LIFE Project Number
LIFE03 ENV/IT/323 - FALL
“Protocollo analitico”
Determinazione di fibre di amianto in percolati di discarica
Scritto da Luca Zamengo* e Sergio Malinconico**
Revisionato da Stefano Polizzi* e Federica Paglietti**
*Università Ca’ Foscari di Venezia
**ISPESL
Venezia, 10/7/2007
INDICE
pag.
1.
2.
3.
4.
3
3
4
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5
5
6
7
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11
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12
13
13
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17
17
17
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18
21
21
25
25
25
25
26
26
26
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28
30
30
31
5.
6.
7.
8.
SCOPO E APPLICAZIONE
STRUTTURA
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI
CAMPIONAMENTO
4.1. Materiale necessario al campionamento
4.2. Modalità di campionamento
4.3. Conservazione dei campioni
PRETRATTAMENTO
PROCEDURE DI ANALISI
6.1. Sensibilità analitica e volume di filtrazione
6.2. Analisi SEM
6.2.1. Filtrazione
6.2.2. Coating
6.2.3. Osservazione
6.2.4. Conteggio
6.2.5. Filtri bianchi
6.3. Analisi TEM
6.3.1. Creazione della replica
6.3.2. Dissoluzione della membrana
6.3.3. Estrazione della replica
6.3.4. Osservazione
6.3.5. Conteggio
6.3.6. Filtri bianchi
6.3.7. Scheda tecnica: approccio statistico
6.4. Analisi MOCF
6.4.1. Preparazione del campione (vetrini)
6.4.2. Campi microscopici da esaminare
6.4.3. Criteri di conteggio DIR CEE 83/477
6.4.4. Calcolo della concentrazione
6.4.5. Conteggio
6.4.6. Limite di rilevabilità
6.4.7. Filtri bianchi
CONCLUSIONI
APPENDICI
8.1. Schema per la registrazione dati
8.2. Immagini
2
1. SCOPO E APPLICAZIONE
Il metodo qui proposto è stato elaborato al fine di quantificare il contenuto di fibre di
amianto presenti in percolati di discarica ed in generale in liquidi che presentano un
alto contenuto di materiale organico interferente come effluenti, acque residue,
fanghi liquidi, ed altri. Attualmente non esistono metodi approvati per la
determinazione delle fibre di amianto in simili liquidi ed è consuetudine eseguire
queste analisi modificando o rielaborando le metodiche ufficiali valide per le
misurazioni in campioni di acqua destinata all’uso domestico.
In questo documento sono esposte metodiche e procedure per condurre analisi con
tecniche di microscopia elettronica a scansione SEM, microscopia elettronica in
trasmissione TEM e microscopia ottica a contrasto di fase MOCF.
Il metodo permette di valutare la concentrazione numerica delle fibre di amianto
standard (vedi §3) e quelle di dimensioni inferiori, la loro identificazione minerale e
di evidenziare e quantificare ulteriori fibre asbestiformi. Le dimensioni minime delle
fibre di amianto riconoscibili variano in funzione sia della tecnica adottata e della
relativa sensibilità analitica sia della quantità di materiale interferente organico ed
inorganico presente nel campione da analizzare.
2. STRUTTURA
Il protocollo descrive inizialmente il processo di campionamento adottato per la
discarica di Barricalla (TO) e le procedure per la conservazione dei campioni.
Successivamente si descrive il processo di pre-trattamento di digestione acida sotto
irraggiamento di microonde, utilizzato al fine di diminuire l’interferenza proveniente
dalle sostanze organiche presenti nei campioni di percolato grezzo.
Una terza parte è dedicata alla descrizione del metodo di preparazione delle
membrane utilizzate come supporto per le fibre da osservare.
Da ultimo sono descritte le procedure di misura specifiche per le tre tecniche
analitiche utilizzate per quantificare e classificare mineralogicamente le fibre di
amianto.
Un capitolo conclusivo discute alcune indicazioni sui limiti di applicazione delle tre
tecniche, emerse durante i due anni di analisi effettuate sui percolati della discarica
Barricalla nell’ambito del Progetto LIFE-FALL
3
3. DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI
Aggregato di fibre: insieme di fibre orientate casualmente.
Amianto o asbesto: termine commerciale applicato ad un gruppo di silicati idrati che
tendono a separarsi in sottili fibre, flessibili e resistenti a trazione e al calore,
chimicamente inerti.
Anfiboli: gruppo di silicati ferro-magnesiaci di struttura cristallina con caratteristica
sfaldatura secondo due facce prismatiche e di formula generale: A2,3B5(Si,
Al)8O22(OH)2 dove A=Mg, Fe2+, Ca, Na o K e B =Mg, Fe2+, Fe3+, o Al. Alcuni di
questi elementi possono essere sostitutiti da Mn, Cr, Li, Ti, Pb, o Zn. Gli anfiboli
sono caratterizzati da struttura a tetraedri a catena doppia con rapporto Si:O pari a
4:11.
Campo: porzione di superficie osservata ad un certo ingrandimento tramite tecniche
di microscopia
Crisotilo: minerale fibroso del gruppo dei serpentini: Mg3Si2O5(OH)4. Costituisce il
più diffuso ed importante tipo di amianto per uso industriale e commerciale.
EDS: Energy Dispersive Spectrum - misura delle energie e delle intensità di raggi X
caratteristici mediante un rivelatore a stato solido ed un analizzatore multicanale.
Fascio di fibre: fibra composta da più fibre parallele con diametro inferiore unite
longitudinalmente.
Fibra standard:, particella con lunghezza superiore a 5 µm e diametro inferiore a 3
µm e con rapporto dimensionale lunghezza/diametro 3:1 (normativa italiana D.Lgs
277/91)
Fibrilla: una singola fibra, di dimensioni inferiori a quelle standard, che non può
essere separata in componenti più piccole senza perdere l’apparenza e le proprietà
fibrose.
MFL: milioni di fibre per litro.
Rapporto dimensionale: il rapporto lunghezza /diametro di una fibra.
Replica: procedura nella preparazione del campione TEM con la quale si produce
una sostanziale copia sottile (replica) di una superficie.
SAED: Selected Area Electron Diffraction - tecnica in microscopia elettronica con la
quale si studia la configurazione cristallina di una piccola area di campione.
Sensibilità analitica: concentrazione calcolata in MFL equivalente al conteggio di
una fibra sulla superficie di campione analizzata. Questo fattore dipende dalla
quantità di liquido filtrata e dalla dimensione della superficie di membrana osservata.
4
4. CAMPIONAMENTO
Il campionamento viene effettuato per ogni singola cella, tramite un rubinetto
appositamente predisposto, posizionato nel primo tratto di tubatura disponibile subito
dopo l’uscita del tubo di convogliamento dall’invaso stesso.
La scelta di posizionare il punto di prelievo così vicino alla “sorgente” è stata fatta in
quanto è necessario ridurre il più possibile il tempo di contatto del percolato con
l’aria presente all’interno delle tubazioni.
Infatti la presenza di aria produce un’inversione del potenziale redox (che all’interno
del corpo della discarica è negativo) verso valori positivi. Questa inversione, dovuta
al contatto con l’ossigeno presente nell’aria, induce delle reazioni di precipitazione e
co-precipitazione di sali che si depositano quindi all’interno delle tubazioni stesse.
Nel nostro caso la presenza di fenomeni di precipitazioni di sali, diretti od indotti, va
evitata al massimo in quanto in questa fase è molto probabile, date le dimensioni
ridotte delle fibre, che durante la precipitazione vengano inglobate anche delle fibre
di amianto e che quindi si perda una parte non quantizzabile delle informazioni.
4.1. Materiale necessario per il campionamento
-
Contenitori in PE da 500 ml a collo largo con contro tappo
Contenitore (secchio) in PE della capacità di almeno 10 lt.
Acido nitrico concentrato
Pipetta graduata in PE
Guanti in lattice monouso
Maschera facciale con caratteristiche di conformità alla norma EN 149:2001 FFP3
Occhiali
Etichette adesive
Carta
Contenitore per rifiuti opportunamente etichettato
4.2. Modalità di campionamento
1) Verificare che tutto il materiale sia ben pulito.
2) Attivare l’alimentazione elettrica dell’elettropompa ed aspettare che questa
funzioni a regime (circa 10 minuti dall’accensione).
Il funzionamento a regime si individua da una diminuzione del rumore della pompa
stessa e dal fatto che si sente fluire in pressione il percolato all’interno della tubatura
di mandata.
3) Aprire con accortezza il rubinetto di campionamento e lasciar fluire nel
contenitore da 10 lt evitando il più possibile la formazione di turbolenze.
4) Chiudere il rubinetto
Dopo aver ulteriormente omogeneizzato il liquido in modo da impedire eventuali
fenomeni di sedimentazione effettuare il campionamento e riempire i due contenitori
fino all’apposita tacca
5
5) Aggiungere 2ml di acido concentrato per ogni contenitore, eventualmente
aspettare qualche istante fino alla fine dello sviluppo di effervescenza
(causato dalla eventuale presenza di carbonati)
6) Richiudere i contenitori verificando tramite capovolgimento che il
controtappo faccia bene tenuta
7) Pulire con cura i contenitori ed etichettarli.
Le etichette devono riportare almeno le seguenti informazioni:
-
data del prelievo
ora del prelievo
lotto della discarica
numero della cella
firma dell’operatore
4.3. Conservazione dei campioni
Per quanto concerne la conservazione di campioni, da sottoporre a successive analisi
per la ricerca delle fibre di amianto, non sono stati tabulati metodi ufficiali
riconosciuti, relativamente a matrici complesse quali i percolati, per cui abbiamo
previsto di associare due tipi di conservazione:
- l’aggiunta di un acido concentrato, quale l’acido nitrico, permette in parte di
impedire eventuali fenomeni di precipitazione da parte di elementi metallici
- la conservazione in ambiente refrigerato a 4°C impedisce l’eventuale sviluppo
di gas dovuti ad attività di tipo metabolico-batterico (nel percolato sono stati
comunque individuati batteri solfato riduttori e muffe)
I campioni dovranno comunque essere trasportati nel più breve tempo possibile in un
frigorifero con temperatura di circa 4°C.
Per maggior sicurezza il controcampione che verrà tenuto in archivio sarà
ulteriormente chiuso in un sacchetto di PE morbida.
6
5. PRETRATTAMENTO
Per il riconoscimento e il conteggio delle fibre di amianto in percolati attraverso
analisi in microscopia ottica o elettronica è necessario operare un pre-trattamento dei
campioni per ridurre l’interferenza dovuta al carico organico presente nei liquidi.
Le fibre di amianto presentano particolare affinità con le sostanze organiche disperse
nel liquido e senza adottare un pretrattamento dei campioni è possibile incorrere in
frequenti errori determinati dai seguenti fenomeni:
- Le fibre di amianto tendono ad aggregarsi con le sostanze organiche.
- Le fibre di amianto associate alle sostanze organiche tendono ad aderire alle
pareti dei contenitori.
- Le fibre inglobate da sostanze organiche vengono nascoste durante
l’osservazione SEM.
- Le fibre inglobate da sostanze organiche non si trasferiscono alla replica TEM.
Come pre-trattamento è stata adottata la digestione acida sotto irraggiamento di
microonde che presenta il vantaggio, rispetto ad altri tipi di ossidazione con metodi
termici tradizionali, di operare direttamente sul campione liquido e limitare
sensibilmente i tempi di reazione. È stato verificato che tale trattamento non
danneggia le fibre di amianto mediante analisi di un campione di crisotilo puro.
I percolati campionati provengono da celle di differente età, coltivate con rifiuti di
diversa tipologia e provenienza e possiedono di conseguenza differenti caratteristiche
quali/quantitative. La difficoltà di ottenere un unico procedimento utile alla
digestione di percolati con differenti caratteristiche quali/quantitative è intrinseca alle
proprietà, variabili e dipendenti da molteplici fattori, del percolato stesso (ad es.
frequenza e intensità delle precipitazioni, età della cella coltivata, tipo di rifiuto
smaltito, grado di avanzamento della stabilizzazione).
Utilizzando la stazione di lavoro a microonde MARS5 CEM è stata definita una
procedura standard per il pre-trattamento di campioni di percolato con COD inferiore
a una certa soglia (2000 mg/L di O2) e sono state identificate possibili procedure
alternative per campioni con COD maggiore. Inoltre, per i campioni MOCF è stato
suggerito un trattamento alternativo nel caso le membrane risultassero danneggiate
dalla soluzione acida.
La stazione a microonde impiegata si avvale di un set di 14 vessel in Teflon PFA
ciascuno di volume 100 ml predisposti all’attività in pressione. Ogni vessel è munito
di una valvola di sicurezza per lo sfiato ed il rilascio della pressione (nel caso venga
superata, durante la reazione, la soglia massima prestabilita). È possibile monitorare
in tempo reale gli andamenti di pressione e temperatura tramite due rivelatori
collegati ad un vessel-campione dotato di opportuni dispositivi ed ottenere grafici e
dati relativi al processo in esame come in Figura 1.
Non è possibile definire delle condizioni operative standard per liquidi contenenti
quantità incognite e variabili di inquinanti organici, ma in genere è necessario
condurre delle misurazioni preliminari con crescenti aliquote di percolato e reagenti,
monitorando i parametri di reazione e valutando la colorazione del liquido risultante.
Sperimentalmente si è potuto verificare come anche una flebile colorazione del
liquido risultante (solitamente giallastra e corrispondente ad una digestione non
completamente avvenuta) comprometta la successiva analisi microscopica.
7
E’ quindi necessario stabilire le condizioni di reazione per massimizzare la
conversione in CO2 della frazione organica presente nel liquido e favorire il
completamento della digestione ottenendo un liquido trattato pressoché incolore.
Tale conversione, che contribuisce all’innalzamento della pressione interna al vessel,
deve però essere mantenuta in regimi tali da consentire la conservazione e l’integrità
della valvola di sicurezza che, nei vessel utilizzati, è fissata ad una pressione di
rottura di 250 psi, corrispondente a circa 17atm.
La rottura della valvola causa la fuoriuscita del gas di reazione e l’impossibilità del
completamento della digestione. E’ necessario quindi dosare il volume di percolato
per vessel in funzione del carico organico da trattare e quindi della pressione
massima raggiungibile senza rottura della valvola di sicurezza.
È necessario inoltre conoscere preventivamente i limiti di temperatura ammissibili
per il materiale costituente il vessel per evitare fenomeni di termodegradazione da
surriscaldamento.
La procedura standard definita per il pre-trattamento di campioni di percolato con
COD inferiore a 2.000 mg/L di O2 prevede per ogni turno di trattamento in
successione:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Sonicazione del campione di percolato grezzo per 15 min (vedi nota 1).
Prelievo delle aliquote necessarie al caricamento dei vessels.
Caricamento vessels ed aggiunta dei reagenti.
Chiusura e bloccaggio dei vessels con pinza dinamometrica.
Predisposizione ed assegnazione numerica dei vessels su piatto rotante.
Alloggiamento nella camera del digestore del piatto rotante.
Connessione di un vessel campione ai rivelatori di pressione e temperatura.
Controllo della libera rotazione del piatto rotante.
Impostazione del programma di trattamento.
Avvio del programma di trattamento.
Controllo parametri T e P durante lo svolgimento della digestione.
Raffreddamento a programma completato fino a ca. 30°C.
Estrazione e sonicazione dei vessels ancora chiusi per 15 min.
Apertura delle valvole di rilascio sotto cappa.
Apertura e sblocco dei vessels.
In Tab.1 sono esposte le condizioni operative programmabili sullo strumento e
adottate per la digestione completa dei percolati campionati.
Percolato/vessel (ml)
H2SO4 conc. /vessel (ml)
H2O2 35% /vessel (ml)
Max vessel/turno (N°)
Percolato/turno (Max ml)
Temp. rampa I (C°)
Temp. rampa II (C°)
Pressione max rampa I(psi)
Pressione max rampa II(psi)
Potenza rampa I (W - %)
Potenza rampa II (W-%) (vedi nota 4 a fine pagina)
Mantenimento a 90° (min)
Mantenimento a 160° (min)
Tot irraggiamento (min)
Raffreddamento (min)
25
0.5
4
14
350
90
160
80
250
300 – 100%
600 – 60%
1
1
22
15
Tab.1 Condizioni operative adottate per la digestione dei percolati campionati alla discarica di
Barricalla (TO).
8
600
150
C
PSI
Dal grafico presentato come esempio in Fig.1 si vede che la digestione completa di
25 ml di percolato secondo le condizioni esposte in Tab.1, sviluppi, ad una
temperatura di 160°C, una pressione di ca. 200 psi (13.6atm) rientrando così nei
limiti di sicurezza definiti dalla strumentazione impiegata.
100
300
50
0
0
5
10
15
20
25
0
30
Time (MIN)
Figura 1. Andamento della pressione e temperatura durante l’irraggiamento di microonde. Lo
svolgersi della reazione di digestione del percolato e costantemente monitorata in tempo reale.
Al termine del pre-trattamento il liquido, dopo essersi raffreddato, è filtrato per
deposizione su membrana per la successiva analisi in microscopia.
Si sono, tuttavia, presentati dei casi in cui il metodo per il pre-trattamento dei
campioni di percolato grezzo, deve necessariamente essere modificato per una
corretta mineralizzazione.
I motivi più probabili che possono richiedere una modifica sono:
a) il carico organico del percolato è tropo alto.
b) la membrana in estere misto di cellulosa, usata per le analisi MOCF, risulta
degradata superficialmente dopo la filtrazione.
Nel primo caso è consigliabile ridurre il volume di percolato in ciascun vessel per
turno di trattamento (fino ad un minimo di 10 ml). In questo modo senza aumentare
le quantità di reagenti si può ottenere una più completa mineralizzazione del
campione. È altresì consigliabile per simili campioni, verificare che le membrane,
dopo la filtrazione, non siano ugualmente cariche di interferenti inorganici che
andrebbero a ostacolare l’osservazione delle fibre di amianto. Per questi percolati è
sempre consigliabile filtrare minori quantità di campione, ricercando il compromesso
migliore con la sensibilità analitica.
Nel secondo caso, l’acidità della soluzione può influire sulla membrana in estere
misto di cellulosa, degradando parte della superficie ed eliminando la quadrettatura
stampata utile per l’osservazione MOCF (vedi foto a fine paragrafo). In questo caso è
preferibile la sostituzione dell’acido solforico impiegato per la mineralizzazione con
miscele meno aggressive di acido nitrico-cloridrico;
9
Per questi motivi sono stati definiti due metodi alternativi specifici per i percolati dei
due lotti campionati, lotto 3 (COD inferiore ai 2.000 mg/L) e lotto 2 (COD superiore)
e in funzione del tipo di tecnica microscopica che sarà adottata per le analisi. Questi
metodi prevedono l’utilizzo di una miscela reagente alternativa all’acido solforico e
delle quantità di percolato adeguate al carico organico iniziale del liquido. Tali
metodi sono riassunti nelle tabelle seguenti:
MOCF
Lotto 2
Lotto 3
10 ml percolato
25 ml percolato
2
(20%)
2.5 ml HNO3 (10%)
(12%)
2 ml H2O2 (6%)
ml HNO3
1.2 ml HCl
SEM/TEM
Lotto 2
Lotto 3
10 ml percolato
25 ml percolato
2.5 ml HNO3
(10%)
1.5 ml HNO3
1
ml H2O2
1 ml HCl
(15%)
(10%)
(10%)
2
ml H2O2
1.5 ml HCl
(8%)
(6%)
Le percentuali tra parentesi rappresentano in rapporto volumetrico con il percolato
utilizzato. L’HNO3 è diluito al 20%, ’H2O2 al 35%.
Immagini rappresentative della degradazione subita dalle membrane in EMC (adottate per le
analisi MOCF) a seguito dell’impiego di acido solforico per il pre-trattamento dei campioni.
10
6. PROCEDURE DI ANALISI
Le tre tecniche analitiche prevedono le seguenti fasi primarie in comune:
a) Campionamento
b) Conservazione
c) Pretrattamento
Le metodiche di Campionamento e Conservazione sono descritte nel § 4. La
metodica di Pre-trattamento del campione di percolato grezzo è descritta nel § 5.
Successivamente, in funzione della tecnica utilizzata, si adotteranno diverse
procedure per la:
d)
e)
f)
g)
Filtrazione
Preparazione
Osservazione
Conteggio
In appendice 8.1 è riportato uno schema proposto per la registrazione dei conteggi.
Note alle procedure
1) Molti edifici e strutture contengono amianto o altri materiali fibrosi che possono interferire con le
analisi. E’ di primaria importanza che tutte le fasi di preparazione siano eseguite in un ambiente dove
la contaminazione del campione sia minimizzata.
L’area destinata alla preparativa dei campioni deve essere separata da fonti potenzialmente
contaminanti come pavimentazioni, soffitti, coibentazioni e materiali di varia natura contenenti
amianto. Sarà necessario inoltre predisporre set di filtri bianchi da sottoporre alle stesse procedure
di quelli adoperati per la filtrazione del percolato. Su tali bianchi saranno effettuate letture in
microscopia che forniranno il valore del “ fondo ambientale”.
2) Si è scelto di analizzare sia alla MOCF che al SEM per ogni campione, 1 mm2 di superficie delle
membrane sopra menzionate, prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano
6/9/1994 per l’analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato aerodisperso in
quanto unico riferimento disponibile.
6.1. Sensibilità analitica e volume di filtrazione
La preparazione delle membrane da osservare tramite tecniche di microscopia è un
punto critico delle procedure. L’obiettivo è quello di produrre un filtro sul quale sia
distribuito uniformemente il particolato presente nel liquido minimizzando la
sovrapposizione di particelle.
Come primo passaggio si effettuerà l’omogeneizzazione del campione di liquido da
filtrare (già sottoposto a digestione acida con microonde) tramite sonicazione, ovvero
l'azione controllata di onde ultrasoniche ad alta intensità. Tale processo produce nei
liquidi il fenomeno della cavitazione, ossia la formazione durante la fase di pressione
negativa di milioni di piccole bolle che, in una delle successive fasi di compressione,
implodono con un drastico e improvviso cambiamento della temperatura e della
pressione nella zona interessata. Andranno quindi evitati fenomeni di cavitazione
intensi per non giungere alla rottura e quindi alla comminuzione delle fibre minerali
presenti nel liquido.
Il liquido, dopo una sonicazione della durata di 15 minuti viene sottoposto a
filtrazione.
11
Il volume che deve essere filtrato dipende dal diametro del sistema filtrante
utilizzato, dal contenuto dei solidi sospesi del liquido in esame ed in alcuni casi dalla
concentrazione di fibre nel liquido.
Dalla pratica si deduce che il parametro limitante è usualmente il contenuto di solidi
sospesi prevalentemente di natura organica.
La tabella 2 mostra le limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di
liquido filtrato applicabili durante osservazioni di superfici pari 1mm². In generale è
stato osservato, nel corso di numerosi tests di prova, che anche la più pallida
colorazione assunta dalla superficie del filtro è indice di eccessivo deposito. Non è
possibile assicurare che la filtrazione di volumi inferiori a 50 ml per filtri da 47 mm o
10 ml per filtri da 25 mm porti all’uniforme deposizione di particolato sulla
superficie; si è pertanto stabilito di usare volumi superiori a questi o di procedere con
diluizioni con acqua distillata.
Volume filtrato (ml)
su filtri da 47 mm** di
diametro
300
Sensibilità analitica*
(ff/litro)
3780,00
Volume filtrato (ml)
Sensibilità analitica*
su filtri da 25 mm** di
(ff/litro)
diametro ml
300
396,67
200
5670,00
200
150
7560,00
150
100
11340,00
100
50
22680,00
50
25
45360,00
25
Tab.2 Limitazioni della sensibilità analitica in funzione del volume di liquido filtrato.
595,00
793,33
1190,00
2380,00
4760,00
*Concentrazione corrispondente all’osservazione di una fibra su un’area di 1 mm².
** Assumendo che l’area effettiva di filtrazione con l’apparecchiatura impiegata sia 199 mm² per
filtri da 25mm di diametro e 1134 mm² per filtri da 47 mm di diametro (l’area effettiva di filtrazione è
il risultato della differenza tra l’area totale dei filtri e l’area di una corona circolare esterna di
larghezza di circa 4,5 mm occupata dall’apparecchiatura stessa).
6.2. Analisi SEM
L’analisi in Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) permette il riconoscimento
morfologico delle fibre di amianto e la loro classificazione mineralogica mediante
l’elaborazione di Spettri a Dispersione di Energia EDS. Il SEM consente inoltre di
definire con grande precisione le dimensioni delle fibre stesse (vedi esempi in
Appendice 8.2), classificandole come “standard”, qualora abbiano lunghezza > 5 μm
e larghezza < 3 μm, o come “micronizzate”, qualora abbiano dimensioni inferiori. In
quest’ultimo caso non è garantito l’esito dell’analisi EDS in quanto il diametro
minimo del raggio incidente potrebbe superare il diametro della fibra che si sta
cercando di classificare e conseguentemente l’analisi mineralogica resta dubbia. La
procedura messa a punto è di seguito riportata.
6.2.1. Filtrazione
a. Omogeneizzare il campione tramite sonicazione.
b. Filtrare per deposizione, su membrana in policarbonato da 0.45 µm, il
volume scelto di percolato pre-trattato (§ 5.1).
12
c. Risciacquare tutti i contenitori e i materiali utilizzati con acqua distillata e
filtrare sulla stessa membrana anche l’acqua di lavaggio.
d. Rimuovere accuratamente la membrana e riporla su di un vetrino
portaoggetti.
e. Posizionarla, numerandola in essiccatore per un tempo di 3 ore.
f. Rimuovere la membrana dall’essiccatore, ritagliarne una porzione (ca.
1cm²) e fissarla su portacampioni SEM.
Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:
- Sistema filtrante multiuso Nalgene a membrane sostituibili (volume utile 150
ml)
- Membrane Millipore in policarbonato (diametro 47mm, porosità 0.45 µm)
6.2.2 Coating
Depositare uno strato sottile, compreso generalmente tra 5 e 30 nm, di
materiale conduttivo (ad es. oro o grafite) tramite sputtering sulla superficie
della membrana per evitare fenomeni di caricamento durante l’osservazione
SEM.
Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:
-
Sputter Coater SC7620 Polaron
Target: Au
Gas ionizzato: Argon
Pressione: 6x10-2 mbar
Voltaggio applicato: 1kV
Corrente: 15 mA
Tempo di sputtering: 15 sec.
6.2.3 Osservazione
Eseguire l’osservazione di un numero campi a 2000X corrispondenti a 1 mm²
di area superficiale. Fare attenzione a non esaminare più volte lo stesso campo.
Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:
-
Microscopio elettronico JEOL JSM 5600LV con microanalisi EDS
Software interfaccia Link ISIS
Osservazioni condotte a 20KV
N° di campi osservati: 330
Area di un campo: 63.7 x 47.5 μ m² = 3025 x10-12 m²
Area totale osservata: 1 mm²
6.2.4 Conteggio
Le fibre sono conteggiate a seconda di come si presentano, ad esempio:
secondo le immagini relative alla Fig. 2b), cioè presenti come una o più fibre
che si dipartono da uno stelo comune, devono essere conteggiate singolarmente
13
quando soddisfano le dimensioni geometriche date per definizione (L > 5 μm,
D < 3 μm e rapporto L/D > 3 μm,); secondo le immagini della Fig. 2c), vanno
contate individualmente quando semplicemente intersecate, non lette invece
quando presenti in un groviglio irregolare; secondo le immagini di Fig. 2d), in
cui si osservano a contatto con un’estremità o sovrapposte a materiale
particolato. In quest’ultimo caso vi è difficoltà nel conteggiarle.
Nelle figure 2a), 2b), 2c) e 2d) è riportato, nell’angolo in basso a destra di ogni
quadrante, il valore di conteggio da attribuire all’immagine esemplificativa
proposta. La stima della lunghezza delle fibre viene riferita alla curvatura della
fibra stessa (cioè alla lunghezza reale) e secondo i dettami generali di
conteggio, contenuti al punto 10 dell’all. 5 al D.Lgs 277/91.
Per il calcolo della concentrazione delle fibre, C, si è utilizzata la formula:
C = ( n π d2) / (4 NAV) [fibre/ m3 ].
dove:
- n è il numero di fibre conteggiate sulla porzione del filtro esaminata
- N è il numero dei campi osservati per ricoprire l’area di 1 mm² a 2000
ingrandimenti
- d è il diametro effettivo della membrana in metri
- A è l’area di un campo a 2000x, in m²
- V è il volume di liquido filtrato, in m³.
6.2.5 Filtri bianchi
Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la
letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati o, in alternativa uno per ogni set. Il
numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato
per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 4; in caso contrario
occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta
valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri bianchi
dovranno essere esposti all’aria, in laboratorio, nel luogo ove si esegue il
filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore).
Note:
1)Le fibre di amianto sulle membrane, durante l’analisi in microscopia elettronica, possono presentarsi sotto vari aspetti:
a) fibre singole;
b) fibre divise;
c) fibre raggruppate;
d) fibre con altre particelle.
Le fibre sono conteggiate a seconda di come si presentano:
Nelle figure 2a), 2b),2c) e 2d) è riportato, nell’angolo in basso a destra di ogni quadrante, il valore di conteggio da attribuire
all’immagine esemplificativa proposta. La stima della lunghezza delle fibre viene riferita alla curvatura della fibra stessa (cioè
alla lunghezza reale) e secondo i dettami generali di conteggio vengono considerate le fibre quando soddisfano le dimensioni
geometriche date per definizione (L > 5 μm, D < 3 μm e rapporto L/D > 3,) DLgs 277/91;
2)Al fine di una più completa ed esauriente valutazione delle analisi è opportuno considerare anche le fibre che:
− presentano un diametro <1µm e non si rende possibile il riconoscimento tramite analisi EDS nel qual caso verranno
catalogate come” fibre sospette”
− presentano una lunghezza inferiore a 5 µm ma mantengono il rapporto dimensionale 3:1. nel qual caso verranno
catalogate come” fibrille” e “fibrille sospette”.
14
Fig. 2a)Rappresentazione esemplificativa di fibre singole
Fig.2b)Rappresentazione esemplificativa di fibre divise
15
Fig. 2c) Rappresentazione esemplificativa di fibre raggruppate
Fig. 2d)Rappresentazione esemplificativa di fibre con altre particelle
16
6.3 Analisi TEM
L’analisi in Microscopia Elettronica in Trasmissione (TEM) permette il
riconoscimento morfologico anche delle fibre più piccole (vedi esempi in Appendice
8.2), difficilmente osservabili al SEM, e la loro classificazione mineralogica
mediante l’elaborazione di Spettri a Dispersione di Energia EDS e di Pattern di
Diffrazione Elettronica SAED. Il TEM è in grado di rilevare la presenza di fibre
ultrafini, con diametri inferiori ai decimi di micron e lunghezze minori di 1 µm,
superando decisamente i limiti di risoluzione del microscopio elettronico a scansione.
Sono stati condotti test al fine di ottimizzare la metodica di preparazione dei
campioni TEM impiegando la tecnica della “Replica Estrattiva”.
In particolare il procedimento adottato prevede i seguenti punti in successione:
- creazione della replica
- dissoluzione della membrana
- estrazione della replica
6.3.1 Creazione della replica
a. Dopo la fase di filtrazione ed essiccazione, ritagliare le membrane di
policarbonato con porosità di 0,45 μm in porzioni di dimensioni (15x3)
mm prelevate dalla zona diametrale del filtro.
b. Fissare le membrane cautamente ad un vetrino, numerarle e porle nella
camera di deposizione di un Carbon Vacuum Evaporator per il
ricoprimento con uno strato sottile di carbone e la creazione della replica.
c. Portare il vuoto nella camera di evaporazione ad un livello di circa 10-4
Torr (0.013 Pa).
d. Evaporare il carbone con intermittenza per evitare un surriscaldamento
della membrana.
e. Depositare uno strato sottile di circa 30 o 50 nm sulle striscioline di
membrana.
6.3.2 Dissoluzione della membrana
a. Dopo il ricoprimento al carbonio, lasciare galleggiare le porzioni di
membrana direttamente in un bagno di cloroformio per alcune ore.
b. Utilizzare una capsula-petri profonda almeno 2 cm e riempirlo per ¾ con
cloroformio.
c. Sistemare con cura la membrana sulla superficie del liquido, evitando di
sostare a lungo tra i vapori di cloroformio che tenderanno ad arricciarne la
superficie.
d. Dopo alcune ore (in genere 3 ore) il policarbonato della membrana sarà
dissolto dal cloroformio
e. Sullo strato di carbonio rimarranno saldati gli oggetti prima presenti sulla
membrana.
6.3.3 Estrazione della replica
a. Il contenuto della replica galleggiante è raccolto inserendo dal basso una
grid TEM con idonea pinzetta, e sollevando una porzione della replica.
17
b. In genere da una replica di 15x3 mm si possono ricavare 2 o 3 grid con
sufficiente margine.
c. Le repliche al carbonio sono depositate su grid di rame (300 mesh) di 3
mm di diametro
6.3.4 Osservazione
Ogni particella con un rapporto dimensionale di 3:1 o superiore e di origine
non-biologica deve essere esaminata come sospetta fibra di amianto. Le fibre
sono inizialmente classificate in base alla loro morfologia, successivamente si
esaminano gli spettri di composizione (EDS) e i pattern di diffrazione (SAED):
Per le fibre con morfologia tubolare, sospette di essere fibre di crisotilo, è
consigliabile esaminare il pattern di diffrazione prima di eseguire l’analisi EDS
in quanto l’alta densità di corrente impiegata per l’analisi può danneggiare la
fibra e rendere impraticabile il successivo confronto di diffrazione.
Se al contrario la fibra non possiede morfologia tubolare viene ritenuta sospetta
anfibolo. In questo caso l’ordine dei controlli non è rilevante essendo fibre
caratterizzate da alta resistenza e di difficile degradazione.
L’utilizzo della diffrazione elettronica su fibre a simmetria cilindrica come
quelle di crisotilo è applicabile sotto qualsiasi orientazione. Al contrario per gli
anfiboli è necessario allineare, parallelamente al raggio incidente, un asse
cristallografico principale della struttura cristallina della fibra.
Il numero di fibre che devono essere contate dipende dalla precisione statistica
richiesta. In assenza di fibre, l’area della grid che deve essere esaminata
dipende dalla sensibilità analitica richiesta. Per ragioni statistiche dovrebbero
essere contate fibre su almeno 4 openings (aperture della grid). La precisione
del conteggio dipende non solo dal numero totale di fibre contate, ma anche
dalla loro uniformità e disposizione tra le openings. Nella pratica è stato trovato
che terminare un conteggio alla centesima fibra osservata o alla ventesima
openings esaminata porta a risultati soddisfacenti che non richiedono ulteriori
conferme (EPA 100.1).
L’osservazione è condotta a 20000X.
Per lo sviluppo del seguente protocollo si è utilizzato:
-
Microscopio JEOL JEM-3010 con microanalisi EDS
Software di supporto Oxford Link ISIS per l’analisi EDS
Digita lMicrograph per le analisi diffrattometriche
Osservazioni condotte a 300KV
6.3.5 Conteggio
Per il conteggio verrà eseguita una scansione delle grid in ordine sistematico in
modo da non aver doppi conteggi. È’ probabile che si presentino numerosi casi
particolari durante l’osservazione, per questo si sono definite delle regole di
conteggio in accordo a quanto descritto sulla metodica EPA 100.1. Per le fibre
che toccano i lati delle opening scegliere due lati primari su ogni openings e
18
contare come mezze fibre le estremità che sporgono da esclusivamente questi
due lati. Infatti si ipotizza che statisticamente la lunghezza visibile di fibra sia
metà di quella reale. In fig. 3a) si nota che vengono conteggiate come 1 fibra le
porzioni sporgenti solo da i lati superiore e sinistro e così per tutte le opening
Non contare
1 fibra
Non contare
1 fibra
osservate in successione.
Fig.3a) Conteggio di fibre che si posano sui lati delle openings
In fig. 3b) si analizza il caso in cui le fibre si estendano al di la del campo
visivo. E’ indispensabile osservare sistematicamente i quadranti del campo
visivo in modo da non eseguire un doppio conteggio di fibre. E’ consigliabile
considerare come il caso precedente solo due quadranti e valutare solo quelle
sporgenti da questi due quadranti.
Nel caso in cui una fibra attraversi completamente il campo visivo questa non
va considerata. Al contrario nel caso in cui una fibra è completamente
contenuta, questa va contata come una fibra.
1 fibra
1 fibra
Non
contare
Non
contare
Non
contare
1 fibra
Fig.3b) Conteggio di fibre che si estendono al di fuori del campo visivo
19
Un fascio di fibre parallele ed un aggregato di fibre casuali saranno contati
rispettivamente come unica fibra di dimensioni medie e come tante fibre quante
compongono l’aggregato purché nitidamente distinguibili come mostrato in fig. 3c).
8 fibre
3 fibre
Fig.3c) Conteggio di fasci ed aggregati di fibre.
Altri casi particolari possono derivare da fibre attaccate o parzialmente nascoste a
particelle estranee non-fibrose. In questo caso vanno registrate le dimensioni
effettive della fibra se queste sono nitidamente visibili, se invece sono parzialmente
oscurate dalla particella andrà considerata come lunghezza la lunghezza doppia della
parte visibile oppure la lunghezza totale fibra-particella come in fig.3d).
Fig 3d) conteggio di fibre attaccate a particelle estranee non-fibrose.
Per il calcolo della concentrazione di fibre si impiega la seguente formula:
C = n Af / A V 1000
[MFL milioni fibre per litro]
dove
- N: numero di fibre conteggiate
- Af: area effettiva di filtrazione in mm2 della membrana
- A: area totale esaminata in mm2
- V: volume del campione filtrato in ml
20
6.3.6 Filtri bianchi
Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la
letture degli stessi, uno ogni 25 filtri usati o, in alternativa uno per ogni set. Il
numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato
per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 4; in caso contrario
occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta
valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri
bianchi dovranno essere esposti all’aria, in laboratorio, nel luogo ove si
esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore). Poiché le
membrane usate per le osservazioni TEM possono essere le medesime del
SEM, nel caso di precedenti letture dei filtri bianchi al SEM verrà tralasciata
la lettura TEM.
__________________________________________________________________________________
6.4.8 Scheda tecnica: Approccio statistico
Calcolo della concentrazione media di fibre e relativi intervalli di confidenza
Si vuole determinare un valore medio di fibre per apertura con il quale calcolare la
concentrazione media di fibre nel campione. Si vuole inoltre fornire un intervallo che
contenga questo valore con il 95% di confidenza.
Assumendo che le fibre siano distribuite in modo random sulla griglietta, la distribuzione
di queste fibre sulle singole aperture dovrebbe seguire una distribuzione di Poisson. Il
che vuol dire che la probabilità di trovare un certo numero ni di fibre in una generica
apertura i sarà data dall’equazione:
n ni
P (ni ) = e − n ⋅
ni !
dove n è il valore medio di fibre “atteso” in una apertura. Se il numero di aperture
esaminate, k, è sufficiente (legge dei grandi numeri), il valore medio di fibre atteso per
apertura sarà dato dal numero totale di fibre, n, (contato su tutte le k aperture esaminate)
moltiplicato per la frazione di area relativa ad una singola apertura, pi (rapporto tra l’area
di una apertura, Ai, e quella di tutte le aperture osservate, A). Si ha cioè:
A
n = n ⋅ pi = n ⋅ i . Se si assume che le aperture siano tutte uguali A=kAi, allora il
A
n
numero medio di fibre atteso diventa n = e l’equazione della probabilità:
k
P(ni ) = e
−n / k
n ni
⋅ ni .
k ni !
Quindi, per esempio, se si contano 50 fibre su 20 aperture, la probabilità di trovare 3
503
fibre in una singola apertura sarà del 21%: P (3) = e − 50 / 20 ⋅ 3 = 0.21 , mentre quella di
20 3!
trovarne 6 è solo del 2.8%. In figura si possono vedere gli andamenti previsti dalla
distribuzione di Poisson per 10, 50 e 100 fibre totali osservate su 20 aperture,
21
corrispondenti a valori medi di 0.5, 2.5 e 5 fibre per apertura (si noti che, mentre la p è
definita solo per numeri interi, la media è un numero reale). Queste curve danno cioè la
probabilità di trovare un certo numero di fibre (ni) all’osservazione di una singola
generica apertura. Si nota come per basso numero di fibre la distribuzione sia
fortemente asimmetrica. La distribuzione diventa simmetrica per un numero totale di
fibre superiore ad alcune decine di fibre totali, assomigliando sempre di più ad una
distribuzione gaussiana.
P(ni)
Distribuzione di Poisson per numero crescente di fibre totali osservate a parità di
aperture esaminate
Caratteristica della distribuzione di Poisson è che la deviazione standard risulta uguale
alla radice quadrata del valor medio, così che per esempio un particolare conteggio di
fibre effettuato su una sola apertura possiede lo stesso intervallo di confidenza di un
altro equivalente conteggio derivante invece dall’osservazione di molte aperture in
sequenza. Questo significa che utilizzando questa distribuzione non è possibile
determinare in modo indipendente la reale fluttuazione del numero di fibre tra le diverse
aperture, e si è costretti quindi ad assumere implicitamente che la deposizione delle fibre
sia effettivamente random, con il rischio di un restringimento eccessivo degli intervalli di
confidenza risultanti. Per la distribuzione gaussiana invece la deviazione standard viene
calcolata in base alle differenze tra il numero di fibre osservate nelle singole aperture e il
valor medio, rispecchiando quindi la reale fluttuazione dei dati, anche nel caso ci siano
deviazioni dalla condizione di perfetta randomness, a causa di agglomerazione delle fibre o
altre cause di disomogeneità della deposizione. Da questo punto di vista, l’utilizzo di una
distribuzione gaussiana è preferibile.
E’ chiaro tuttavia dalle considerazioni fatte sopra sulla forma della distribuzione di
Poisson, che per conteggi di fibre basse non è possibile utilizzare la simmetrica
gaussiana e si è costretti ad usare media e deviazione standard calcolate in base alla
distribuzione poissoniana, assumendo implicitamente una situazione di deposizione
perfettamente casuale.
Per calcolare gli intervalli di confidenza al 95% per la distribuzione poissoniana ci si
serve della tabella 2 (vedi sotto) che dà i limiti inferiore e superiore in funzione del
numero totale di fibre n osservate. Per conteggi totali inferiori a 5 fibre, il limite inferiore
di confidenza del 95% corrisponde ad 1 fibra o meno, mentre il limite superiore di
confidenza del 95% per il conteggio di zero fibre corrisponde a 3,69 fibre. Non ha
quindi senso definire limiti di confidenza per un numero di fibre inferiore a 5, cosicché i
22
risultati andranno registrati come “inferiori al..” corrispondente limite di confidenza
superiore del 95%. Siccome la tabella è in funzione delle fibre totali, per ottenere gli
intervalli di confidenza attorno al valor medio occorre dividere i limiti ottenuti dalla
tabella per il numero di aperture esaminate k.
Tab. 2 – Limiti di confidenza al 95% per la distribuzione di Poisson, in funzione del numero
totale di fibre osservate n.
n Inferiore Superiore
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
0.03
0.24
0.62
1.09
1.62
2.20
2.81
3.45
4.12
4.80
5.49
6.20
6.92
7.65
8.40
9.15
9.90
10.67
11.44
12.22
13.00
13.79
14.58
15.38
16.18
16.98
17.79
18.61
19.42
20.24
21.06
21.89
22.72
23.55
5.57
7.22
8.77
10.24
11.67
13.06
14.42
15.76
17.08
18.39
19.68
20.96
22.23
23.49
24.74
25.98
27.22
28.45
29.67
30.89
32.10
33.31
34.51
35.71
36.90
38.10
39.28
40.47
41.65
42.83
44.00
45.17
46.34
47.51
n Inferiore Superiore
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
24.38
25.21
26.05
26.89
27.73
28.58
29.42
30.27
31.12
31.97
32.82
33.68
34.53
35.39
36.25
37.11
37.97
38.84
39.70
40.57
41.43
42.30
43.17
44.04
44.91
45.79
46.66
47.54
48.41
49.29
50.17
51.04
51.92
52.80
n Inferiore Superiore
48.68 69
49.84 70
51.00 71
52.16 72
53.31 73
54.47 74
55.62 75
56.77 76
57.92 77
59.07 78
60.21 79
61.36 80
62.50 81
63.64 82
64.78 83
65.92 84
67.06 85
68.19 86
69.33 87
70.46 88
71.59 89
72.72 90
73.85 91
74.98 92
76.11 93
77.23 94
78.36 95
79.48 96
80.60 97
81.73 98
82.85 99
83.97 100
85.09 101
86.21 102
53.69
54.57
55.45
56.34
57.22
58.11
58.99
59.88
60.77
61.66
62.55
63.44
64.33
65.22
66.11
67.00
67.89
68.79
69.68
70.58
71.47
72.37
73.27
74.16
75.06
75.96
76.86
77.76
78.66
79.56
80.46
81.36
82.27
83.17
87.32
88.44
89.56
90.67
91.79
92.90
94.01
95.13
96.24
97.35
98.46
99.57
100.68
101.78
102.89
104.00
105.10
106.21
107.31
108.42
109.52
110.63
111.73
112.83
113.93
115.03
116.13
117.23
118.33
119.43
120.53
121.63
122.72
123.82
Per la distribuzione gaussiana, invece, l’intervallo di confidenza del 95% viene calcolato
dalla deviazione standard σ, utilizzando la tabella della t di Student (vedi tabella 3 sotto)
per (k – 1) gradi di libertà (dove k è il numero di aperture esamine). Se il valore medio di
fibre è n il limite inferiore nI e superiore nS sono calcolati come segue:
t ⋅σ
t ⋅σ
; nI = n −
nS = n +
k
k
23
Tab. 3 - Coefficienti t di Student per limiti di confidenza del 95% in funzione del numero k di
aperture osservate
k-1
t
k-1
t
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12.706
4.303
3.182
2.776
2.571
2.447
2.365
2.306
2.262
2.228
2.201
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
2.179
2.160
2.145
2.131
2.120
2.110
2.101
2.093
2.086
2.080
2.074
Noto il valore di fibre medio per apertura occorre calcolare la concentrazione in MFL
(milioni di fibre per litro) presente nel liquido sotto esame. A tale scopo ci si serve del
fattore C, uguale alla concentrazione in MFL relativa all’osservazione di una singola fibra
e corrispondente alla sensibilità analitica:
A f × RD
C=
A × V × 1000
dove:
Af: area effettiva di filtrazione in mm2 della membrana
A: area totale esaminata in mm2
V: volume del campione filtrato in ml
RD : rapporto di diluizione del campione originale (se diluito)
La concentrazione in MFL per un numero generico di fibre è ottenuta moltiplicando per
il fattore C il numero totale di fibre conteggiate. In modo analogo, i limiti di confidenza
inferiore e superiore si ottengono moltiplicando per C quelli precedentemente calcolati
relativi al numero totale di fibre.
In base alle considerazioni fatte sopra, il documento EPA prescrive che il conteggio
delle fibre sia riportato come segue:
Caso 1: nessuna fibra osservata: il risultato sarà riportato come inferiore al 3,69 volte
la concentrazione corrispondente ad una fibra.
Caso 2: da 1 a 4 fibre: il risultato sarà riportato come inferiore al corrispondente limite
superiore del 95% (Poisson)
Caso ): da 5 a 30 fibre: saranno riportati la media e i limiti di confidenza inferiore e
superiore corrispondenti al 95% (Poisson)
Caso 4: più di 30 fibre: verranno calcolati gli intervalli di confidenza del 95% per
entrambe le distribuzioni (Gauss e Poisson) e varrà indicato come risultato il maggiore
tra i due.
__________________________________________________________________________________
24
6.4 Analisi MOCF
(Procedura per campionamento e analisi in accordo con quanto previsto dal D.M. 6/9/94 e dal D.l.
n°277 del 15/8/1991)
6.4.1 Preparazione del campione (vetrini)
Le membrane che verranno usate per le osservazioni in MOCF saranno in
esteri misti di cellulosa con porosità di 0,8 μm. Una porzione del filtro,
ottenuto con le medesime procedure preparative descritte per le osservazioni
SEM, posta su un vetrino da microscopio, è reso trasparente mediante il
metodo acetone-triacetina e coperto con vetrino coprioggetti. La procedura è
descritta nel metodo indicato dalla Dir. CEE 83/477; (vapori di acetone e
triacetina). Per diminuire il tempo necessario alla completa diafanizzazione,
dopo la applicazione della triacetina (normalmente di ca. 24 ore), si può
scaldare il preparato (vetrino più coprioggetto) per 15 minuti a circa 50°C su
una piastra riscaldante.
6.4.2 Campi microscopici da esaminare
Per ciò che concerne l’analisi in MOCF, tenuto conto che un campo
microscopico corrisponde all'area reticolo di Walton-Beckett (a 500 x è
0.00785 mm2), verranno esaminati 130 campi per ciascun campione
corrispondenti ad una superficie di 1 mm2 della membrana filtrante
prendendo come riferimento il valore indicato nel D.M. italiano 6/9/1994 per
l’analisi al SEM di filtri provenienti dal campionamento di particolato
aerodisperso.
6.4.3. Criteri di conteggio (Dir. CEE 83/477).
Con la MOCF si effettuerà una prima analisi quantitativa dei filtri in esteri
misti di cellulosa al fine di conteggiare tutte le fibre standard presenti nel
campione ed una analisi semiqualitativa, ove possibile, delle fibre che
presentano caratteristiche ottiche peculiari.
Il conteggio dei campioni verrà effettuato secondo le seguenti regole:
Per fibra standard si intende qualunque particella, di lunghezza > 5µm,
diametro < 3µm e rapporto lunghezza/diametro >3, che non sia in contatto
con una o più particelle di diametro maggiore di 3 µm.
Le singole fibre che hanno entrambe le estremità entro l'area del reticolo
devono essere contate come un'unica fibra; una fibra avente una sola
estremità all'interno di tale area deve essere contata come mezza fibra.
Le aree del reticolo per il conteggio devono essere scelte a caso all'interno
della superficie del filtro e non devono mai sovrapporsi. A tal fine si consiglia
di seguire un percorso a greca.
Un agglomerato di fibre che appaia compatto e intero in uno o più punti della
sua lunghezza, ma appaia diviso in trefoli (fibra ramificata) in altri, deve
essere contato come una unica fibra purchè avente le dimensioni standard; in
tale eventualità il diametro deve essere misurato in corrispondenza della
porzione di fibra intera e non ramificata.
25
In qualsiasi altro agglomerato in cui le singole fibre si tocchino o si incrocino
(fascio), queste devono essere contate individualmente ogniqualvolta possano
essere distinte sufficientemente per stabilire che abbiano dimensioni standard.
Se non è possibile distinguere nessuna singola fibra rispondente a tale
definizione, il fascio deve essere contato come un'unica fibra, sempre che sia
conforme nel suo complesso a tali dimensioni.
Se più di un ottavo di un’area del reticolo è coperto da un agglomerato di
fibre e/o particelle, tale area del reticolo deve essere scartata ed un'altra area
deve essere esaminata per il conteggio.
6.4.4. Calcolo della concentrazione
C = (106 N D2 ) / (VN d2)
[ff/litro]
dove:
N = n. di fibre contate in totale;
n = n. di campi del reticolo esaminati su un filtro (200 o meno in funzione del
volume totale prelevato);
D = in mm, diametro effettivo del filtro (verrà considerata la superficie della
porzione utilizzata nell’analisi, prelevata da un filtro di 47 mm di diametro);
d = in micron, è il diametro del reticolo di Walton Beckett (100 micrometri);
V = in litri, il volume di acqua filtrato.
6.4.5. Conteggio
Per il conteggio è usato un microscopio binoculare con le seguenti
caratteristiche:
Illuminazione Koehler.
Condensatore ABBE o acromatico a contrasto di fase incorporato nel
complesso posto sotto al piatto portaoggetti e montato con possibilità di
centraggio e messa a fuoco.
Aggiustamento del centraggio per il contrasto di fase indipendente dal
meccanismo di centraggio del condensatore.
Obiettivo acromatico a contrasto di fase positivo parafocale, a 40
ingrandimenti, con apertura numerica compresa tra 0,65 e 0,70 e con
assorbimento dell'anello di fase compreso tra 65 e 85%.
Oculari a compensazione a 12,5 ingrandimenti: almeno un oculare deve
permettere l'inserimento di un reticolo ed avere la messa a fuoco.
Reticolo oculare circolare Walton-Beckett con diametro apparente sul piano
oggetto di 100 µm ± 2 µm quando si usano l'obiettivo e l'oculare indicati, e
controllato mediante un micrometro.
6.4.6. Limite di rilevabilità
Controllare il limite di rilevabilità mediante un "vetrino di prova per contrasto
di fase". Quando siano usati nel modo specificato dal fabbricante si deve
poter vedere fino al codice 5 sui vetrini di prova AIA e sino al blocco 5 sul
vetrino di prova HSE/NPL Mark 2. Tale procedura deve essere effettuata
all'inizio di ciascuna giornata di lavoro.
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6.4.7. Filtri bianchi
Al fine di verificare la non contaminazione dei filtri bianchi, si effettuerà la
lettura degli stessi, uno ogni 25 filtri usati o, in alternativa uno per ogni set. Il
numero di fibre ivi riscontrate, in un numero di campi pari a quello esaminato
per i campioni di percolato, non potrà essere superiore a 4; in caso contrario
occorrerà scartare l'intero set di filtri al fine di non inficiare la corretta
valutazione del numero di fibre effettivamente presenti sul filtro. I filtri
bianchi dovranno essere esposti all’aria, in laboratorio, nel luogo ove si
esegue il filtraggio, per un intero turno lavorativo (8 ore).
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7. CONCLUSIONI
Uno dei principali problemi nel valutare l'impatto ambientale dell'amianto risiede
nella difficoltà di rilevarlo ed analizzarlo. I problemi analitici sono accentuati dalla
difficoltà di distinguere tra fibre di amianto e fibre di altri materiali ed il numero
generalmente esiguo e le dimensioni piuttosto eterogenee, rendono assai difficile la
loro identificazione e quantificazione.
Sebbene alcune metodiche per la determinazione delle fibre di amianto siano
elaborate e utilizzate da anni, nuove tecniche e metodi di indagine vengono
continuamente valutati, proposti e certificati.
Di fatto i metodi di rilevamento di fibre aerodisperse, descritti in letteratura da molti
autori, comprendono la microscopia ottica a contrasto di fase (MOCF), che permette
di rilevare fibre fino ad un diametro minimo di 0.25 µm; la microscopia elettronica a
scansione (SEM), che consente di arrivare ad un diametro minimo di 0.03-0.04 µm, e
la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che raggiunge una risoluzione di
circa 0.0002 µm.
Per l’analisi dell’amianto in campioni massivi (analisi di bulk) si utilizza
principalmente la diffrattometria di polveri a raggi X (XRD), la spettrofotometria
infrarossa (IR) e la spettrofotometria infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR).
Tra le tecniche di microscopia, non c’è ragione per ritenerne una migliore rispetto
alle altre in modo indiscriminato: tutte hanno punti di forza e debolezze. Vantaggi e
svantaggi andranno valutati volta per volta in funzione della tipologia del campione
che si dovrà analizzare e delle risorse in quel momento disponibili (tempo, costi,
strumentazione, personale, ecc..).
Quando si renda necessario disporre di numerosi dati di concentrazione in brevi lassi
di tempo (una tale necessità si manifesta ogniqualvolta si voglia monitorare un’area
nel modo più istantaneo possibile), è sconsigliabile optare per il TEM come tecnica
di indagine, sia per la durata dell’analisi (dalla preparazione del campione al
conteggio vero e proprio), sia per le non-indispensabili peculiarità offerte da questa
tecnica.
In determinate circostanze, ad es. durante un operazione di bonifica, è lecito supporre
che le fibre, qualora presenti, siano dovute in massima parte all’attività di bonifica in
atto, e diverrebbe così secondaria la possibilità di riconoscerne la composizione
chimica (mediante EDS) e la classificazione mineralogica (mediante SAED).
Sarebbe piuttosto opportuna un’analisi veloce, con un basso grado di incertezza e si
farebbe più indicata la Microscopia Ottica in Contrasto di Fase (MOCF).
Il TEM introduce un alta incertezza nel dato ottenuto, dovuta alla ridotta area
osservata.
Quando è richiesto il massimo grado di accuratezza sulle informazioni derivanti
dall’osservazione delle singole fibre, o quando si voglia rilevare particelle di
dimesione molto piccola il TEM rappresenta ad oggi la scelta preferibile. La frazione
ultrafine del particolato atmosferico (tra cui possono essere incluse le fibrille di
amianto), è un esempio lampante di rischio sanitario corrente, non ancora
adeguatamente assimilato (non esistono soglie/limiti) e di difficile monitoraggio
istantaneo. La composizione di tale particolato può essere indagata unicamente con
tecniche analitiche ad alta risoluzione, come il TEM.
In questo documento è stato trattato il caso complesso di liquidi con alto contenuto di
interferenti organici definendo le procedure analitiche per le tre principali tecniche
microscopiche utilizzate per il riconoscimento dell’amianto.
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Dal confronto tra i dati ottenuti con le tre tecniche sui percolati della discarica
Barricalla nel corso di più di due anni di campionamenti, si ricava la conclusione che
la tecnica che possiede i requisiti migliori per l’analisi delle fibre di amianto da
percolati si discarica sia la microscopia elettronica a scansione SEM.
Tale affermazione si basa sulla necessità di operare sia un discernimento qualitativo
rigoroso che un conteggio quantitativo con una discreta sensibilità analitica. A questo
proposito la MOCF presenterebbe una sensibilità analitica lievemente migliore di
quella SEM dovuta alla maggiore area di membrana esaminata (1,5 mm2 rispetto a
1mm2), ma tale pregio viene compensato dalla criticità nel riconoscimento delle
fibre, maggiore che nel caso di fibre aerodisperse a causa della presenza di quantità
maggiori di interferenti. I risultati SEM appaiono quindi quelli di riferimento che
descrivono nella maniera migliore gli andamenti delle concentrazioni di fibre e
fibrille nei percolati. Esistendo nella comunità scientifica un consenso generale sul
considerare pericolose per la salute dell’uomo le fibre con diametro inferiore a 3 µm
e lunghezze superiori a 5 µm, si può ritenere il SEM lo strumento più adeguato al
riconoscimento di tali fibre. Inoltre il microscopio a scansione presenta una
preparazione dei campioni più agevole e costi di utilizzo più contenuti, sebbene
comunque molto elevati.
Con il parallelo svolgersi della ricerca in campo tossicologico e strumentale, è
ragionevole presumere che vi saranno presto degli aggiornamenti nelle “definizioni”
di pericolosità e nelle relative tecniche di analisi e monitoraggio. Qualora l’analisi
delle fibrille cominciasse ad acquistare maggior importanza, il MOCF diventerebbe
inutilizzabile a questo scopo, mentre il SEM potrebbe continuare a dare buoni
risultati. Tuttavia, per particelle di piccola dimensione, cresce l’importanza di
utilizzare una tecnica con un adeguato potere risolutivo. In questo senso il TEM
sarebbe l’ideale potendo distinguere fibre con diametro nell’ordine del decimo di
nanometro. Purtroppo i dati evidenziano la carenza di sensibilità della tecnica, a
meno di non aumentare notevolmente i tempi di analisi (osservando un numero
maggiore di aperture).
In definitiva i risultati di più di due anno di analisi confermano che il SEM
rappresenta il miglior compromesso tra sensibilità analitica, risoluzione e possibilità
di discernere la tipologia delle fibre.
Infine vogliamo sottolineare l’importanza della contaminazione ambientale. Ogni
fase dell’analisi deve essere accuratamente controllata affinché non si verifichino
accidentali contaminazioni da amianto. La vetreria e ogni strumento impiegati
devono essere sempre lavati e sciacquati più volte con acqua ultrapura.
Bisogna tenere conto del fatto che il costo dell’analisi ed i tempi di risposta dei
laboratori che le eseguono sono fortemente condizionati dalla necessità di dover
trasportare, presso una struttura tecnologicamente adeguata, i campioni prelevati a
distanze che possono variare fortemente. A causa della disponibilità limitata di
strumentazione ed operatori esperti, infatti, non è raro che campioni prelevati in un
luogo vengano poi esaminati in laboratori distanti centinaia di chilometri, con tutte le
conseguenze sulla accuratezza dei risultati dovute al trasporto ed alla manipolazione
degli stessi da parte di più persone.
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8. APPENDICI
8.1. Schema per la registrazione dati
Esempio di foglio di lavoro Excel da riempire ad ogni turno di analisi. La concentrazione in termini
di fibre/litro viene automaticamente determinata inserendo i parametri principali.
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8.2. Immagini
Alcune fibre, fibrille, agglomerati di fibre osservate durante i test di preparazione al metodo
analitico. Le 4 immagini superiori sono ottenute con il SEM. è descritto nella didascalia di ciascuna
immagine in ordine da sinistra: il voltaggio, gli ingrandimenti, il riferimento dimensionale e altri dati
sul sistema di rivelazione impiegato. Le due immagini inferiori sono ottenute al TEM e sono
evidenziati solamente i riferimenti dimensionali.
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