosa, degenerazione dei nervi periferici
Acido pantotenico
Non accertati (vomito, dolori addominali,
affaticamento e insonnia)
Biotina
Non accertati (affaticamento, depressione, nausea,
perdita di appetito e dolori)
A
(Retinolo)
Cecità notturna, pelle rugosa, ridotta crescita, caduta
dei denti e ulcerazioni della cornea
D
Liposolubili (Calciferolo)
Tab. 7 - Guida alle vitamine
presenti nel latte.
Rachitismo, ritardo di crescita, gambe curve,
addome sporgente, osteomalacia e spasimi
muscolari
E
(Tocoferolo)
Danno ai globuli rossi
K
Emorragie
22
La mammella non sintetizza le vitamine, pertanto quelle presenti nel latte derivano dal sangue, il
quale ne sarà più o meno ricco, a seconda di quanto ricava dall’apparato digerente (Tab. 8) [3].
Vitamine
Vitamina A
Colecalciferolo
Tiamina B1
Riboflavina B2
Niacina
Pirossidina B6
Acido pantotenico
Biotina
Acido folico
Cobalamina B12
Acido ascorbico
Colina
latte umano mg/l latte bovino mg/l
0,7
0,5
0,0005
0,0004
0,16
044
0,36
1,72
1,47
0,94
0,10
0,64
1,84
3,46
0,008
0,031
0,030
0,05
0,0003
0,0043
43
21
90
121
Tab. 8 - Confronto del contenuto in
vitamine tra latte umano e latte bovino.
1.2.7 - I PARAMETRI QUALITATIVI DEL LATTE
La carica batterica
E’ il numero di microrganismi (microbi) che inquinano il latte. Il latte che esce dalla mammella
sana è praticamente quasi privo di microrganismi, e quelli presenti provengono esclusivamente
dall’ambiente esterno. Il numero di microrganismi può aumentare per:
- inquinamento nei passaggi dalla mammella (mani, guaine, condutture) al contenitore refrigerato;
- esposizione del latte all’aria ;
- non perfetto funzionamento dei frigoriferi della fattoria, che si rivelano inadeguati alle temperature
ambientali esterne.
L’aumento della carica microbica avviene, infatti, se il latte è mantenuto ad una temperatura
superiore ai 4 gradi. D’estate, non a caso, è più difficile mantenere bassa la carica batterica nel latte.
Gli interventi da effettuare in caso di contaminazione sono, quindi, sull’igiene delle persone addette
alla mungitura, sull’igiene dell’ambiente in cui vivono gli animali, a partire dalle lettiere fino
all’intera struttura della stalla, e sul corretto funzionamento degli impianti di refrigerazione, fattori
che vengono sottoposti a controllo periodico.
23
Le cellule somatiche
Sono i leucociti (globuli bianchi del sangue) e le cellule di sfaldamento provenienti dal tessuto
mammario presenti nel latte. La conta delle cellule somatiche serve a misurare il grado di sofferenza
della mammella, dovuta a maltrattamenti, infiammazioni, mastiti sub-cliniche o manifeste. In
normali condizioni di salute, la loro presenza si arresta su valori di 100.000 - 150.000 unità per ml
di latte. Anche in questo caso il controllo avviene attraverso esami periodici. Assicurano un giusto
livello di cellule somatiche nel latte fattori come l’igiene della stalla e di tutto l’ambiente
circostante, ed un rispetto generale delle norme igienico-sanitarie da parte di tutto il personale
addetto.
Ogni animale nella fattoria biologica è controllato dai veterinari, in maniera tale da evitare la
presenza di mastiti (malattie della mammella) ma anche al fine di garantire che l’intervento clinico,
la profilassi e la terapia siano correttamente effettuati dall’allevatore. Le cellule, infatti,
rappresentano il parametro sanitario più importante fra quelli analizzati abitualmente nel latte. La
conta nel latte, con metodo optofluorometrico, interessa esclusivamente cellule integre, e quindi
essenzialmente gli elementi della serie bianca del sangue, che migrano da questa sede verso i tessuti
ghiandolari della mammella a scopo di difesa.
Un aumento delle cellule da valori normali, inferiori alle 200 mila per ml, indica uno stato di
infiammazione più o meno grave, se riferito alla singola bovina, od uno stato sanitario carente, se
riferito in generale a tutto l’allevamento.
L’aumento delle cellule ha una causalità multifattoriale; le infiammazioni della mammella sono,
infatti, sostenute da batteri mastitogeni, anche se il loro intervento spesso non è primario, ma
mediato da fattori predisponesti, quali:
• errata gestione della mungitura, ossia mungiture non complete o troppo prolungate e
problemi meccanici legati ai flussi di latte o ad alterate applicazioni del vuoto;
• scarsa igiene degli ambienti e scarsa igiene durante le fasi di mungitura, pratiche non
corrette di disinfezione dei capezzoli;
• razioni alimentari non bilanciate, contenenti eccessi energetici o proteici;
• carente monitoraggio sullo stato sanitario della mandria, che non permette tempestivi
trattamenti dei casi diagnosticati e la pianificazione delle terapie.
L’aumento di cellule nel latte si traduce essenzialmente in una notevole perdita economica,
derivante principalmente da questi fattori [5]:
•
•
•
•
diminuzione della produzione di latte e, per il latte prodotto, diminuzione dei contenuti di
caseina;
spese di ordine sanitario per terapie, sospensione delle produzioni e, nei casi estremi,
riforma dell’animale;
penalizzazioni nei sistemi di pagamento del latte a qualità;
deprezzamento del formaggio per anomalie derivanti da alterate caratteristiche tecnologiche
del latte.
24
Residui di farmaci
Una categoria importante di farmaci usati per la cura delle bovine è quella degli antibiotici, sostanze
che uccidono o impediscono lo sviluppo di batteri. Tali farmaci devono essere impiegati secondo le
prescrizioni del veterinario. Infatti, il latte che contiene antibiotici non è idoneo per l’alimentazione
umana. Molte persone sono sensibili a questi farmaci e possono presentare reazioni allergiche più o
meno gravi. Ogni qualvolta si somministra un antibiotico ad un animale in lattazione se ne
riscontrano inevitabilmente le tracce nel latte ed occorre un certo numero di giorni per eliminarlo
completamente. Ed è per questo motivo che il latte degli animali in terapia viene eliminato e,
naturalmente, non arriva sul mercato.
Nel latte possono esser reperiti pesticidi-erbicidi e fungicidi, soprattutto gli organoclorurati, data la
loro natura lipofila, ma anche organofosfati e carbammati [3].
25
1.3 - TRATTAMENTI DEL LATTE PER LA COMMERCIALIZZAZIONE
1.3.1 - PROCESSI INDUSTRIALI
Sul mercato italiano troviamo disponibili diversi tipi di latte, ottenuti da specie animali diverse
(Tab. 9) [6].
IL LATTE REPERIBILE IN ITALIA
Tipi di latte
Contenuti
(%)
Energia
(kcal x
Acqua Proteine Lipidi Glucidi 100 g)
Capra
86,3
3,9
4,3
4,7
72
Pecora
82,7
5,3
6,9
5,2
103
Intero*
87,3
3,18
3,64
4,72
61
Parzialmente
scremato*
88,5
3,5
1,8
5
49
Scremato*
90,5
3,6
0,2
5,3
36
Condensato**
26,5
8,7
9
56,5
327
Evaporato
74
7
8,2
8,6
134
In polvere
intero
3,2
25,7
24,9
42
484
In polvere
semiscremato
4,2
28,8
12,7
50,2
418
In polvere
scremato
5
33,1
0,9
56,2
351
Tab. 9 - Confronto tra alcuni tipi di latte
reperibili sul mercato italiano.
* = di vacca ** = zuccherato
Il latte in commercio, di qualunque tipo sia, deve rispondere a strette caratteristiche, che sono
definite dalla legge mediante una specifica normativa. Esistono diversi trattamenti che il latte può
subire prima di essere immesso sul mercato:
•
Raffreddamento
Il primo trattamento avviene nella sala mungitura. Qui il latte, che esce dalle mammelle delle
mucche con una temperatura di 37° C circa, viene convogliato in serbatoi chiusi, dove è raffreddato
e conservato a 4° C. Con questa temperatura i batteri si riproducono più lentamente che d’ordinario.
In seguito, il latte viene trasferito sulle autobotti coibentate, che lo trasportano ai caseifici per la
trasformazione in prodotto finito.
Tutti i trattamenti, inoltre, si concludono anche con il raffreddamento. A 4°C, infatti, il latte fresco
si conserva per 4-5 giorni, attraverso la catena del freddo, che comincia nel camion frigorifero, per
la distribuzione in città, continua nel banco frigorifero del lattaio, e termina nel frigorifero di casa.
26
•
Pastorizzazione bassa
Questo trattamento, ormai desueto, si applica oggi solo in presenza di latte a minimo rischio di
contaminazione, che viene portato a 65°C per un periodo di 30 minuti. L’evoluzione genetica di
taluni batteri, però, rende comunque assai poco efficace il trattamento per usi di alimentazione
diretta.
•
Pastorizzazione
La pastorizzazione, che prende il nome da Louis Pasteur, chimico francese che nel 1865 era alla
ricerca di metodi per frenare l’epidemia di vaiolo in Francia, è il processo di riscaldamento cui
vengono sottoposti il latte o altri prodotti alimentari. Generalmente, sono condotti a temperature
variabili da 54 a 70 °C e per tempi compresi tra i 20 ed i 30 minuti.
•
Pastorizzazione rapida HTST (High Temperature Short Time)
Il latte, dopo il preriscaldamento, è portato ad una temperatura di 72°C, per almeno 15 secondi.
Questa temperatura uccide circa il 96% dei batteri, mentre resta un 5% costituito dalle spore, cioè
da batteri che si sono trasformati in una forma molto resistente al calore. Per rallentare la crescita
dei batteri rimasti, il latte viene subito raffreddato a 4°C. La protrazione del tempo di trattamento, o
l’adozione di temperature superiori, incide sulla coagulazione, arrecando notevoli danni alla
produzione casearia, per la quale questo trattamento è usato. Il latte pastorizzato può essere
conservato a 4°C per quattro giorni [7]. Secondo lo scienziato Norman Walker, infatti, si richiedono
temperature da 87 a 110 °C per uccidere i microrganismi patogeni, come gli agenti del tifo, i
colibacilli, i micobatteri e le brucelle. Inoltre, il calore della pastorizzazione è sufficiente per
distruggere i batteri lattici, come il Lactobacillus acidophilus, che contribuiscono a sintetizzare la
vitamina B nel colon e a tenere i batteri della putrefazione sotto controllo, acidificando il latte. Il
latte pastorizzato, non avendo questa protezione, si potrà alterare. Comunque, la pastorizzazione
consente di distruggere completamente i germi patogeni, mantenendo pressocchè inalterato il valore
nutritivo del latte.
Secondo la legge italiana, il latte pastorizzato si distingue in tre grandi categorie:
* Latte pastorizzato
* Latte fresco pastorizzato
* Latte fresco pastorizzato di Alta Qualità
Il latte di Alta Qualità è quello che, per le caratteristiche di produzione e per i benefici offerti dal
punto di vista alimentare, rappresenta il miglior latte pastorizzato. Alta qualità non è uno slogan
commerciale sulla bontà del prodotto, ma una vera e propria categoria merceologica, indicata dalla
legge n° 169 del 3/5/1989. I requisiti necessari affinché il latte fresco pastorizzato sia definito di
Alta Qualità sono così rigorosi che poche aziende italiane sono oggi in grado di proporre questo tipo
di latte. Queste condizioni, che sono continuamente sottoposte a controllo, riguardano la selezione e
lo stato di salute delle razze bovine, la loro alimentazione, l’igiene delle stalle, le condizioni di
mungitura, la raccolta e la distribuzione, la struttura della centrale di lavorazione, i trattamenti
termici ed il confezionamento del latte. Il latte fresco pastorizzato di Alta Qualità è, per legge, solo
del tipo intero, ed e’ un tipo di latte che ha caratteristiche nutrizionali particolari rispetto a tutti gli
altri. Il contenuto di proteine nel latte crudo destinato all’Alta Qualità è infatti di 32 grammi per
litro, contro i 28 grammi per quello destinato al latte fresco pastorizzato. Inoltre, la percentuale di
sieroproteine, che, tra l’altro, favoriscono il sistema immunitario dell’organismo, e’
27
significativamente maggiore nel latte di Alta Qualità confezionato, rispetto al normale latte fresco
pastorizzato [3].
•
Pastorizzazione con microfiltrazione
Prevede la separazione della panna cruda, il preriscaldamento del latte crudo a 45-55°C, la
microfiltrazione, l’omogeneizzazione ed il riscaldamento della panna cruda, la ricombinazione delle
due componenti e, per finire, la pastorizzazione. Questo tipo di latte ha delle caratteristiche
compositive, igienico-sanitarie, nutrizionali e sensoriali del tutto simili a quelle del latte fresco, e
mantiene inalterate le sue caratteristiche organolettiche per 7-8 giorni. Questo trattamento permette
di eliminare la quasi totalità dei batteri presenti e permette di aumentare il tempo di conservazione
del latte senza diminuirne il valore nutritivo [4].
•
Sterilizzazione
Trattato in contenitore sigillato, questo tipo di latte può presentare un sapore di cotto. È il
trattamento termico più energico, che assicura la completa eliminazione di tutti i batteri, anche delle
spore. Il metodo più usato è l’upperizzazione: si riscalda il latte con vapor acqueo ad una
temperatura molto alta, circa 120° C, per periodi variabili fra i 20 e i 30 minuti. Il latte, così
sterilizzato, ha una lunga conservazione, a temperatura ambiente, che va dai 4 ai 6 mesi. Tuttavia,
una volta che si è aperto un cartone di latte sterilizzato, è necessario tenerlo in frigorifero e
consumarlo entro pochi giorni, in quanto viene a contatto con i microrganismi presenti
nell’ambiente. Il latte sterilizzato è rilevantemente più sicuro del latte UHT dal punto di vista
batteriologico, ma ha perso la gran parte dei contenuti nutrizionali, e taluni dubitano
dell’opportunità della sua assunzione, poiché causa diminuzione delle vitamine e alterazione del
calcio [7].
•
Omogeneizzazione
E’ un processo meccanico che consente di frazionare le particelle di grasso in minutissime
goccioline, per distribuirle uniformemente e permanentemente. Con la omogeneizzazione si ottiene
una migliore digeribilità del latte. Il contenuto di grasso e’ stato sottoposto ad alte pressioni e fatto
passare attraverso fori sottilissimi per la rottura dei globuli [4].
•
U.H.T.
Trattamento ultrarapido ad alta temperatura. Il metodo U.H.T. si propone di eliminare
completamente dal latte ogni tipo di forma batterica, patogena e non. Il trattamento viene realizzato
in ambiente sterile e consente di conservare il latte anche per 3 mesi, certamente solo se non si apre
la confezione. Infatti, una volta aperto il contenitore, il latte U.H.T. deve essere consumato entro 1
giorno, più rapidamente degli altri tipi di latte. Il latte a lunga conservazione è il tipo più diffuso; il
suo successo è dovuto al fatto che dai consumatori è ritenuto più comodo perchè dura di più.
Laboratori specializzati hanno verificato anche se è privo di inquinanti e sostanze pericolose,
mettendo alla prova le marche più diffuse, analizzandole a cominciare dall’etichetta,in molti casi
non esauriente, per finire con la degustazione. Le prove di laboratorio, per quanto riguarda
28
aflatossine, pesticidi e antibiotici sono risultate ottime per tutti i prodotti, in quanto non ne sono
state trovate tracce, anche se è stata evidenziata la presenza, in quasi tutte le confezioni, di tracce di
cadmio e cromo, ma in quantità trascurabili e non allarmanti [4].
L’U.H.T. è una particolare tecnica di sterilizzazione, che consiste nel trattare il latte, omogeneizzato
e preriscaldato a 140-150°C, attraverso l’impiego di vapor acqueo surriscaldato per circa 3 secondi.
Si parla di UHT a sistema indiretto quando la sterilizzazione del latte avviene tramite scambiatori di
calore, mentre viene detto UHT diretto quando la sterilizzazione del latte avviene in contatto diretto
con il fluido riscaldante, cioè il vapor acqueo. Successivamente, si raffredda a 15-20°C (nel sistema
diretto si opera una leggera disidratazione perché il vapore diluisce un pò il latte) e si procede al
confezionamento asettico del latte in contenitori tetra-brik. Anche il trattamento UHT non
garantisce la distruzione delle spore più resistenti; il latte UHT è, comunque, considerato a “lunga
conservazione” e si può conservare per circa 3 mesi a temperatura ambiente. Le confezioni dei vari
tipi di latte sterilizzato UHT devono riportare il termine minimo di conservazione “da consumarsi
preferibilmente entro…” (giorno, mese, anno).
Una volta aperta la confezione, il latte, indipendentemente se fresco, a lunga conservazione, UHT o
sterilizzato, deve essere conservato in ambiente refrigerato e consumato entro 3-4 giorni.
Il trattamento termico, però, a causa dell’elevata temperatura utilizzata (Tab. 10), altera in misura
variabile, denaturandole, le sieroproteine, che costituiscono il 20% circa delle proteine del latte. Le
sieroproteine denaturate vengono digerite con più facilità dagli enzimi presenti nell’apparato
gastrointestinale e, perciò, entrano più rapidamente nel circolo sanguigno. I vari procedimenti a
caldo, comunque, non hanno invece alcuna influenza sul valore nutritivo del latte, lasciando
inalterata la concentrazione di minerali e di vitamine liposolubili. Essi riducono solamente il
contenuto di vitamina B e di acido folico, che sono sensibili al calore [8].
Prodotto
Trattamento
Temperatura Durata
Latte fresco
Pastorizzazione:- 72-74 °C
trattamento rapido
15 sec.
Latte a lunga Pastorizzazione
conservazione
127 °C
1-2 sec.
Latte UHT
Trattamento a
“ultra alta
temperatura”
min. 135 °C
2-8 sec.
Latte
sterilizzato
Sterilizzazione
min. 110 °C
ca. 30
min.
Tab. 10 - Tipi di latte e
trattamenti termici [9].
29
Oltre ai procedimenti termici di pastorizzazione e sterilizzazione se ne effettuano altri, a seconda
del particolare prodotto che si vuole ottenere.
9 Scrematura
Il latte intero ha un tenore naturale in materia grassa non inferiore al 3,50% (latte intero non
normalizzato), ovvero il cui tenore di materia grassa sia stato portato almeno al 3,50% (latte intero
normalizzato). Il latte parzialmente scremato ha un contenuto in grassi pari a 1,5-1,8 grammi ogni
100 grammi di prodotto. Ha quasi lo stesso valore nutritivo del latte intero, ad eccezione dei grassi.
Può essere arricchito con le Vitamine A e D. Nel latte scremato, o magro, il grasso è stato tolto
quasi del tutto. Infatti, il suo contenuto lipidico deve essere per legge inferiore allo 0,3%. Può essere
arricchito di Vitamina A, per compensare le perdite dovute alla sottrazione di grassi [7].
9 Delattosazione
Mediante un trattamento con l’enzima lattasi, il lattosio viene scisso al 75% circa nei suoi due
componenti più semplici, ossia glucosio e galattosio, rendendo, così, il prodotto più digeribile per
tutti coloro che abbiano scarsità o mancanza di questo enzima a livello intestinale. Il lattosio può,
infatti, provocare disturbi digestivi e nutrizionali, come l’intolleranza al latte, se non è presente
nell’intestino tenue l’enzima lattasi, che lo demolisce in molecole più semplici.
9 Desodazione
Latte impoverito di sodio. Utile nelle diete iposodiche.
9 Vitaminizzazione
Latte arricchito in vitamine, soprattutto D.
9 Concentrazione e zuccheratura
Latte intero concentrato, nel quale il 60% circa dell’acqua è stata fatta evaporare sotto vuoto, a cui è
stato aggiunto zucchero, nello specifico, saccarosio. Contiene dal 40 al 45% di zucchero, l’8% di
materie grasse ed il 28% di proteine ed è, quindi, da considerare un alimento molto calorico. Mentre
l’aggiunta di Vitamina D è facoltativa, quella di Vitamina A è obbligatoria. Questo tipo di latte è
molto usato in gelateria e pasticceria.
30
9 Polverizzazione
Latte disidratato ed arricchito in Vitamine A e D (tranne il latte intero, a cui non può essere
aggiunta la Vitamina A). Ha un periodo di lunga conservazione, per l’assenza quasi totale del
substrato “acqua”, che produce irrancidimento dei grassi e proliferazione batterica, preferibilmente
a temperature al di sotto di quella ambientale. Il latte in polvere “intero” contiene minimo il 26% di
materie grasse, quello “parzialmente scremato” ne contiene il 9,5% e quello “scremato” lo 0,8%.
9 Aromatizzazione
Latte intero fresco a cui è stato aggiunto un ingrediente che gli dà sapore. Il più conosciuto è senza
dubbio il “latte al cioccolato”. Ne esistono altri tipi come il “latte al malto”, il “latte al sapore di
frutta o di vaniglia” e le bibite al latte contenenti succo di frutta [4].
Il latte alimentare è disciplinato dalle normative che regolano produzione, trasporto, lavorazione e
distribuzione, per tutelare i consumatori rispetto a qualità e salubrità. Su questo piano esso è il
prodotto della mungitura regolare, ininterrotta e completa, della mammella di animali in buono
stato di salute e di nutrizione. Nella pratica, il latte alimentare più utilizzato è quello vaccino [10].
1.3.2 - NORMATIVA IN VIGORE
L’attuale normativa che disciplina il latte, i prodotti a base di latte ed i composti a base di latte,
nonché quella in via di emanazione nella Unione Europea, si prefiggono l’obiettivo di conseguire
un elevato livello di protezione della vita e della salute dell’uomo.
Fin dagli anni ‘90, sono state stabilite norme e procedure per garantire la sicurezza alimentare e
favorire il libero scambio nell’ambito del territorio europeo.
Le norme (D.P.R. N. 54/97 ed il Regolamento del Parlamento e del Consiglio Europeo relativo
all’igiene dei prodotti alimentari), contengono disposizioni comuni relativamente alle responsabilità
dei produttori, di quelle delle Autorità deputate ai controlli, dei requisiti che gli stabilimenti sia
strutturali che operativi e tecnici, nonché quanto occorre rispettare per il riconoscimento dello
stabilimento come idoneo ad una determinata produzione, per il magazzinaggio e trasporto ed,
infine, per i bolli sanitari e, quindi, l’etichettatura (D.L.vo n. 109 del 27 gennaio 1992) per
permettere al consumatore di latte, formaggi così come di altri prodotti alimentare di origine
animale, di acquisire quante più informazioni possibili e soddisfare la legittima esigenza di sapere
l’origine ed il percorso “dai campi alla tavola” del prodotto consumato di così elevato valore
nutritivo e destinato a fasce di consumatori più esposte a rischi sia di problemi nutrizionali, sia
microbiologici e che necessitano di diete particolari come i bambini e gli anziani.
La garanzia della sicurezza igienico-sanitaria del latte e dei suoi prodotti inizia dalla stalla come
punto di “produzione” ed è a questo livello che iniziano i controlli veterinari a diversi livelli di
competenza: condizioni di allevamento (stabulazione, alimentazione, igiene della mungitura),
31
mantenimento dello stato di salute, profilassi e cura di malattie condizionate che prevedono l’uso di
terapie con farmaci. La razionale conduzione di allevamento ed i controlli veterinari devono, quindi,
fornire latte “sano”, che sarà successivamente inviato al consumo alimentare diretto come latte
fresco o entrerà in caseifici, autorizzati e sottoposti a vigilanza veterinaria, ma in cui è, soprattutto,
il produttore a garantire con procedure ben fissate, che tutte le operazioni per conseguire
l’obbiettivo di ottenere un prodotto sano, siano rispettate, garantite, verificate ed, eventualmente,
modificate, pena la perdita in termini economici nel momento in cui il consumatore vede messa in
pericolo la propria sicurezza. Il latte proprio grazie alle sue intrinseche caratteristiche è stato spesso
oggetto di varie adulterazioni, tuttavia la normativa italiana del Ministero della Salute ed il
Ministero delle Politiche agricole, tramite il proprio ente di controllo “Ispettorato Repressioni e
Frodi” deputato al controllo delle eventuali adulterazioni, prevede molte norme che fissano i limiti
massimi di sostanze che potrebbero ritrovarsi nel latte in condizioni normali, ma la cui elevata
percentuale presuppone un’aggiunta fraudolenta della stessa. Ultimo aspetto a cui viene fatto
riferimento è per alcuni prodotti a base di latte che possono essere ottenuti a partire da latte crudo e
che, per la loro natura, necessitano della fissazione della fissazione di condizioni applicabili
particolari, infine, si tiene conto di alcune tecniche particolari (prodotti tipici DOP o IPG) di
fabbricazione dei formaggi [4].
Alcuni riferimenti di Legge
Decreto Legge 28 marzo 2003 n.49
Riforma della normativa in tema di applicazione del prelievo supplementare nel settore del latte e
dei prodotti lattiero-caseari
(Gazzetta ufficiale n. 75 del 31/03/2003 )
Decreto MiPAF 21 gennaio 2003
Modalità di applicazione del regolamento CE n. 1392/2001 in materia di quote latte
(Gazzetta ufficiale n. 57 del 10/03/2003)
Decreto 27 giugno 2002 Ministero Attività Produttive
Decreto 27 giugno 2002 Ministero Attività Produttive “Etichettatura del latte fresco”
(Gazzetta ufficiale n. 160 del 10/07/2002)
Decreto 17 giugno 2002 Ministero della Salute
Decreto 17 giugno 2002 Ministero della Salute “Trattamento di microfiltrazione nel processo di
produzione del latte alimentare”
(Gazzetta ufficiale n. 178 del 31/07/2002 )
Circolare 2 agosto 2001 n.167
Ministero Attività Produttive Etichettatura e presentazione di prodotti alimentari
(Gazzetta ufficiale n. 185 del 10/08/2001)
Circolare 28 giugno 2000 n.4 Ministero delle Politiche Agricole e Forestali
Modalità per la presentazione delle istanze di registrazione delle denominazioni di origine e delle
indicazioni geografiche protette ai sensi dell’art.5 del regolamento (CEE) n. 2081/92 per
l’individuazione delle relative procedure amministrative
(Gazzetta ufficiale n. 189 del 14/08/2000 )
Legge 7 aprile 2000 n.79
Testo del decreto- legge 4 febbraio 2000, n. 8 (in Gazzetta Ufficiale - serie generale - n. 30 del 7
febbraio 2000), coordinato con la legge di conversione 7 aprile 2000, n. 79 (in questa stessa
32
Gazzetta Ufficiale, alla pag. 3), recante: “Disposizioni urgenti per la ripartizione dell’aumento
comunitario del quantitativo globale di latte e per la regolazione provvisoria del settore lattierocaseario [4].
1.3.3 - DURATA DEL LATTE PASTORIZZATO
Articolo (L. 287/90): 21 - Attività di segnalazione al Parlamento e al Governo
DATI GENERALI:
Rif: AS114 - Decisione: 18/12/97
Invio: 29/12/97
PUBBLICAZIONE:
Bollettino n.: 51/97
SEGNALAZIONE/PARERE:
Mercato interessato: (15511) Trattamento igienico e confezionamento di latte alimentare
pastorizzato e a lunga conservazione
(D) ATTIVITÀ MANIFATTURIERE
Oggetto: Legge 3 maggio 1989, n. 169, recante “Disciplina del trattamento e della
commercializzazione del latte alimentare vaccino”
Destinatari:
- Presidente del Senato della Repubblica
- Presidente della Camera dei Deputati
- Presidente del Consiglio dei Ministri
- Ministro dell’Industria, del Commercio e dell’Artigianato
- Ministro per le Risorse agricole, alimentari e forestali
- Ministro della Sanità
Testo Segnalazione/Parere [4]
1. L’art. 21 della legge 10 ottobre 1990, n. 287 conferisce all’Autorità il potere di segnalare norme
di legge che determinano distorsioni della concorrenza o del corretto funzionamento del mercato
che non siano giustificate da esigenze di interesse generale. Nello svolgimento della propria attività
istituzionale, l’Autorità ha riscontrato come il regime della scadenza del latte pastorizzato
confezionato disciplinato dall’art. 5 della legge 3 maggio 1989, n. 169, sia idoneo a determinare
alterazioni del corretto funzionamento delle relazioni concorrenziali tra le imprese operanti nel
mercato del latte fresco. Siffatta disposizione prevede infatti che il latte alimentare pastorizzato,
ossia quello prodotto dal latte crudo sottoposto al trattamento di pastorizzazione, debba essere
consumato entro i quattro giorni successivi al confezionamento.
2. La norma in questione si presta ad una serie di rilievi riconducibili alla circostanza che essa,
individuando un ambito oggettivo di applicazione particolarmente ampio, ricomprendente
qualunque tipologia di latte sottoposto al trattamento di pastorizzazione, appare eccessivamente
rigida e inadeguata rispetto alle tecnologie produttive oggi disponibili. Inoltre, la medesima
33
disposizione, così come più in generale la disciplina della trasformazione del latte alimentare
contenuta nella legge 3 maggio 1989, n. 169, presenta profili di incoerenza con la disciplina
comunitaria sia del regime di scadenza dei prodotti alimentari in generale, di cui alle direttive
89/395 e 89/396/CEE e al d.lgs. 27 gennaio 1992, n.109 di recepimento, sia del regime produttivo
del latte alimentare, disciplinato dalle direttive 92/46 e 92/47/CEE recepite con D.P.R. 14 gennaio
1997, n. 54.
3. Quanto alla circostanza che la fissazione per legge della scadenza del latte pastorizzato risulti
eccessivamente rigida, può osservarsi che l’aspetto problematico va individuato nella circostanza
che il vincolo legislativo non consente di adeguare i processi produttivi di trasformazione del latte
crudo alle innovazioni tecniche oggi disponibili, nonché di valorizzare le produzioni di materia
prima, ossia di latte crudo, di qualità. Si rileva infatti da un lato che le imprese più dinamiche attive
nel settore della trasformazione del latte risultano oggi in grado di produrre latte pastorizzato fresco
con una vita più lunga di quanto non sia stabilito, in via generale, dalla legge. Dall’altro si osserva
che la qualità di latte crudo oggi disponibile sul mercato nazionale ben consentirebbe la produzione
di latte pastorizzato fresco in grado di tollerare una scadenza sensibilmente superiore ai quattro
giorni fissati dal legislatore.
4. Ma l’incoerenza sistematica del quadro di riferimento normativo si manifesta in modo
particolarmente evidente, ove si consideri che il citato D.P.R. n. 54/97 ha introdotto la possibilità di
produrre un latte del tipo “pastorizzato ad alta temperatura”. Questa tipologia di prodotto, infatti, in
ragione del trattamento termico subito dalla materia prima, risulta teoricamente in grado di
mantenere la propria integrità per un periodo di tempo (10-15 giorni) ampiamente superiore a quello
(4 giorni) imposto dalla citata legge 169/89. Tale incongruenza normativa ha di fatto sino ad oggi
impedito agli operatori nazionali di produrre latte pastorizzato ad alta temperatura.
5. Le limitazioni contenute nell’assetto normativo vigente costituiscono una delle più importanti
ragioni dell’attuale rigidità della struttura dell’offerta - oggi sostanzialmente limitata alle due
tipologie del latte fresco pastorizzato e del latte UHT-, che si traduce altresì in uno svantaggio per i
consumatori. Deve al riguardo rilevarsi come la previsione di una durata fissa per tutte le tipologie
di latte pastorizzato non consente un’articolazione della gamma del latte pastorizzato, in funzione
sia delle caratteristiche organolettiche del prodotto trattato, sia della correlata durata delle diverse
tipologie di latte pastorizzato. In tal senso deve sottolinearsi come la possibilità di offrire differenti
tipologie di latte pastorizzato permetterebbe un ampliamento delle potenzialità di scelta dei
consumatori. Questi infatti, informati dalle indicazioni obbligatorie recate sulle confezioni del
prodotto, e relative al trattamento del latte e alla sua durata, potrebbero godere di una maggiore
libertà di scelta e orientare i propri consumi in funzione delle specifiche esigenze.
6. D’altronde, e da un punto di vista più generale, tali principi informano la legislazione comunitaria
in materia di confezionamento e di etichettatura dei prodotti alimentari, sicché anche da questo
punto di vista sembra manifestarsi una certa incoerenza tra le norme contenute nella legge n. 169/89
e quelle di fonte comunitaria. Vige infatti in materia il principio secondo cui ciascun produttore è
responsabile della determinazione della durata del prodotto immesso in commercio. Ci si riferisce in
particolare alle direttive 89/395 e 89/396/CEE e al d.lgs. 27 gennaio 1992, n.109 di recepimento.. A
fronte di ciò non sembrano più sussistere oggi validi motivi che possano giustificare un regime
normativo particolare in materia di durata del prodotto latte pastorizzato rispetto ai principi che
disciplinano la materia della scadenza dei prodotti alimentari.
7. A fronte di tale assetto legislativo particolare e rigido, possono avanzarsi due ordini di
considerazioni. Il primo di essi è che il citato articolo 5 determina un’artificiale limitazione dei
confini dei mercati e degli ambiti di concorrenza tra le imprese. Infatti, in ragione della breve durata
della vita del latte pastorizzato, questo risulta commercializzabile e distribuibile in zone territoriali
circoscritte, e necessariamente prossime agli stabilimenti produttivi. Tale circostanza contribuisce a
definire contesti concorrenziali locali scarsamente contendibili e poco esposti alla concorrenza
34
potenziale.
8. In secondo luogo la fissazione per legge di un termine di durata ridotto determina una grave
forma di discriminazione a danno dei produttori nazionali rispetto alle imprese produttrici
comunitarie. Deve infatti al riguardo rilevarsi come il permanere del vincolo legislativo della durata
del latte pastorizzato si traduca oggi in un elemento di condizionamento negativo delle potenzialità
produttive della sola industria di trasformazione nazionale. Le imprese di produzione lattiera che
hanno allocato i propri stabilimenti produttivi oltre confine, infatti, non risultano vincolate alla
norma nazionale che fissa in quattro giorni la data di scadenza del latte pastorizzato. Esse sono
pertanto libere di stabilire autonomamente (e sotto la propria responsabilità) la data di scadenza del
latte e di immettere in commercio sul territorio nazionale il latte prodotto nel rispetto della
normativa comunitaria.
9. Ne può sottacersi che la durata di quattro giorni prevista dalla legge nazionale non conosce
equivalenti negli altri paesi dell’Unione. Si rileva infatti come anche nelle due sole nazioni, Francia
e Spagna, che prevedono una regolamentazione nazionale della durata del latte fresco questa è
stabilita in sette giorni.
10. In conclusione, l’Autorità ritiene che la previsione contenuta all’art. 5 della legge n. 169/89, non
appare più oggi sorretta da esigenze di interesse generale, mentre al contrario si rivela fonte di
distorsioni del corretto funzionamento del mercato, nonché di gravi forme di discriminazione in
grado di danneggiare l’industria nazionale.
11. L’Autorità auspica pertanto un intervento legislativo che, garantendo pari opportunità produttive
alle imprese nazionali, tenda a ripristinare omogenee condizioni di concorrenza nel mercato del latte
pastorizzato.
35
CAPITOLO II : IL LATTE BOVINO CRUDO
2.1 - PROPRIETA’ NUTRACEUTICHE
2.2 - EFFETTI BENEFICI SU ALCUNE PATOLOGIE UMANE
36
2.1 - PROPRIETA’ NUTRACEUTICHE
Il latte è un alimento completo per i neonati di tutti i mammiferi, ed esso rappresenta il loro solo ed
unico cibo durante tutto il primo stadio di vita, caratterizzato da un rapido sviluppo dell’intero
organismo. La capacità del latte nel prevenire l’infezione è riconosciuta da migliaia di anni. Gran
parte di questa attività è svolta dagli anticorpi, ma ultimamente è stato scoperto anche un ruolo in
questa attività da parte degli zuccheri complessi e di altre proteine minori presenti nel latte come
agenti bioattivi. Questo alimento, infatti, contiene diverse componenti che mostrano una
funzionalità fisiologica [11]. Allo stesso modo, il colostro è importante per i cuccioli di mammifero,
in quanto fornisce l’immunità necessaria contro le infezioni. Le proteine del latte rappresentano,
attualmente, la principale fonte di un’ampia gamma di peptidi attivi biologicamente, anche se altre
proteine animali e vegetali possono contenere potenziali sequenze bioattive [12]. Questi peptidi
possono essere rilasciati in seguito a proteolisi enzimatica, per esempio durante la digestione
gastrointestinale [13]. Peptidi attivi biologicamente derivanti dalle proteine del latte sono inattivi
senza la sequenza precursore. Una volta prodotti, i peptidi bioattivi (BPs) possono agire
nell’organismo come composti regolatori, mediante un’attività simile a quella ormonale. Alcuni di
questi peptidi sono dei potenziali nutraceutici, in grado di migliorare la salute, utilizzabili nella dieta
o come farmaci. Il latte contiene anche alcune altre sostanze naturali bioattive, quali oligosaccaridi
semplici e fucosilati, ormoni, fattori di crescita, mucine, gangliosidi e peptidi endogeni, che sono
presenti al momento della secrezione [14].
2.1.1 - PROTEINE BIOATTIVE
La funzione primaria delle proteine della dieta è quella di soddisfare adeguatamente l’apporto
giornaliero di aminoacidi essenziali ed azoto organico. Oltre alle principali proteine, quali le
caseine, nel latte è presente anche una piccola quota di proteine minori e peptidi, che svolgono
diverse attività fisiologiche, ad esempio come fattori di rilascio ormonale o come sistema endogeno
antibatterico. Questi composti vengono secreti dal sangue direttamente nel latte, o sono sintetizzati
nella ghiandola mammaria (Tab. 11).
Ormone di rilascio della tireotropina (TRH)
Ormone stimolante la tiroide (TSH)
Ormone di rilascio dell’ormone luteinizzante (LHRH)
Lisozima
Somatostatina (SIH)
Lattoperossidasi
Peptide di rilascio della gastrina (GRP)
Lattoferrina
Calcitonina
Transferrina
Ormone adrenocorticotropo (ACTH)
Immunoglobuline (IgA, IgG, IgM)
Insulina
Enzimi (es. plasmina)
Fattori di crescita (es. EGF)
Prolattina
Tab. 11 - Proteine e
peptidi bioattivi
naturalmente presenti
nel latte.
Relaxina
37
9 Peptidi caseina-derivati - Peptidi oppioidi
I peptidi oppioidi sono quelli che hanno una similitudine farmacologica all’oppio (morfina) e
derivano da una caseina detta casomorfina [15]. La maggior parte di questi peptidi sono frammenti
della β-caseina (β-CN), dei quali i maggiori sono le β-casomorfine, che hanno origini eterogenee e
proprietà simili a quelle della morfina [16, 17, 18]. Tutti i frammenti della κ-caseina, conosciuti
come casoxine, si comportano come antagonisti oppioidi. Un amido tetrapeptidico è il maggior
agonista oppioide nel gruppo delle β-casomorfine del latte bovino, ma anche due antagonisti
oppioidi provengono da questo gruppo, le casoxine C e D [19]. Peptidi simili sono stati trovati
anche nelle frazioni umane di β-CN [20, 21], e la sequenza Y-P-F, che è comune alla β-casomorfina
bovina, è nella struttura primaria della β-CN umana. Inoltre, un’ammide tetrapeptidica, la
morficettina, è l’agonista oppioide maggiormente attiva nel gruppo delle β-casomorfine bovine. In
generale, comunque, i frammenti α- e β-CN producono risposte agoniste, mente quelli provenienti
dalle κ-CN sviluppano effetti da antagonisti. E’ importante da sottolineare che i peptidi bioattivi
sono generati dalla maggior parte delle principali proteine sia nel latte bovino che in quello umano.
Quando i peptidi oppioidi vengono iniettati nella circolazione sanguigna, inducono un effetto
analgesico e sedativo, dovuto alla loro azione sul sistema nervoso [22, 23]. Studi hanno suggerito
che gli agonisti e gli antagonisti oppioidi vengono a formarsi nell’intestino come risultato, in vivo,
dell’idrolisi della caseina del latte durante la digestione, e che questi peptidi aiutano la motilità
gastrointestinale [24]. Alcuni di questi, infatti, influiscono il tempo di transito nell’apparato
digerente, come le casomorfine, che lo prolungano, esercitando un’azione antidiarroica. L’effetto
delle β-casomorfine sulla motilità nel tratto intestinale di ratto è stato studiato utilizzando il marker
non-assorbibile 141Ce, che ne ha dimostrato la presenza anche nel plasma di donne gravide ed in
fase di allattamento [25, 26]. Allo stesso modo, le casomorfine sono state ritrovate nel chimo
duodenale di maiale ed anche nel piccolo intestino dell’uomo [27], come risultato della digestione
in vivo delle proteine del latte.
9 Fosfopeptidi della caseina - CPPs
Le micelle presenti nel latte bovino contengono una significativa quota di calcio e fosforo, dovute ai
residui serinici fosforilati presenti nelle αs1-, αs2- e β-caseine [28]. Questi frammenti fosfopeptidici
della caseina vengono detti CPP e coadiuvano la formazione delle micelle caseiniche stabili
termodinamicamente, supersaturandole con calcio e fosfato, il che contribuisce alla stabilità del latte
durante i processi di riscaldamento [29]. Inoltre, è stato dimostrato che la formazione dei CPP
nell’intestino può incrementare la concentrazione del calcio in forma solubile [30, 31, 32]. Sono
stati effettuati diversi studi su colture cellulari, ed anche su animali ed uomo, per cercare di capire
se davvero, e come, i CPP assunti con la dieta siano in grado di aumentare l’assorbimento del
calcio. In particolare, gli studi effettuati su cavie animali che hanno cercato di dimostrare effetti
positivi dei CPP della dieta sull’assorbimento intestinale del calcio, sul suo bilancio e sullo sviluppo
osseo hanno mostrato risultati controversi [33]. D’altra parte, un gruppo di ricercatori giapponesi
hanno descritto i benefici effetti dei CPP, utilizzando come cavia dei ratti ovariectomizzati in postmenopausa [34]. Inoltre, in uno studio cross-over randomizzato [35], dove si è studiato l’effetto di
una preparazione di CPP purificati sull’assorbimento del calcio in 35 donne normali in postmenopausa, non sono stati riscontrati effetti sulla popolazione esaminata nel complesso, ma, quando
l’analisi venne ristretta alle donne che presentavano ridotti valori di assorbimento di calcio, nello
specifico, 17 donne su 35, allora la supplementazione della dieta con i CPP risultò aumentare del
5,3% l’assorbimento del calcio. Quindi, i complessi CPP-calcio possono aumentare l’assorbimento
del calcio nel piccolo intestino, ma servono ancora altri studi per poter affermarne con certezza
l’efficacia. Inoltre, il trattamento termico al quale viene sottoposto il latte per la
commercializzazione può causare defosforilazione dei residui fosfoserinici e può influire
negativamente sulla biodisponibilità dei CPP.
38
9 Peptidi anti-ipertensivi - inibitori dell’enzima convertitore dell’angiotensina I (ACE)
L’enzima convertitore dell’angiotensina I, detto ACE, è un enzima chiave coinvolto nella
regolazione della pressione sanguigna. In seguito alla sua attività, due aminoacidi vengono rimossi
dall’angiotensina-I, permettendo la formazione del polipeptide ad otto residui angiotensina-II, che è
un vasocostrittore molto potente. L’inibizione della sintesi dell’angiotensina-II, quindi, provoca una
diminuzione della pressione sanguigna all’interno dei vasi. L’ACE, inoltre, è anche in grado di
idrolizzare la bradichinina, un vasodilatatore [36]. Così, gli inibitori dell’enzima ACE sono dei
peptidi anti-ipertensivi, e, quindi, alcuni di essi sono utilizzabili come farmaci. E’ stato studiato [37]
l’effetto anti-ipertensivo della somministrazione orale di alcune dosi di latte fermentato o peptidi
(Val-Pro-Pro o Ile-Pro-Pro) in ratti fisiologicamente ipertensivi, nei quali questa terapia decrementa
la pressione sistolica dopo 6-8 ore dalla somministrazione. Anche su pazienti umani ipertensivi, il
latte fermentato contenente questi due peptidi è in grado di ridurre significativamente la pressione
sanguigna sistolica, dopo 4-8 settimane dall’inizio della sua ingestione, suggerendo un lieve effetto
farmacologico anti-ipertensivo dei due peptidi, i quali sono in grado di superare il tratto intestinale
e, dopo il loro assorbimento, di inibire la produzione dell’angiotensina-II nella circolazione
sanguigna. Sono stati, inoltre, effettuati studi mediante misure sull’attività di inibizione che hanno
alcuni derivati di vari tipi di latte, incluso il latte pastorizzato, lo yogurt ed formaggi freschi e
stagionati, sull’ACE [38], i quali dimostrano una bassa attività di inibizione in prodotti con basso
grado di proteolisi, come yogurt e formaggi freschi. Al contrario, il formaggio stagionato mostra
una maggiore attività inibitoria dell’ACE, seppur variabile, a seconda della durata della
stagionatura; al di sopra di un certo tempo, in effetti, l’attività dei peptidi inibitori decrementa.
Comunque, i prodotti freschi giornalieri possono agire come cibi naturalmente influenzanti la
pressione sanguigna, il che li rende dei convenienti veicoli per l’assunzione di naturali inibitori
dell’ACE.
9 Peptidi anti-trombotici
Il coagulo di sangue e quello di latte sono formati in seguito a due importanti processi fisiologici.
Un gran numero di similarità molecolari sono state descritte tra questi due fenomeni coagulativi
[39, 40], e tra queste spiccano le omologie strutturali tra la κ-caseina bovina e la catena γ del
fibrinogeno umano [41]. In effetti, il frammento κ-caseinico detto casopiastrina, ottenuto
dall’idrolizzato triptico, mostra un’attività anti-trombotica, in quanto inibisce il fibrinogeno legato
alle piastrine [42, 43].
9 Peptidi con attività citomodulatoria
Diversi studi di citochimica evidenziano il possibile coinvolgimento di alcuni peptidi derivanti da
proteine contenute nel latte, che fungono da specifici segnali modulatori, sulla variabilità delle
cellule cancerogene. Infatti, il latte scremato bovino, digerito con un estratto acellulato del fungo
Saccharomyces cerevisiae, possiede attività antiproliferativa su cellule in coltura di leucemia umana
(HL-60) [44]. Inoltre, peptidi purificati, corrispondenti alle sequenze bioattive della caseina,
mostrano modulazione della variabilità cellulare, in termini di proliferazione ed apoptosi, in diversi
modelli di cellule umane in coltura [45, 46]. L’apoptosi di cellule umane leucemiche (HL-60),
infatti, è indotta dal peptide oppioide β-CN(f60-66), detto β-casomorfina-7, e dal fosfopeptide βCN(f1-25)4P, detto caseinofosfopeptide. Inoltre, le β-casomorfine e l’αs1-caseina inibiscono la
proliferazione di linee cellulari di cancro prostatico umano, mediante meccanismi in parte legati ai
recettori oppioidi [47]. I derivati delle proteine del latte inducenti l’apoptosi possono avere un ruolo
nel controllo della proliferazione delle cellule maligne. La maggior parte dei promotori tumorali
39
sono potenti inibitori dell’apoptosi [48] e, quindi, i peptidi che inducono l’apoptosi possono essere
classificati come probabili sostanze anticarcinogeniche umane. Il complesso degli effetti sulla
variabilità cellulare (peptidi citomodulatori) uniti a quelli sulla funzione immunitaria (peptidi
immunomodulatori) rappresenta un meccanismo mediante il quale i peptidi bioattivi esercitano
effetti protettivi contro lo sviluppo del cancro. Il sito target primario per la produzione dei possibili
stimoli apoptotici contro le cellule maligne potrebbe essere il tratto gastrointestinale. Gli effetti
antiproliferativi dei peptidi derivanti dalle proteine del latte, ed anche degli altri suoi componenti
minori, sulle linee cellulari di cancro del colon suggeriscono che essi possono avere un ruolo nella
prevenzione di questo tipo di tumore, bloccando l’iperproliferazione dell’epitelio e promuovendo
l’apoptosi [46, 49, 50, 51].
9 Peptidi immunomodulatori
Dalla caseina è possibile ottenere anche diversi peptidi immunomodulatori, come gli
immunopeptidi formanti l’αs-caseina e la β-caseina, i quali stimolano, in vitro, l’attività fagocitica
dei macrofagi umani e murini contro le cellule del sangue della serie rossa [52]. Inoltre, l’iniezione
di peptidi della caseina o dell’α-lattalbumina mostra diretta attività immunomodulatrice, che
protegge i topi dall’infezione da parte dell’agente patogeno Klebsiella pneumoniae [53, 54]. Questi
peptidi, infatti, possono promuovere la proliferazione e la maturazione delle cellule T e delle cellule
Natural Killer, il che contribuisce alla difesa immunitaria dei neonati contro un gran numero di
batteri, in particolar modo quelli enterici [55, 56]. Inoltre, l’iniezione di isracidina, il frammento 123 dell’αs1-caseina, ottenuto dopo l’azione della chimosina, produce un effetto antibatterico contro
lo Stafilococco aureus e la Candida albicans nella mammella delle pecore e delle bovine,
proteggendole dall’insorgenza di mastite. Per avere una funzione fisiologica nel corpo umano, i
peptidi attivi devono essere assorbiti dall’intestino in una forma attiva. La maggior parte di queste
proprietà dei peptidi bioattivi ottenuti dalla caseina sono effettivamente accertabili in vitro ed in
modelli animali, ed ipoteticamente dimostrabili anche nell’uomo.
9 Sostanze bioattive ottenibili dalle proteine sieriche
Le proteine sieriche rappresentano circa il 20% delle proteine totali del latte, ed hanno la
caratteristica di non essere coagulate dall’acido ed essere resistenti all’azione della chimosina.
Come risultato, quindi, queste proteine rimangono sempre presenti nel siero. Una delle principali
proteine del latte umano è la α-lattalbumina, che contiene aminoacidi facilmente digeribili. La βlattalbumina, invece, rappresenta circa la metà delle proteine sieriche totali del latte bovino, ed è
assente nel latte umano. Molte proteine sieriche possiedono proprietà fisiologiche. Il siero bovino
contiene proteine che legano il metallo, immunoglobuline, fattori di crescita ed ormoni [57]. I
peptidi bioattivi ottenuti dalle proteine sieriche ed i loro effetti fisiologici sono stati studiati in modo
meno approfonditi rispetto a quelli ottenuti dalle caseine. Comunque, è stato accertato che molte
delle funzioni delle proteine sieriche sono legate all’immunità od ai sistemi digerenti. L’α-lattorfina
esercita una debole attività oppioide sul muscolo liscio, mentre la β-lattorfina ha un effetto
contrattivo su questo muscolo [58]. L’α- e la β-lattorfina, insieme all’albutensina, hanno anche un
effetto inibitorio sull’enzima ACE, e la β-lattoglobulina può legare il retinolo e trasportarlo nel
piccolo intestino [59]. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che le proteine sieriche hanno anche
proprietà antimicrobiche, funzioni immunostimolatorie [60] ed effetti anticarcinogenici in topi e
ratti [61].
40
9 Proteine bioattive minori
Le proteine sieriche minori, come la lattoferrina, la lattoperossidasi, il lisozima e le
immunoglobuline sono considerate proteine con attività antimicrobiche. Infatti, i ruoli specifici di
diversi tipi di immunoglobuline, della lattoferrina e della lattoperossidasi nella protezione dei vitelli
neonati è stata approfonditamente studiata [62].
•
Immunoglobuline - Le immunoglobuline non riescono ad attraversare la placenta nei feti
dei mammiferi; dunque, i vitellini, ed anche i neonati umani, nascono con una concentrazione
immunoglobulinica sierica molto bassa. Comunque, l’immunità passiva dopo la nascita è assicurata
dall’alta concentrazione di immunoglobuline che si ritrovano nel colostro umano e bovino. Gli
anticorpi proteggono i neonati dalle infezioni e sono particolarmente presenti nel colostro, ma la
loro concentrazione diminuisce durante la normale lattazione. Nella mucca, la classe
immunoglobulimica maggiormente presente è quella delle IgG1, con concentrazioni di circa 48 gr/l
nel colostro e di 0,6 gr/l nel latte normale [63]. Nel latte umano, invece, la classe predominante di
immunoglobuline è quella delle IgA, con livelli di circa 17 gr/l nel colostro e circa 1 gr/l nel latte
[64]. Le immunoglobuline presenti nel latte bovino hanno un possibile effetto positivo nella
prevenzione della diarrea [65]. Infatti, diversi studi digestivi mostrano che il 20% o più degli
anticorpi ingeriti sopravvivono e rimangono biologicamente attivi [66, 67].
•
Lattoferrina - La lattoferrina è la proteina sierica dominante nel latte umano e gioca un
importante ruolo nella cattura del ferro nell’intestino [68, 69]. La lattoferrina bovina è omologa a
quella umana. La concentrazione della lattoferrina nel colostro e nel latte bovino è di circa 1,5-5
mg/ml e 0,1 mg/l, rispettivamente [70]. Nel colostro e nel latte umano, i livelli riportati sono di 2-4
gr/l e 6-8 gr/l, rispettivamente. Questi valori indicano che la lattoferrina è ancora più importante
negli umani che nelle specie bovine. La presenza di alte concentrazioni di lattoferrina nel colostro
ed il passaggio ai neonati suggerisce il coinvolgimento di questa proteina nel primo sistema di
difesa contro i batteri patogeni [71]. La lattoferrina è stata individuata anche nel latte di altre specie
di mammiferi, come nel maiale, nel cavallo, nel bufalo, nella capra e nel topo, ed in altri liquidi
biologici, come lacrime, fluidi sinoviali, saliva e liquido seminale, con concentrazioni comprese tra
i 10 μg/ml ed i 2 mg/ml [72]. La lattoferrina plasmatica viene sintetizzata dai neutrofili, in seguito
alla loro degranulazione durante il processo flogistico [73], ed è un peptide a catena singola, che
pesa circa 80000 Da e contiene da 1 a 4 glicani, in base alla specie [74]. Le lattoferrine umana e
bovina sono formate da 691 e 689 aminoacidi, rispettivamente, e le loro sequenze hanno un’identità
del 69% [75]; le loro conformazioni tridimensionali sono ora conosciute nel dettaglio [76]. La
delucidazione della struttura dei glicani N-terminali legati alle lattoferrine nelle varie specie è stato
il risultato di studi approfonditi [74, 77]. Gli zuccheri presenti nella lattoferrina bovina sono l’Nacetillattosammina, l’N-acetilglucosamina, il galattosio, il fucoso, il mannosio e l’acido
neuraminico. Ogni lattoferrina è formata da due lobi omologhi, detti N- e C-lobo, riferiti alle parti
N- e C-terminale, rispettivamente, della molecola. Ogni lobo, inoltre, consiste di due sublobi, o
domini, che formano una tasca dove lo ione ferrico (Fe3+) è fortemente legato in una sinergica
cooperazione con l’anione bicarbonato [78]. Nello stato naturale, la lattoferrina bovina è solo in
parte saturata con il ferro (15% - 20%) ed ha un colore rosa salmone, l’intensità del quale dipende
dal grado di saturazione con il ferro. La lattoferrina con meno del 5% di saturazione con il ferro è
detta apolattoferrina, mentre la lattoferrina satura di ferro è detta ololattoferrina. La lattoferrina
presente nel latte della mammella è essenzialmente apolattoferrina. L’affinità della lattoferrina per il
ferro è molto alta, circa 260 volte di più della trasferrina sierica, con un’affinità di circa 1020 [79].
La capacità della lattoferrina di legare il ferro dipende dalla presenza di piccole quantità di
bicarbonato [78]. Il residuo cationico N-terminale della lattoferrrina bovina è di particolare
interesse, in quanto mostra una spiccata attività antibatterica [80].
41
•
Lattoperossidasi - La lattoperossidasi è il maggior agente antibatterico presente nel
colostro, ed esplica la sua azione in presenza di acqua ossigenata (H2O2), catalizzando l’ossidazione
del tiocianato nell’anione SCN-, producendo un prodotto intermedio che presenta attività
antimicrobica [81]. La concentrazione di lattoperossidasi nel colostro e nel latte è di circa 11-45
mg/l e 13-30 mg/l, rispettivamente [82]. Purtroppo, il latte umano contiene piccole quantità di
lattoperossidasi, ed, in alcuni casi, ne è del tutto privo [83].
•
Lisozima - Il lisozima, una proteina a singola catena di 15 kDa, è un enzima antimicrobico
presente nel colostro e nel latte umano [84], che idrolizza il legame β-1,4 tra l’acido Nacetilmuramico ed il 2-acetil-amino-2-deossi-D-glucosio, due residui risultanti dalla lisi della parete
cellulare batterica. La concentrazione di lisozima nel colostro e nel latte normale è di circa 0,14-0,7
mg/l e 0,07-0,6 mg/l, rispettivamente [82]. Il contenuto aminoacidico del lisozima presente nel latte
bovino è differente rispetto quello del lisozima del latte umano, ed anche di quello contenuto
nell’albume delle uova. Il lisozima del latte è attivo contro diversi batteri Gram-positivi ed anche
alcuni Gram-negativi. Inoltre, sembra che ci sia un’azione sinergica del lisozima e della lattoferrina
contro il patogeno Escherichia coli; la lattoferrina, infatti, danneggia la membrana esterna dei
batteri Gram-negativi, rendendoli suscettibili all’azione del lisozima.
42
2.1.2 - ZUCCHERI ED ALTRI COMPONENTI BIOATTIVI
Il latte umano contiene diversi fattori di protezione, incluso oligosaccaridi, mucina, gangliosidi ed
altri componenti contenenti l’acido N-acetilneuraminico. Questi oligosaccaridi sono carboidrati
complessi leganti il lattosio, la concentrazione dei quali, nel latte umano, può variare tra i 10 ed i 20
g/l. Il latte umano contiene più tipi ed anche quantità superiori di oligosaccaridi rispetto al latte
bovino, e queste strutture oligosaccaridiche possono anche comprendere la porzione carboidratidica
dei glicoconiugati, come i glicolipidi e le glicoproteine, le quali inibiscono il legame del patogeno
enteroemorragico Escherichia coli [85]. Il lattosio può essere utilizzato per produrre lattulosio e
latto-oligosaccaridi, utilizzati come promotori della crescita dei batteri probiotici, ed anche per
aumentare l’assorbimento del calcio. Nel latte umano, inoltre, gli oligosaccaridi inibiscono il
legame delle cellule ospiti target con i patogeni enterici Escherichia coli, Campylobacter jejuni e
Streptococcus pneumoniae. La mucina è una lunga macromolecola presente nel latte umano, che si
lega agli oligosaccaridi, soprattutto alla glicoproteina lattaderina, formando un complesso che
inibisce la replicazione dei rotavirus [86]. Si pensa che il calcio abbia un ruolo nella regolazione
della pressione sanguigna. Ci sono alcune evidenze epidemiologiche che l’aumentato apporto di
calcio, specialmente dai latticini, è associato al mantenimento della pressione sanguigna. E’ stato
ipotizzato anche un possibile ruolo protettivo del calcio, utile nella prevenzione del cancro del
colon. Infatti, il principale fattore implicato nella promozione del cancro del colon pare sia la
presenza di Sali biliari, ed il latte contiene il calcio fosfato, che lega i Sali di bile per prevenire il
loro effetto tossico [87]. I composti bioattivi del latte basati sui lipidi includono gli acidi grassi. E’
stato accertato il ruolo dell’acido linoleico coniugato nell’inibire il cancro e l’aterosclerosi [88, 89].
Il latte contiene anche centinaia di complessi oligosaccaridici che sono coinvolti nella promozione
della crescita del Bifidobatterio, che agiscono come analoghi recettoriali per le cellule epiteliali nel
prevenire l’adesione dei patogeni e nell’inattivazione delle tossine.
43
2.2 - EFFETTI BENEFICI SU ALCUNE PATOLOGIE UMANE
2.2.1 - OSTEOPOROSI
L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha recentemente inserito nelle priorità sanitarie di
rilevanza internazionale, per la decade 2000-2010, l’osteoporosi. Questa patologia dello scheletro,
definita anche malattia delle “ossa di vetro”, ha come sua caratteristica principale la perdita del
patrimonio minerale osseo, con conseguente progressiva riduzione della resistenza meccanica dello
scheletrico, il quale va incontro col tempo al cedimento strutturale, anche spontaneo. Le fratture di
vertebra, di femore e di polso, rappresentano le manifestazioni cliniche più drammatiche
dell’osteoporosi, sia in termini di costi umani, per scadimento della qualità della vita del paziente e
per riduzione dell’attesa di sopravvivenza, sia per gli elevati costi economici di gestione sanitaria.
Poiché la perdita di patrimonio minerale è irreversibile, la prevenzione e la diagnosi precoce
rappresentano le migliori strategie di gestione della malattia osteoporotica. In particolare, a partire
dagli anni sessanta, grazie allo sviluppo della MOC (acronimo di densitometria ossea
computerizzata a raggio X), è possibile misurare con accuratezza e precisione la densità minerale
ossea, la quale rappresenta il fattore predittivo più importante della frattura. Inoltre, la conoscenza
più approfondita dei meccanismi patogenetici della malattia ha consentito di approntare valide
misure preventive, quali una corretta alimentazione ed un migliore stile di vita.
L’osteoporosi è una patologia ad insorgenza subdola, con sintomi poco eclatanti, spesso confusi con
quelli dell’artrosi, senza segni obiettivi patognomonici; infatti, non è inusuale diagnosticarla proprio
in occasione della sua complicanza fratturativa vertebrale o femorale, quando cioè la
compromissione ossea è già tale da determinare uno stato di invalidità. Alcuni autori hanno
recentemente segnalato importanti modificazioni patologiche del metabolismo del calcio nella
malattia di Crohn, in particolare nei casi sottoposti a resezione chirurgica parziale del piccolo
intestino; il ridotto assorbimento intestinale del calcio può, infatti, determinare un quadro
metabolico di iperparatiroidismo secondario. La minor disponibilità di calcio circolante stimola le
ghiandole paratiroidee a secernere il paratormone, il quale, agendo sulle cellule bersaglio
osteoclastiche (cellule ossee deputate al riassorbimento osseo), provoca un incremento del
riassorbimento di calcio dal tessuto osseo con conseguente riduzione della capacità di resistenza
meccanica dello scheletro. Ma anche il processo infiammatorio cronico, e quindi la malattia
intestinale nella sua essenza, può stimolare gli osteoclasti tramite mediatori, detti citochine, e
indurre quindi un depauperamento progressivo delle riserve di quella “banca” del calcio che è il
nostro scheletro. A questi importanti fattori patogenetici, si aggiunge un farmaco assai importante
nelle terapia della malattia, lo steroide. Il cortisone, prescritto nelle fasi infiammatorie acute della
malattia intestinale, è ben noto per la sua azione osteopenizzante da molto tempo. Sono sufficienti
posologie molto basse e pochi mesi di somministrazione per determinare significative perdite di
massa ossea. Già 5 mg di equivalente prednisonico al giorno per via sistemica (per via orale, per
intramuscolo o per endovena) per più di tre mesi sono una posologia che determina un bilancio
calcico negativo, con conseguente perdita di massa ossea. Le più importanti società scientifiche
internazionali, quali la British Society of Gastroenteroly e l’American Gastrointestinal Association,
hanno da tempo emanato delle linee guida per la prevenzione dell’osteoporosi nelle malattie
intestinali; linee guida che è opportuno rammentare ai pazienti, in quanto si tratta spesso di semplici
cambiamenti dello stile di vita.
La prima regola è alimentare: introdurre quotidianamente cibi ricchi di calcio quali il latte, lo yogurt
o il formaggio grana. Il calcio, infatti, rappresenta l’elemento costitutivo primario del tessuto
scheletrico e l’OMS consiglia per una persona adulta un’apporto quotidiano di almeno 1 grammo di
calcio al giorno [90].
44
2.2.2 - PATOLOGIE CARDIOVASCOLARI
Il rischio di incidenza e mortalità di patologia coronaria (CHD) cresce all’aumento dei livelli
plasmatici di colesterolo [91, 92]. La molto pubblicizzata “ipotesi lipidica” conclude che l’elevata
assunzione di colesterolo ed acidi grassi saturi è ampiamente responsabile degli alti livelli
plasmatici di questo lipide e dell’alta incidenza di CHD nei Paesi industrializzati. Sia l’alto livello
plasmatico dei trigliceridi che quello del colesterolo sono considerati fattori di rischio per la CHD
[93].
Questa è una delle ragioni per cui il latte ed i suoi prodotti hanno a lungo avuto un’immagine
negativa rispetto l’aterosclerosi e la CHD. Il grasso del latte fornisce, infatti, colesterolo ed è ricco
in acidi grassi saturi; inoltre, ogni componente ha la potenzialità di incrementare i livelli plasmatici
di colesterolo, essendo gli acidi grassi saturi con una catena lunga 12-14 atomi di carbonio
ipercolesterolemici [94]. Eppure, diversi studi hanno confermato che una parte considerevole degli
acidi grassi saturi nel grasso del latte è composta da acidi grassi a corta catena e da solo acido
stearico a lunga catena, e questo significa che non influiscono in modo negativo sui livelli di
colesterolo. Un’altra ragione per cui il latte ha un’immagine negativa è che la caseina, ed anche
altre proteine animali, possono avere effetti ipercolesterolemici ed aterogenici [95], specialmente
segnalato in specie animali sensibili.
In questi ultimi anni, sono diventati evidenti altri fattori di rischio addizionali per la CHD, incluso i
livelli plasmatici di omocisteina e fibrinogeno, e la domanda su fino a che punto alti livelli di
colesterolo contribuiscono al rischio totale, rispetto ad altri fattori di rischio conosciuti e non, è più
aperta che mai. Infatti, esiste qualche prova contro “l’ipotesi lipidica”. Sebbene ci sia una
correlazione tra la mortalità della CHD ed il consumo di grassi presenti in latte e burro, la Finlandia
e la Franciaforniscono paradossi importanti sull’ ipotesi lipidica [96]. Infatti, la discrepanza di basso
rischio di CHD nonostante una dieta ricca in acidi grassi saturi e colesterolo è diventata molto
conosciuta come il “paradosso Francese”. Infatti, non c’è una correlazione positiva tra rischio di
CHD e consumo di grassi animali all’interno di una popolazione [97]. Addirittura, un elevato
consumo di latte sembra essere associato ad un decremento del rischio di patologia ischemica
cardiaca [98]. Questi studi suggeriscono che il latte ed i suoi prodotti possono contenere sostanze
bioattive antiaterogeniche che negano gli effetti degli acidi grassi saturi e del colesterolo. Il latte ed
i suoi derivati possono modificare i fattori di rischio di malattie cardiovascolari (CVD) in modo
vantaggioso, grazie ad una serie di loro componenti, che possono essere implicati nel
miglioramento della CHD e di altre CVD [99].
Sebbene il consumo di latte intero non riduce il colesterolo plasmatico, comunque, non ne
incrementa nemmeno il livello [100, 101]. In un recente studio su adulti, condotto per più di 8
settimane, un supplemento di ¼ (0,25 litri) di latte scremato decrementa i livelli plasmatici di
trigliceridi e colesterolo in ipercolesterolemici, ma non in soggetti normocolesterolemici [102]. Tra
l’altro, il latte intero può non influenzare i lipidi sanguigni, come può far pensare il suo contenuto in
grassi e la loro composizione [103].
45
2.2.3 - INFIAMMAZIONI
Diversi studi hanno dimostrato che le glicoproteine presenti nel colostro bovino inibiscono
l’adesione del batterio Helicobacter pylori, l’agente patogeno che provoca l’ulcera gastrica, ed
hanno anche un effetto positivo nel ridurre le lesioni provocate dall’uso di antinfiammatori nonsteroidei (FANS), impededendo un’aumento significativo della permeabilità della mucosa
gastrointestinale. Inoltre, il latte è in grado di modulare la risposta infiammatoria, ad esempio
attraverso alcune sue proteine, che fungono da recettori per il fattore di necrosi tumorale (TNF), un
potente attivatore della cascata infiammatoria, controllandone l’attività. Anche la lattoferrina,
proteina antiossidante presente nel latte, inibisce la flogosi. Infatti, la lattoferrrina esplica attività
batteriostatica ed anche battericida contro diversi microrganismi, causando il rilascio delle molecole
lipopolisaccaridiche dalla superficie della membrana dei batteri Gram-negativi, agendo direttamente
come un antibiotico [104]. La lattoferrina inibisce anche la crescita dei patogeni Escherichia coli,
Salmonella
typhimurium,
Shigella
dysenteriae,
Listeria
monocytogenes,
Bacillus
stearothermophilus e Bacillus subtilis [105, 106, 107].
L’effetto antimicrobico si esplica principalmente sui microrganismi che richiedono ferro come
quello che chela la lattoferrina, deprivando, in questo modo, gli organismi di una sorgente di questo
nutriente. La lattoferrina interagisce con la membrana cellulare batterica, causando cambiamenti
della permeabilità ed il rilascio dei lipopolisaccaridi [108]. Inoltre, anche la lattoferricina, un
peptide singolo composto da 25 residui aminoacidici, che deriva dalla lattoferrina bovina in seguito
all’azione della pepsina, ha azione contro diversi batteri ed anche nei confronti della Candida
albicans [109]. Un peptide simile attivo, formato da 47 amionoacidi, è stato ottenuto dalla
lattoferrina umana. Si può concludere che la lattoferrina dà un importante contributo al sistema di
difesa dell’ospite, eliminando i patogeni, come batteri, virus e funghi, stimolando e proteggendo le
cellule coinvolte nei meccanismi di difesa dell’ospite e controllando la risposta da parte delle
citochine [62].
46
2.2.5 - NEOPLASIE
L’aumentata incidenza del cancro rappresenta, al giorno d’oggi, una grave realtà che la medicina
moderna sta cercando di arginare. Diversi studi dimostrano la chiara correlazione che intercorre tra
le scorrette abitudini di vita ed il notevole incremento del rischio di sviluppare una neoplasia [110].
Tra queste, notevole influsso negativo ha il maggior consumo di grassi con la dieta, sempre più
priva di fibre e micronutrienti, essenziali, ad esempio, nella prevenzione del cancro del colon-retto.
Anche l’aumento dell’industrializzazione ha incrementato i fattori di rischio di alcune neoplasie, a
causa di un eccessiva quantità di inquinanti nell’aria ed anche nelle acque [111]. Fortunatamente,
però, con la diagnosi precoce siamo ormai in grado di combattere il cancro all’insorgenza, e sempre
maggior importanza viene data ai trattamenti non invasivi ed ai programmi di prevenzione,
predisposti dal Ministero della Sanità. Studi nutrizionali hanno identificato alcune componenti anticancro presenti nei cibi; in particolare, proprietà benefiche in questi termini sono possedute da
grano, vegetali in genere, frutta fresca e fibre [112]. Si è scoperto, inoltre, che i grassi saturi presenti
nel latte bovino possiedono una spiccata attività anti-cancro, grazie, soprattutto, all’acido linoleico
coniugato [113]. In uno studio epidemiologico [114] è stata caratterizzata una significativa
correlazione inversa tra il consumo di latte e l’incidenza del cancro della mammella in donne
inizialmente sane, tenute in follow-up per 25 anni. Un altro studio [115], condotto su cavie murine,
ha mostrato il potere protettivo del latte nei confronti del cancro del colon-retto. Comunque, una
riduzione dell’introduzione dei grassi tramite la dieta è già una buona strategia per arginare il
rischio di sviluppare un cancro [116], anche se grande importanza nell’insorgenza di neoplasie
riveste il tipo di lipidi in questione; infatti, diversi studi su cavie animali dimostrano che i grassi
presenti nel latte hanno una più bassa propensione ad aumentare il rischio di tumore, rispetto agli
altri tipi di lipidi presenti in alimenti diversi. A conferma di ciò, è stata confermata la proprietà anticancro posseduta dall’acido linoleico coniugato (CLA) e la sfingomielina, entrambi composti
presenti nel latte, che inibiscono la crescita in vitro di diverse linee di cellule tumorali, tra cui quelle
del melanoma, del cancro del colon-retto, della mammella e del polmone [117, 118, 119, 120],
regolando anche i segnali apoptotici generati da fattori endogeni citotossici, come il TNF e
l’interferone [121].
47
CAPITOLO III : BILANCIO TRA STRESS OSSIDATIVO E
COMPOSTI ANTIOSSIDANTI
3.1 - LO STRESS OSSIDATIVO
3.2 - BILANCIO DELLO STRESS OSSIDANTE
48
3.1 - LO STRESS OSSIDATIVO
3.1.1 - I RADICALI LIBERI E GLI ANTIOSSIDANTI
Tra i radicali liberi che più frequentemente si formano a livello cellulare, sono importanti quelli che
derivano dalla riduzione monoelettronica dell’O2 (Figura 9) definiti, quindi, radicali liberi
dell’ossigeno (ROS, dall’inglese Reactive Oxygen Species).
Fig. 9 - riduzione
monoelettronica
dell’ossigeno
Le specie reattive prodotte sono:
•
Anione superossido (O2-)
•
Perossido di idrogeno (H2O2)
•
Radicale idrossile (OH)
•
Ossigeno singoletto (O2•)
Fra queste specie, i principali responsabili di danni alle cellule aerobie sono il radicale idrossilico e
l'ossigeno singoletto. Quindi, l’ossigeno, che è indispensabile per mantenere la vita, diventa
paradossalmente anche la più importante fonte di produzione di radicali liberi. Quando respiriamo,
infatti, introduciamo ossigeno, del quale il 95% circa è utilizzato dalla cellula per produrre energia,
mentre la parte rimanente dà origine ai radicali liberi (Fig. 10). Questo è un processo fisiologico,
normale, e l’organismo di una persona sana è attrezzato per fare fronte alla presenza di questi
radicali liberi difendendosi con un proprio sistema anti-radicale, che si chiama “sistema
antiossidante”, capace di neutralizzare l'azione dei radicali dell’ossigeno e di riparare i danni
molecolari.
Fig. 10 - Produzione di
ROS nell’uomo.
I radicali liberi sono molecole instabili; infatti, queste specie chimiche possiedono un solo elettrone
anziché due, e sono pronte a reagire con qualsiasi altra molecola con cui vengono a contatto, per
appropriarsi di un loro elettrone.
49
Così, queste molecole diventano instabili a loro volta, e ricercano un elettrone, innescando, in
questo modo, un meccanismo d’instabilità a “catena” (Fig. 11).
Fig. 11 - Le specie chimiche reattive,
radicaliche o meno, agiscono
generalmente come ossidanti.
L’ossidazione, ovvero il trasferimento
di uno o più elettroni, è la base
chimica dello stress ossidativo.
I radicali liberi possiamo immaginarli come una “pistola” carica pronta a far fuoco su qualsiasi
innocente molecola entri in contatto con loro. Questa serie di reazioni può durare da frazioni di
secondo ad alcune ore, e può essere ridimensionata o arrestata solo dalla presenza degli
antiossidanti. L’azione continua dei radicali liberi si evidenzia soprattutto nel precoce
invecchiamento delle cellule e nell’insorgere di varie patologie gravi, come il cancro, malattie
dell’apparato cardiovascolare, diabete, sclerosi multipla, artrite reumatoide, enfisema polmonare,
cataratta, morbo di Parkinson e Alzheimer, dermatiti e artrosi (Fig. 12). Inoltre, se i radicali liberi
non vengono inattivati, possono aggravare molti processi patologici.
Fig. 12 - Patologie che possono
insorgere in seguito ad un
eccessivo sviluppo di ROS.
I radicali liberi sono “prodotti di scarto” che si formano naturalmente all’interno dei mitocondri
delle cellule del corpo, dove l’ossigeno viene utilizzato nei processi metabolici per produrre
energia, mediante ossidazione dei cataboliti. L’azione distruttiva dei radicali liberi è indirizzata
soprattutto sulle cellule, in particolare sui grassi che ne formano le membrane (liperossidazione),
sugli zuccheri e sui fosfati, sulle proteine del loro nucleo centrale, sugli enzimi, e specialmente sul
DNA (acido desossiribonucleico), dove alterano le informazioni genetiche.
Questo tipo di “sofferenza cellulare” è considerato come il più importante dei fattori che causano
l’invecchiamento e le malattie. Le cellule, infatti, sono in continuo stato di stress ossidativo, a causa
del critico equilibrio: il numero dei radicali liberi prodotti può essere, infatti, più grande della
capacità del corpo di neutralizzarli da solo. Quando i lipidi vengono attaccati, il processo ossidativo
provvede alla loro liperossidazione. Il sangue trasporta queste molecole grasse in tutto il corpo
grazie alle lipoproteine, specialmente quelle a bassa densità, dette LDL (Low Density
50
Lipoproteins), che sono le particelle che trasportano la maggior parte del colesterolo nel plasma. Per
questo motivo, viene generalmente accettata la teoria secondo la quale l’aumento dei livelli di
lipoproteine a bassa densità abbia un ruolo eziologico nell’insorgenza dell’aterosclerosi e delle
patologie cardiocoronariche. Tuttavia, queste lipoproteine, in pratica innocue allo stato “originario”,
sono un vero pericolo all’interno della parete arteriosa solo quando vengono alterate dal processo di
liperossidazione.
La liperossidazione, fra l’altro, aumenta il ciclo di riproduzione cellulare, che avviene quando i
lipidi che costituiscono la membrana cellulare vengono attaccati per un periodo di tempo eccessivo.
Di conseguenza, si verifica una prematura morte cellulare, la quale, alla fine, causa come risultato
una minore durata della vita, perché quelle speciali strutture cellulari, definite telomeri, le quali
chiudono e proteggono la porzione terminale del DNA, vengono accorciate progressivamente, fino
ad esaurimento. I telomeri (etimologicamente, “parte terminale”) sono strutture localizzate sulle
estremità dei cromosomi, e sono costituite da porzioni di DNA altamente ripetitivo, che si
accorciano ogni volta che la cellula si divide. I telomeri di una cellula scompaiono dopo circa 50
divisioni cellulari; quindi, quella specifica cellula sottoposta a stress ossidativo perde la possibilità e
la capacità di riprodursi. Così, il progressivo accorciamento dei telomeri va a limitare l’aspettativa
di vita dell’uomo.
Lo stress ossidativo viene esasperato principalmente dalla dieta, dalle tossine ambientali, come il
biossido d’azoto, dagli alcolici, da traumi e ferite, dalle malattie e dalle cure farmacologiche, da un
eccessivo esercizio fisico, da stress emotivo e psicologico, dal fumo di sigaretta, da un’eccessiva
esposizione al sole e da fattori genetici (Fig. 13).
Fig. 13 - Cause di una
eccessiva formazione di ROS.
Anche il nostro sistema immunitario, il cervello ed il sistema nervoso sono altamente sensibili allo
stress ossidativo. Ad esempio, una cellula immunitaria ha un alto contenuto d’acidi grassi
polinsaturi nella sua membrana cellulare e, per questa ragione, è più aggredibile da parte dei radicali
liberi. Infatti,la membrana cellulare gioca dei ruoli molto critici per il sistema immunitario,
riconoscendo gli antigeni, che stimolano la produzione d’anticorpi, ed esponendo dei recettori, che
servono come segnale per il riconoscimento da parte delle altre cellule del sistema immunitario.
Inoltre, lo stress ossidativo muta il DNA e, quindi, compromette le funzioni del sistema
immunitario, il che è significativamente associato con i problemi autoimmuni, tipo allergie, asma,
artrite reumatoide, sclerodermia, morbo di Crohn e Lupus eritematoso [122].
51
In conclusione, quindi, si può affermare che il termine stress ossidativo identifica la modificazione
del normale equilibrio intracellulare tra sostanze ossidanti, prodotte fisiologicamente durante i
processi metabolici, ed il sistema di difesa antiossidante, che svolge la funzione di neutralizzarle.
Quando le sostanze ossidanti prevalgono e/o le sostanze antiossidanti si riducono, si configura lo
stress ossidativo [123].
52
5.3 - Bilancio dello stress ossidante
Gli antiossidanti riportano l’equilibrio chimico nei radicali liberi grazie alla possibilità di fornire
loro gli elettroni di cui sono privi, permettendo così ai sistemi enzimatici della cellula di
neutralizzarli. Nel donare l’elettrone, l’antiossidante diventa esso stesso un radicale libero. La
differenza, però, è che un antiossidante radicalico è molto più stabile di un radicale libero vero e
proprio e, nel corso della giornata, il nostro corpo è capace di espellerlo facilmente. L’equilibrio
tra radicali liberi ed antiossidanti è particolarmente difficile da mantenere. Infatti, l’ago della
bilancia di questo delicato equilibrio può pendere, purtroppo, anche se di poco, verso i radicali
liberi, nonostante il nostro impegno di assumere antiossidanti con la dieta, e questa loro
preponderanza lascia una scia di molecole danneggiate nel corpo (Fig. 14). A questo punto, il
nostro organismo ha il compito di liberarsi di queste molecole, sostituendole tutte, oppure
producendone altre de novo.
Fig. 14 - Il difficile equilibrio tra radicali liberi ed antiossidanti.
La detossificazione dei composti reattivi dell’ossigeno è uno dei prerequisiti della vita in
condizioni aerobie, costituendo un importante sistema di difesa antiossidante di prevenzione,
intercettazione e riparazione, che comprende agenti di tipo non-enzimatico ed enzimatico (Fig.
15). Tra gli antiossidanti di natura enzimatica ricordiamo:
•
•
•
Superossido-dismutasi (SOD)
Glutatione-perossidasi
Catalasi
Tra quelli non-enzimatici:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Vitamina E
Vitamina C
α e β-Carotene
Luteina/Zeaxantina
Licopene
Ubichinolo
Acido urico
Polifenoli
Bilirubina ed altri metaboliti plasmatici
53
Fig. 15 - Meccanismi di difesa dell’organismo alla formazione dello stress ossidativo.
Pertanto, alla formazione di radicali liberi il nostro organismo risponde mediante il suo sistema
antiossidante, che riporta l'equilibrio chimico nei radicali liberi grazie alla possibilità di fornire
loro gli elettroni di cui sono privi (Figura 16).
Fig. 16 - Modalità di azione di
un antiossidante
E' importante sottolineare che i diversi tipi di antiossidanti, distinguibili ulteriormente in
idrosolubili o liposolubili, svolgono un'azione sinergica in diversi distretti cellulari (Figura 17). Ad
esempio, le sostanze idrosolubili lavorano a livello del citoplasma e vengono poi escrete, mentre
quelle liposolubili, come il β-carotene e l'α-tocoferolo, si situano nei lipidi della membrana
cellulare, fornendo uno schermo protettivo nei confronti dei radicali.
Fig. 17 - Distretti
cellulari in cui sono
presenti alcuni
antiossidanti
54
Gli antiossidanti sono, quindi, sostanze fondamentali per la nostra salute, in quanto rappresentano
le difese essenziali delle cellule contro il danno da radicali liberi endogeni ed esogeni, mantenendo
l’equilibrio ossido-riduttivo. Un deficit significativo di questi "indicatori della salute cellulare" è,
infatti, incompatibile con difese e funzioni cellulari efficienti. Va tenuto presente, però, che
ciascun antiossidante ha un campo di azione limitato ad uno o due specifici radicali liberi.
Pertanto, solo un’alimentazione completa ed equilibrata può garantire un'efficace azione
antiossidativa. Se però il quantitativo di radicali liberi prodotti è superiore a quello fisiologico, il
nostro sistema antiossidante non è più in grado di neutralizzare questo eccesso, perciò i radicali
liberi aggrediscono le cellule, provocando danni più o meno gravi. E ci troviamo in stress
ossidativo.
Lo “stress ossidativo” consiste, quindi, nello squilibrio fra produzione di radicali liberi e capacità
di difendersi grazie ad una serie di sostanze antiossidanti (Figura 18). Lo stress ossidativo, se
continuo nel tempo, è associato con la patogenesi ed il peggioramento di svariate malattie che
includono il rischio di cancro, l’infarto, i disturbi coronari cardiaci, la cataratta, le malattie cronicodegenerative (artrosi, malattie autoimmuni, ecc.), la depressione, l'invecchiamento precoce e tante
altre. Per la prevenzione della nostra salute e per combattere l’invecchiamento cellulare è
fondamentale conoscere e mantenere l’equilibrio fra sostanze ossidanti ed antiossidanti nel nostro
organismo.
P
R
O
O
S
S
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I
A
N
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Fig. 18 - Bilancio dello
stress ossidativo
Oggi, grazie alla ricerca scientifica, siamo finalmente in grado di misurare lo stress ossidativo con
le analisi di laboratorio più sofisticate e moderne. La Figura 19 riporta esempi di dosaggi, alcuni
dei quali vedremo più avanti in maniera approfondita. La misurazione dello stress ossidativo può
essere, quindi, una fonte di informazioni preziose per la prevenzione ed il trattamento di svariate
patologie, alcune delle quali di grande rilevanza socio-sanitaria.
STRESS OSSIDATIVO:
VALUTARE PER RIEQUILIBRARE
Valutare “l’attacco”
Valutare la “difesa”
d-ROMs
d-ROMs test,
MDA, Isoprostani,
Isoprostani,
Carbonili,
Carbonili, AOPP...
Tocoferoli,
Tocoferoli, Carotenoidi,
Carotenoidi,
Vitamina C, Gruppi -SH,
BAP test...
Fig. 19 - Alcuni esempi di
dosaggi per la valutazione
dello stress ossidativo
VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO
PREVENZIONE E MONITORAGGIO
DELLA MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSIDATIVO
55
PARTE SPERIMENTALE
56
CAPITOLO IV : SCOPO DELLA RICERCA
57
4.1 - SCOPO DELLA RICERCA
Il latte bovino crudo è stato recentemente oggetto di numerosi studi scientifici che ne hanno messo
in luce alcune componenti chiave di molecole ad effetto nutraceutico, in grado, cioè, di esercitare
un ruolo importante nella protezione dell’organismo umano nei confronti di severe patologie, quali
le malattie cardiovascolari, quelle degenerative ed alcune neoplasie. I trattamenti termici del latte
bovino, ampiamente diffusi per azzerare la possibile patogenicità di eventuali microrganismi
presenti, causano una drastica riduzione delle funzionalità biochimiche delle componenti del latte
e, di conseguenza, significativa perdita degli effetti benefici di tali biomolecole. Il latte bovino
crudo, non sottoposto a trattamenti termici ma scrupolosamente controllato dal punto di vista
igienico-sanitario e microbiologico/virologico, rappresenta una fonte ottimale di principi attivi ad
effetti benefici poco conosciuti e con ampie applicazioni a finalità nutrizionali e terapeutiche finora
sottovalutate.
Per questi motivi, lo scopo principale di questa ricerca è stato quello di studiare l’effetto
antiossidante del latte bovino crudo, proveniente dagli allevamenti dell’Azienda Busetto-Vicari di
Montecalvo
in
Foglia
e
rigorosamente
controllati
dal
punto
di
vista
microbiologico/igienico/sanitario e batteriologico/virologico dall’Istituto Zooprofilattico di
competenza, e reperibile/commercializzato alla temperatura di 1°-3° C in distributori automatici in
Urbino ed altre città limitrofe. Le fasi della sperimentazione sono state le seguenti:
•
Raccolta di campioni di latte crudo in orari diversi di giorni diversi della settimana scelti
random e per la durata di 3 mesi e ripetuti successivamente per altri tre mesi con orari e giorni
diversi.
•
Raccolta nelle stesse condizioni giornaliere di latte intero a lunga conservazione e fresco,
commercializzato presso un Ipermercato di Urbino (di cui si tiene riservata la Marca Aziendale).
•
Campioni di latte umano sono stati gentilmente donati da donne nel primo trimestre di
allattamento.
•
Valutazione della capacità antiossidante totale con il metodo ORAC (Oxygen Radical
Absorbance Capacity).
•
Analisi dei tioli totali (proteici e glutatione) come sistema di difesa antiossidante idrosolubile.
•
Studio elettroforetico delle proteine contenenti cisteine (sia in forma ossidata che ridotta).
58
CAPITOLO V : MATERIALI E METODI
59
5.1 - CAMPIONI DI LATTE CRUDO
I campioni di latte bovino crudo provengono da allevamenti dell’Azienda Agricola Busetto-Vicari
di Montecalvo in Foglia [124], che sono rigorosamente controllati dall’Istituto Zooprofilattico di
competenza.
Aliquote di latte crudo bovino sono state prelevate dal distributore automatico di Urbino; tale
prelievo è avvenuto in orari diversi di giorni diversi della settimana, per la durata di almeno tre mesi
e ripetuti successivamente per altri tre mesi. I campioni di latte crudo sono stati prelevati alla
temperatura di 1°-3° C ed immediatamente trasportati in ghiaccio nei nostri laboratori per le analisi
biochimiche. Nelle stesse condizioni giornaliere, è stato acquistato latte intero fresco ed a lunga
conservazione presso un Ipermercato di Urbino. Per questioni di privacy, si ritiene doveroso
sottacere l’Azienda produttrice.
Inoltre, 10 donne in fase di allattamento (primo trimestre) hanno gentilmente donato piccole
aliquote di latte per effettuare uno studio comparativo.
Globalmente, nel presente studio sono stati analizzati i seguenti campioni di latte:
•
50 campioni di latte crudo bovino dell’Azienda Busetto-Vicari
•
50 campioni di latte bovino fresco (trattamento HTST)
•
50 campioni di latte bovino a lunga conservazione (trattamento UHT)
•
20 campioni di latte umano in fase matura
60
5.2 - METODO ORAC
Il metodo ORAC [125] (Oxygen Radical Absorbance Capacity) è un sistema in grado di
determinare la capacità antiossidante di composti polari e apolari. Gli antiossidanti del composto
vengono fatti reagire con i radicali perossilici (pro-ossidanti) in presenza di fluorescina, che
funziona da rivelatore dello svolgimento della reazione. Finché gli antiossidanti sono in grado di
catturare i radicali, essi proteggono la fluorescina dal decadimento; terminato l’effetto degli
antiossidanti, i radicali reagiscono con la fluorescina, che perde fluorescenza. Il tempo di
decadimento della fluorescenza è proporzionale alla quantità ed all’attività degli antiossidanti
presenti nel campione. Il valore numerico delle unità ORAC si esprime in µmoli di equivalenti
Trolox e si calcola valutando l’area sottesa dalla curva di decadimento della fluorescenza in
presenza del campione, sottratta del bianco e rapportata a quella del Trolox, un analogo idrosolubile
della vitamina E che funziona da standard. Il metodo ORAC è stato validato anche per antiossidanti
lipofilici, effettuandolo in presenza di ciclodextrine. Questi polimeri inglobano le sostanze
lipofiliche, rendendole idrosolubili e lasciandole accessibili all’attacco dei radicali. In pratica, con il
metodo ORAC, si può avere sia la capacità antiossidante dei composti idrosolubili che di quelli
liposolubili; addizionando le due quantità si ottiene il valore di ORAC totale del prodotto.
Nel nostro studio, come generatore di radicali è stato utilizzato l’AAPH 55 Mm ed il trolox 1 µM
come standard. Tutte le sostanze sono state sciolte e diluite con tampone fosfato 75 Mm Ph 7.0 e
sono state testate in triplo, in una piastra da 96 pozzetti. Abbiamo impostato lo strumento su
Eccitazione 485 nm, Emissione 520 nm a una temperatura di 37 °C. Gli assorbimenti sono stati
registrati ogni 180 secondi dopo aver aggiunto l’AAPH, per un tempo totale di 100 minuti.
I risultati finali (valore ORAC relativo) sono stati calcolati usando la differenza dell’area del
decadimento della fluorescenza (AUC) tra il campione ed il bianco, ed espressi come equivalenti di
Trolox (come mostrato nell’equazione seguente):
Valore ORAC relativo (Trolox equiv.) = [(AUCcampione - AUCbianco)/(AUCTrolox - AUCbianco)] x
(molarità del Trolox/molarità del campione)
Il metodo ORAC, che misura l’inibizione antiossidante dell’ossidazione indotta dai perossi-radicali,
ha fornito informazioni interessanti a proposito delle proprietà antiossidanti dei vari campioni
biologici, dai composti puri come la melatonina, la dopamina e i flavonoidi, a matrici più complesse
come tè, frutta, vegetali e bevande [126].
61
5.3 - DOSAGGIO DEI TIOLI TOTALI
I tioli sono composti organici contenenti gruppi sulfidrilici in grado di contrastare l’azione dei ROS
neutralizzandone la tossicità, interrompendo le reazioni a catena e neutralizzando l’azione istolesiva
del radicale ossidrile. Essenzialmente, tutti i gruppi sulfidrilici (SH) del plasma sono associati a
proteine. Nel latte bovino, la β-lattoglobulina è la proteina più abbondante (da sola rappresenta il
50% dell’attività antiossidante totale) ed insieme alla α-lattalbumina rappresentano potenti
antiossidanti extracellulari (P-SH) del latte bovino, che però non sono presenti nel latte umano.
5.3.1 - Procedura di dosaggio
BIANCO (μl)
CAMPIONE (μl)
Na2HPO4 0,2 M + Na2EDTA 2 mM
900
900
Latte
--100
PBS
100
--LETTURA 412 nm (abs 1)
DTNB 10 mM in Na2HPO4 0,2 M
20
20
INCUBARE a Temperatura ambiente per 15 min
LETTURA 412 nm (abs 2)
5.3.2 - Principio del metodo
Il DTNB si lega ai gruppi –SH del campione e forma un composto colorato, che assorbe a 412 nm.
L’intensità del colore sviluppato è direttamente proporzionale alla concentrazione dei tioli totali (sia
proteici sia liberi). Il range di riferimento del plasma umano è compreso tra l’intervallo 400-600
μM.
62
5.4 - DOSAGGIO DELLE PROTEINE TOTALI
Il contenuto delle proteine totali è stato determinato con la metodica di Bradford, utilizzando un kit
commerciale della Bio-Rad (Bio-Rad Protein assay), usando l’albumina sierica bovina come
standard e leggendo l’assorbanza del campione contro bianco e contro standard alla lunghezza
d’onda di 595 nanometri; i risultati ottenuti sono stati plottati su grafico contro retta di taratura
ottenuta con lo standard di albumina, ed espressi come mg/mL.
5.5 - SEPARAZIONE ELETTROFORETICA DELLE PROTEINE
CONTENENTI CISTEINE ED IDENTIFICAZIONE CON AEDANS
La separazione elettroforetica delle proteine del latte è stata effettuata con la metodica Laemmli,
utilizzando gel di poliacrilammide su piastra verticale, alla concentrazione del 10% in presenza di
sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE).
Per lo studio elettroforetico sono state usate aliquote di 150μg di proteine totali per ogni test.
Il gel di poliacrilamide è stato preparato in accordo con la tecnica di Laemmli, adattata al gel su
piastre di vetro, utilizzando l’apparecchiatura per minigel della BioRad, secondo lo schema
seguente:
63
Sopra il gel separante è stato posto uno stacking gel al 4%, per permettere una miglior separazione
dei polipeptidi. Una volta polimerizzato, il gel è stato immerso nella soluzione fredda del tampone
di corsa, costituito da Tris-Glicina-SDS pH 8.3 secondo Laemmli e, dopo il caricamento dei
campioni, è stato applicato un voltaggio costante di 105 V per circa 2 ore.
Per rendere evidenti le proteine contenenti cisteine, i campioni di latte sono stati trattati con sample
buffer riducente secondo Laemmli (contenente 62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, 35% glicerolo, 5% βmercaptoetanolo, 2,5% Triton X-100, 4% SDS, 0,002 NaN3 e 0,01% blu di bromofenolo),
incubando a 2°C per 16 ore. Ad ogni campione è stata poi aggiunta un’aliquota di 5-I-AEDANS
alla concentrazione finale di 75mM, ed i campioni sono stati poi incubati per 2h a 22°C, con
aggiunta di 2μl di NaOH 2M. Successivamente, sono stati aggiunti 9 volumi di Etanolo freddo ed è
stata effettuata una centrifugazione a 10000 g per 10 min a 4°C; il pellet, lavato due volte, è stato
disciolto in sample buffer riducente e caricato su gel.
Al termine della corsa elettroforetica, il gel è stato lavato in acqua e posto sul transilluminatore UV,
alla lunghezza d’onda di 366nm. Le bande fluorescenti delle proteine contenenti cisteine sono state
fotografate e successivamente analizzate con densitometria computerizzata, con l’ uso del software
Image Pro-Plus (Cybernetics).
5.6 - ANALISI STATISTICHE
Tutti i risultati delle analisi biochimiche effettuate sui campioni di plasma e siero sono stati ottenuti
da almeno due esperimenti indipendenti, ed eseguiti sempre in duplicato. Il valore medio ± errore
standard, così come le analisi statistiche eseguite, è stato calcolato utilizzando il software Graph
Pad versione 4 (Abacus Concepts)
64
CAPITOLO VI: RISULTATI
65
6.1 - RISULTATI
L’analisi dei principali componenti del latte bovino crudo comparato con quello umano maturo è
dettagliato nella Tabella 12.
Composizione g/100mL
Umano
Bovino
Proteine Totali
1.0
3.3
β-lattoglobulina
n.d.
0.3
Grassi
4.4
3.3
Carboidrati
6.9
4.7
Tab. 12 - composizione del
latte bovino crudo e di quello
umano
Il contenuto delle proteine totali è risultato significativamente più alto nel latte bovino crudo
rispetto a quello umano (p<0.001). In particolare, la frazione della β-lattoglobulina risulta essere
presente esclusivamente nel latte bovino crudo, in cui rappresenta il 10% del contenuto proteico
totale. Tale proteina è caratterizzata da gruppi tiolici liberi, e quindi rappresenta una importante
fonte di residui di cisteina, la cui funzionalità come antiossidante è già nota in letteratura [62].
Rispetto al latte umano, il latte crudo bovino contiene minor quantità sia di carboidrati che di grassi
totali, che rivestono minore importanza sulla capacità antiossidante totale.
I biocomposti che possiedono una attività antiossidante sono graficamente riportati in ordine
40
35
30
25
Tab. 13 – Biocomposti con
capacità antiossidante
20
15
10
Vitamina A
Carotenoidi
Bilirubina
Vitamina E
Viatmina C
0
Acido urico
5
Tioli proteici
Capacità antiossidante totale (ORAC %)
decrescente di capacità funzionale nella Tabella 13.
66
Come si può vedere dal grafico, la più efficace potenzialità antiossidante è data dal contenuto dei
tioli, con valori significativamente superiori all’attività antiossidante di tutti gli altri componenti
circolanti.
Per questo motivo, nel presente studio abbiamo voluto analizzare la capacità antiossidante totale del
latte crudo bovino, utilizzando il metodo ORAC, che determina l’attività scavenging nei confronti
dei radicali liberi (radicali perossidici), sia per sostanze lipo- che idro-solubili. La capacità
antiossidante è espressa come μmol di equivalenti di Trolox per grammo di proteina totale. Il
Trolox, analogo della vitamina E, è usato come potente antiossidante e calibratore della reazione.
Come si vede dalla Figura 20, il latte crudo bovino contiene la più alta attività antiossidante,
significativamente più alta rispetto sia al latte umano che a quello bovino trattato con procedure
termiche commerciali.
2500
Crudo
HTST
2000
uMol TE/L
UHT
1500
Fig. 20 - Analisi dell’attività antiossidante
del latte bovino e di quello umano
1000
500
0
Bovino
Umano
La capacità antiossidante totale mostrava significative differenze tra il latte umano ed il latte bovino
commerciale trattato termicamente (sia quello fresco trattato rapidamente al calore HTST, sia quello
a lunga conservazione trattato UHT).
Come noto in letteratura, sebbene nessun test di laboratorio può accuratamente riflettere la capacità
funzionale di tutti gli antiossidanti, il Test ORAC rappresenta il test di riferimento, per semplicità di
esecuzione, possibile automazione e significativa riduzione della sottostima della capacità
antiossidante dei prodotti secondari di reazione (dovuto ai tempi lunghi di reazione); questo metodo
67
è ritenuto il goal standard, in quanto il radicale libero predominante trovato nei sistemi biologici è il
radicale perossidico.
In accordo con i dati di letteratura riportanti il cross-link tra gruppi tiolici liberi dopo trattamento
termico dei campioni biologici [4], abbiamo analizzato il contenuto dei tioli liberi nei campioni di
latte. Come si vede nella Figura 21, la concentrazione dei gruppi tiolici liberi nel latte crudo bovino
risulta essere 2,3 volte più alta rispetto ai valori medi identificati nel latte bovino trattato al calore e
nel latte umano.
300
Crudo
HTST
UHT
uMol -SH/L
200
Fig. 21 - Concentrazione dei gruppi
tiolici liberi nel latte bovino ed in
quello umano
100
0
Bovino
Umano
In particolare, il latte bovino commerciale trattato UHT per la lunga conservazione, contiene il
livello più basso di gruppi tiolici liberi, più basso di quello umano che risulta fisiologicamente privo
della β-lattoglobulina, maggior componente proteico contenente cisteine. Questo dato suggerisce
che il trattamento al calore del latte bovino riduce drasticamente la concentrazione delle proteine
contenenti cisteine, diminuendo della metà il contenuto dei tioli liberi e, contemporaneamente,
anche la capacità antiossidante totale.
Per analizzare quante proteine contenenti cisteine sono reperibili nel latte bovino ed umano,
abbiamo eseguito una elettroforesi su poliacrilammide seguita da colorazione specifica per le
cisteine. Come si vede dalla Figura 22, il latte umano contiene significativamente minor quantità di
proteine con cisteine nella propria struttura rispetto al latte bovino.
68
Fig. 22- Elettroforesi
proteica del latte bovino e di
quello umano
β-lattoglobulina
36kDa
α-lattalbumina
14kDa
Umano
Bovino UHT Bovino crudo
In particolare, la colorazione AEDANS ha messo in evidenza che nel latte bovino crudo la βlattoglobulina è presente come doppietto proteico, che rappresenta il 10% del contenuto proteico
totale. La sua attività antiossidante è nota in letteratura, così come la sua sensibilità al trattamento
termico. In particolare, il trattamento UHT del latte bovino inattiva e/o degrada significativamente
la proteina, che quindi perde la sua attività antiossidante, giustificando il dimezzamento della
capacità antiossidante del latte UHT rispetto a quello crudo.
69
CAPITOLO VII: CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
70
7.1 - CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
Dalla letteratura è noto che
molti dei componenti del latte bovino sono suscettibili alle
modificazioni indotte da trattamenti termici, anche se per breve durata. Infatti, le due maggiori
componenti proteiche del latte bovino (β-lattoglobulina ed α-lattalbumina) dopo trattamento al
calore UHT e HTST (usati per la commercializzazione) vengono denaturate ed associate alle
micelle di caseina ed ai globuli di grasso.
Il trattamento al calore causa l’incorporazione delle proteine del siero del latte, in particolare per le
proteine β-lattoglobulina ed α-lattalbumina, con globuli di grasso, portando a drastici e significativi
cambiamenti conformazionali di queste proteine e loro perdita di funzionalità ed attività biologica.
Oltre all’effetto su queste principali proteine del latte bovino, il trattamento UHT e HTST provoca
un significativo decremento delle concentrazioni di vitamine C ed E che, assieme alle termolabili
forme enzimatiche della superossido dismutasi, glutatione perossidasi e della catalasi, rappresentano
le principali fonti di agenti detossificanti la perossidazione.
Il trattamento commerciale UHT e HTST provoca nel latte crudo bovino la denaturazione delle
proteine del siero, portando ad interazioni idrofobiche tra le proteine stesse; questi effetti cuasano
perdita significativa di attività biologica.
In particolare, con il presente studio abbiamo dimostrato che il trattamento termico del latte crudo
diminuisce i gruppi sulfidrilici liberi ed altera significativamente i gruppi tiolici proteici. Per quanto
riguarda la β-lattoglobulina, la principale proteina del siero del latte bovino con ruolo antiossidante,
il trattamento al calore ha provocato l’esposizione del gruppo tiolico libero, dando il via ad una
serie di reazioni/interazioni con altre proteine denaturate al calore. I cambiamenti conformazionali
da temperatura e l’associazione con altre proteine, oltre alla possibilità di degradazione in subunità
di queste proteine contenenti cisteine, possono spiegare la riduzione del 50% circa della capacità
antiossidante totale riscontrata dopo trattamento termico del latte crudo bovino.
71
Con il presente studio, abbiamo dimostrato che il trattamento al calore, in particolare il trattamento
UHT, ma anche quello HTST, provoca un decremento significativo della capacità antiossidante
rispetto a quella fisiologicamente riscontrata nel latte crudo bovino.
Il latte crudo bovino, quindi, se rigorosamente controllato dal punto di vista microbiologico e
igienico-sanitario, risulta un alimento con proprietà antiossidanti notevoli, in grado di proteggere
l’organismo umano dagli effetti dannosi dei ROS, sia esogeni che endogeni.
Il latte crudo bovino contiene biocomponenti (in parte ancora da identificare) che hanno da una
parte effetti altamenti nutritivi e dall’altra conferiscono una elevata protezione immunologica,
hanno effetti ipotensivi, giocano un ruolo importante come agenti anti-carcinogenici, ed effetti
ipolipidemici [51]. Infine, è stata dimostrata la forte attività di protezione nei confronti dei danni
ossidativi [127].
In conclusione, tutti questi risultati, congiuntamente alle nostre osservazioni, mettono in luce le
proprietà del latte crudo bovino in grado di migliorare significativamente lo stato di salute di coloro
che assumono questo alimento senza alcun trattamento termico. L’uso del latte crudo bovino può,
quindi, avere proprietà nutraceutiche per il trattamento di varie patologie, diminuendo il rischio di
malattia ed aumentando le difese fisiologiche.
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