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GIMMOC Vol. XI N° 3, 2007
Target genici utilizzabili nella diagnosi di parodontite
mediante tecnologia di PCR
Giornale Italiano di
Microbiologia Medica
Odontoiatrica e Clinica
Vol. XI, N° 3, 2007
p. 156 - 168
Genic targets relevant for the identification
of periodontal pathogens by PCR base method
Organo ufficiale della
S.I.M.M.O.C.
Copyright © 2007
M. Benvenuti1,
ML. Ciusa2
G. Orrù2,
A. Piras2,
C. Montaldo2,
D. Tombaccini1*
*Autore di riferimento:
D. Tombaccini
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
TARGET…
Riassunto: La diagnosi di laboratorio per infezione del parodonto e’ stata per lungo tempo legata alle difficoltà di trasporto, crescita e di identificazione delle differenti specie patogene responsabili della malattia parodontale; specie per lo più anaerobie ed organizzate sotto forma di un complesso biofilm localizzato nella
placca sottogengivale.
L’ iter diagnostico tradizionale colturale e’ stato sostituito con quello molecolare ( PCR) in grado di rilevare le
differenti specie associate alla parodontopatia e nella versione real time PCR di poterle quantizzare.
Il cuore di una procedura “ PCR based method” e’ rappresentato dal progetto in silico del sistema diagnostico che prevede: (i) un bersaglio “target” genico rappresentativo di una sola specie batterica in esame , (ii)
oligonucleotidi ( primer e/o sonde fluorescenti) che presentano caratteristiche termodinamiche ottimali. Tuttavia, sebbene alcuni metodi proposti in letteratura o utilizzati in kit commerciali , rientrano nei parametri di
specificità, sensibilità e tempo contenuto, non tengono conto di un’ aspetto importante nella diagnosi delle
infezioni polimicrobiche : la selettività.
Per selettività si intende la capacità di un test diagnostico di rilevare bassi titoli di una specie patogena rispetto
ad elevate cariche di altre specie, ma anche la capacità di visualizzare la presenza e/o il titolo di differenti specie batteriche contemporaneamente e con la stessa accuratezza. In questo lavoro vengono riportate le sequenze nucleotidiche descritte fin ora in banca dati (GenBank) di nove patogeni parodontali più frequenti :
Tannerella forsythensis, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum ssp, Camphylobacter gracilis, Prevotella nigriscens, Eichenella corrodens, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans e valutate come possibili target identificativi per procedure basate sulla PCR.
Summary: In the course of time the laboratory diagnosis of periodontal infection has been influenced by the
difficulties encountered in the transport, growth and identification of the different pathogenic species involved in periodontal disease: species that form a complex biofilm on the subgengival plaque and require
anaerobic conditions.
The traditional cultural diagnostic method has been replaced by molecular ones (PCR), a technique able to
identify the different species responsible for periodontal disease and which, in its real time PCR version, is also able to quantify the different bacteria species present in a sample.
The core of the “PCR based method” procedure is represented by the in silico diagnostic system that includes:
(i) a genetic target, representative of the single bacteria species under examination, (ii) oligonucleotides
(primers and/or fluorescent probes) with optimal thermodynamic characteristics.
Nevertheless, even though the methods available in the literature and from commercial kits provide procedures that are considered specific, sensitive and fast, they do not take into consideration the most important
parameter of polymicrobial infection analysis: namely selectivity.
The selectivity of a diagnostic test is represented not only by its ability to reveal low titles of a single pathogen
species compared to high titles of other ones, but also by its capacity to point out simultaneously and with the
same level of accuracy, the presence and/or the concentration of different microbial species.
The purpose of this work is the description of the current sequences of nine different primary periodontal
pathogens deposited in DNA Data Banks: Tannerella forsythensis, Porphyromonas gingivalis, Treponema
denticola, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum ssp, Camphylobacter gracilis, Prevotella nigriscens, Eichenella corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans and subsequently the in silico evaluation of the DNA regions characterized by a good selectivity.
1
2
Dipartimento di Patologia e Oncologia Sperimentali, Università degli Studi di Firenze
D.S.S (DNA Sequencing Service ) Policlinico Universitario. Dipartimento di Chirurgia e Scienze
Odontostomatologiche
TARGET…
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La malattia parodontale o parodontite è
una patologia ampiamente diffusa, se pur
con gradi diversi di gravità, nei paesi industrializzati: secondo dati WHO del 2007 ne
è colpita circa il 70% della popolazione
(http://www.who.int/oral_health/databases/niigata/en/). Questa premessa e i
recenti studi che vedono i patogeni parodontali implicati in altre patologie
umane a livello sistemico, hanno accresciuto l’interesse verso la prevenzione,
la diagnosi e la cura della malattia [Ciantar M., et al., 2005a]; [Dogan et al.,
2005]; [Kinane et al., 2005]; [Meurman et
al., 2004]; [Schacher et al., 2006]. La parodontite ha un’eziologia a carattere infettivo-infiammatorio accompagnata da
una componente genetica che caratterizza la predisposizione individuale allo
sviluppo della patologia. Numerosi studi sulla microbiologia dell’infezione da
patogeni orali hanno permesso di identificare alcune specie batteriche, tra le
oltre 400 che popolano il cavo orale,
che si ritrovano costantemente implicate nello sviluppo e nella progressione
della parodontite. La loro presenza nelle tasche dentali, pertanto, è associata
ad un elevato rischio di sviluppo o progressione della malattia [Kook et al.,
2005]; [Lee et al., 2005]; Takahashi et al.,
2001]; [Tamura et al., 2006]; [Tang et al.,
2006]; [van Steenbergen et al., 1996]. La
diagnosi di laboratorio della parodontite é una diagnosi eziologica e deve essere supportata da un test microbiologico opportunamente standardizzato che
garantisca i parametri di: i) specificità ii)
sensibilità iii) praticità e rapidità di esecuzione. Le metodiche microbiologiche
classiche risultano difficilmente standardizzabili per i batteri del parodonto. I
motivi sono diversi, alcuni dipendenti
dallo status di microaerofilia o anaerobiosi necessari per la loro sopravvivenza, altri dipendenti dal lento sviluppo
nei terreni di coltura o assenza di opportuni kit di identificazione biochimica. Alla luce di queste conoscenze appare chiaro che l’utilizzo di metodiche
molecolari può rappresentare un’alternativa all’esame di laboratorio tradizio-
nale e risulta strumento indispensabile
per la caratterizzazione della flora parodontopatogena anaerobia. Risultati soddisfacenti possono essere ottenuti integrando gli esami tradizionali con quelli
molecolari; questa integrazione e’ obbligatoria almeno all’inizio della fase d’utilizzo della diagnostica molecolare. Tra
le metodiche molecolari accreditate,
quelle basate sulla PCR presentano
un’ampia diffusione anche come kit commerciali; come già descritto, rispetto all’esame colturale possiedono il vantaggio di essere di più rapida esecuzione (4
ore contro 6-7 giorni) e di richiedere più
semplici modalità di prelievo e di trasporto del campione patologico. La tecnica della PCR, nella sua variante real-time,
rappresenta anche un ottimo strumento
di quantificazione della carica batterica,
parametro non trascurabile che correla
con il grado di gravità della malattia [Lau
et al., 2004]; [Ledder et al., 2007];
[Malheiros, Avila-Campos, 2004]; [Nonnenmacher et al., 2005]; [Okada et al.,
2001]; [Perea, 2004]; [Sakamoto et al.,
2005]. Un punto cruciale e limitante per
la specificità/sensibilità della diagnosi
molecolare in PCR è la scelta degli oligonucleotidi (primer) che legano ed
amplificano regioni target specifiche
per ogni batterio. Nel caso della realtime PCR, dobbiamo considerare inoltre
anche la scelta di sonde fluorescenti,
che presentano profili diversi di specificità a seconda della struttura e del “folding” molecolare della sonda stessa
[Montaldo et al., 2003]. L’aspetto cruciale nella scelta di un target molecolare
sul DNA di batteri propri del distretto
parodontale è che tra le centinaia di
specie presenti solo di una minoranza è
stata depositata almeno una sequenza in
banca dati (EBI/EMBL e NCBI/GenBank, DDBJ). Ad esempio l’utilizzo come target di PCR di frammenti che codificano per l’rRNA 16S presenti in banca
dati può compromettere la specificità
del metodo di rilevazione con la possibilità di ottenere falsi positivi, se questi
target non siano stati opportunamente
valutati in silico e in vitro. Infatti la regione codificante per l’ rRNA 16S, molto
utilizzata come target per il rilevamento
Target genici
utilizzabili nella
diagnosi di
parodontite mediante
tecnologia di PCR
Genic targets relevant
for the identification
of periodontal
pathogens by PCR
base method
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
INTRODUZIONE
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Tombaccini et al.
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
TARGET…
dei microrganismi mediante PCR, è caratterizzata in parte da sequenze che si
sono conservate nelle varie specie durante l’evoluzione, e in parte da sequenze altamente differenziate che segnano
il passaggio evolutivo da una specie all’altra. Una metodica molecolare in uso
per la diagnostica, deve quindi essere
periodicamente controllata e valutata
confrontando le sequenze dei primer di
PCR con le nuove sequenze giornalmente depositate in banca dati.
L’esigenza di una diagnosi ad alta specificità ha creato i presupposti per questo
studio, in cui l’obiettivo primario è quello di individuare sequenze genetiche
specie-specifiche utilizzabili come nuovi target per la ricerca in PCR di batteri
patogeni parodontali. I patogeni che abbiamo scelto per questo studio sono
quelli che più frequentemente si ritrovano in associazione con la malattia parodontale [Gafan et al., 2004]; [Haffajee,
Socransky S.S. 2005]; Mullally et al.,
2000]; [Okada et al.,2001]: Tannerella
forsythensis (anche Tannerella forsythia), Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum ssp,
Camphylobacter gracilis, Prevotella nigriscens, Eichenella corrodens, Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans. Le sequenze descritte in
bibliografia come nuovi target di PCR
per i vari microrganismi, sono state validate sia per l’omologia con tutte le sequenze depositate in banca dati (GenBank), sia per il profilo di omologia in
differenti ceppi batterici della stessa
specie. A conclusione sono state individuate e vengono proposte delle regioni
“target“ considerate, allo stato attuale,
ottimali per disegnare primer speciespecifici che garantiscano un’alta selettività/specificità nella diagnosi molecolare della malattia parodontale.
I PATOGENI PARODONTALI
L’ infezione parodontale è causata da
un complesso polimicrobico di patogeni orali che agiscono sull’iniziazione e la
progressione della malattia. Fisiologicamente il cavo orale è colonizzato da cir-
ca 400 specie differenti tra cui sono
identificabili sia i normali commensali
sia almeno 15-30 specie candidate come patogeni parodontali. In condizioni
fisiologiche normali le varie specie interagiscono tra di loro mantenendo una
condizione di equilibrio che limita i livelli dei batteri patogeni. L’intervento di
fattori microbici o di altra natura, che
inducono modificazioni del biofilm in
cui convivono le varie specie, crea una
condizione favorevole per il sopravvento dei patogeni sui commensali. Quando i livelli dei batteri patogeni e/o dei
loro fattori di patogenicità superano la
massa critica nel biofilm sottogengivale, il danno tessutale e la gravità della
malattia aumentano progressivamente.
Il meccanismo patogenetico che si instaura è locus-specifico e di conseguenza la malattia si manifesta con un quadro di gravità differente nelle diverse tasche dentali dello stesso individuo. I microrganismi orali responsabili del processo patogenetico sono stati caratterizzati, nel tempo e con metodiche differenti, grazie alla loro abbondante e costante presenza nei siti affetti dalla malattia [Haffajee, Socransky, 2005]; [Mullally et al., 2000]; [Gafan et al., 2004].
In particolare, in questa sezione esamineremo soltanto alcuni tra quelli oggi
considerati i maggiori patogeni parodontali. Tali microrganismi, pur appartenendo a specie diverse, hanno la caratteristica comune di essere prevalentemente anaerobi, adatti a sopravvivere
all’ambiente ipossico delle tasche dentali, e di presentare diversi determinanti
di patogenicità (enzimi proteolitici, leucotossine) [Corvino et al., 2002].
SPECIE BATTERICHE RAPPRESENTATIVE NELL’ INFEZIONE PARODONTALE
Un tentativo di classificazione dei patogeni parodontali basato sul criterio di
associazione con la malattia parodontale è stato pubblicato da Socransky [Socransky et al., 1998]. Socransky propone un’analisi delle variazioni quantitative di 40 specie batteriche, valutandole
in campioni di pazienti sani e affetti da
parodontite di vario grado, mediante
TARGET…
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METODI MOLECOLARI IN USO PER
LA DIAGNOSI DI INFEZIONE
Nell’ambito della diagnosi di infezione
parodontale l’utilizzo della PCR (Polymerase Chain Reaction) come metodologia di indagine, ha risolto molti degli
inconvenienti legati alla diagnostica
precedente, rendendo affidabile, sensibile e sicuro il rilevamento dei batteri
patogeni nei campioni orali. Questa metodica si basa sull’amplificazione, a partire da inneschi oligonucleotidici (primer), di sequenze nucleotidiche specifiche per specie batterica in esame.
L’utilizzo di primer specifici mette in
evidenza, nei materiali analizzati, la
presenza o meno delle singole specie
batteriche. Diversi studi hanno dimo-
strato che questa metodica possiede
dei vantaggi rimarcabili rispetto all’esame culturale classico utilizzato per la
diagnosi parodontale. Un vantaggio facilmente intuibile è quello della rapidità rispetto ai lunghi tempi richiesti
dall’esame culturale. Inoltre le stringenti condizioni anaerobie in cui vivono i batteri parodontali sono spesso limitanti per il recupero di patogeni vivi
da crescere per l’esame culturale. Al
contrario, il recupero del materiale genetico necessario per la PCR risulta più
pratico da realizzare e il materiale da
impiegare poco deteriorabile. Infine, è
stato ampiamente dimostrato che il limite di rilevamento della PCR è di 10 2
cellule, contro la cultura batterica (in
queste condizioni) che ha un limite
minimo di 10 4 cellule, risultando quindi
molto più sensibile della seconda [Boutaga et al., 2005]; [Lau et al., 2004]. La
PCR classica, tuttavia, è un metodo di
indagine in grado di dare informazioni
solo qualitative, assumendo carattere
quantitativo esclusivamente nella sua
variante di PCR real time. Con questa
metodica si riesce in tempo reale, mediante sistemi di rilevazione della fluorescenza, a quantificare in modo assoluto o relativo un target genico. La
quantificazione è un punto cruciale per
la diagnostica parodontale in quanto
permette il monitoraggio della massa
critica dei vari patogeni nel biofilm sottogengivale, controllando l’evolversi
della malattia e dello stato patologico
del paziente. E’ importante sottolineare
che i livelli di squilibrio patologico sono rappresentati percentualmente da
un lieve aumento dei valori dei microrganismi patogeni e pertanto, ai fini dell’esatta valutazione, è necessaria una
sensibilità operativa adeguata che a
tutt’oggi possiede solo la PCR real time
[Boutaga et al., 2005]; [Maeda et al.,
2003]; [Sakamoto et al., 2001].
Inoltre la possibilità di una indagine rapida, sensibile, specifica e quantificativa costituisce non soltanto un importante strumento diagnostico ma un fondamentale aiuto per la ricerca, tesa ad
individuare il grado coinvolgimento di
vecchie e nuove specie batteriche nello
Target genici
utilizzabili nella
diagnosi di
parodontite mediante
tecnologia di PCR
Genic targets relevant
for the identification
of periodontal
pathogens by PCR
base method
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
l’utilizzo dell’ibridizzazione in situ del
DNA del campione con sonde oligonucleotidiche radioattive. I dati ottenuti
hanno permesso la suddivisione delle
varie specie batteriche in cinque raggruppamenti (“complex”) sulla base
dell’associazione con la gravità clinica
della malattia parodontale.
Successivamente altri autori hanno valutato la classificazione proposta da Socransky tramite studi orizzontali e longitudinali in pazienti provenienti da differenti regioni geografiche e con abitudini di vita molto differenti, nel corso
degli anni, utilizzando sistemi di rilevamento più sensibili e in grado di rilevare variazioni clonali nell’ambito della
stessa specie.
Sulla base della letteratura disponibile
abbiamo quindi scelto per questo studio
microrganismi già indicati da Socransky
e da altri autori come fortemente rappresentativi dell’infezione parodontale.
In particolare, Tannerella forsythensis,
Porphyromonas gingivalis, Treponema
denticola, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum ssp, Camphylobacter gracilis, Prevotella nigriscens,
Eichenella corrodens, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (precendentemente classificato come Actinobacillus
actinomycetemcomitans) [Haubek et
al., 2002]; [Orru et al., 2006]; [Saddi-Ortega et al., 2002].
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sviluppo della malattia parodontale. In
ogni caso sia per la PCR sia per la PCR
real time il rilevamento preciso delle
specie patogene presenti nel campione
dipende dal grado di specificità dei primer utilizzati (e per la seconda metodica anche dalla specificità della sonda
oligonucleotidica in uso). L’individuazione di target specifici su cui condurre
la ricerca diretta tramite metodiche molecolari è stato l’obiettivo primario di
questo studio: come approfondiremo
nella sezione successiva, abbiamo voluto confrontare vecchi e nuovi target per
riuscire a incrementare il grado di specificità della diagnostica e della ricerca
parodontale.
SCELTA DEI TARGET MOLECOLARI
IDENTIFICATIVI
per l’amplificazione in PCR. Tra questi
dei buoni candidati sono le sequenze
che codificano proteine specifiche che
rappresentano sequenze caratteristiche
e costanti di ogni specie batterica, sviluppate durante la filogenesi. Ciò considerato, allo scopo di individuare nuovi
target di PCR, la nostra attenzione si è
concentrata sulla ricerca di sequenze
per tali proteine specie specifiche. Nella
prima parte delle Tabelle I, II, III sono
riportati il nome abbreviato della proteina e l’identificativo della sua sequenza
nucleotidica per tutti i batteri in studio.
La Tabella III, relativa all’ A. actinomycetemcomitans, indica soltanto una proteina, già considerata target ottimale per
l’analisi in PCR. Maggiori dettagli in proposito sono riportati più avanti.
MATERIALI E METODI
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
TARGET…
Nella diagnostica microbiologica, e in
particolare in quella parodontale, uno
dei principali target su cui sono disegnati i primers di PCR corrisponde alla
regione comprendente i geni che codificano per l’rRNA 16S [Albandar et al.,
1996]; [Ciantar et al., 2005b]; [Dewhirst
et al., 2000]; [Kim et al., 2005]; [Loy et
al., 2002]; [Sakamoto et al., 2004]; [Siqueira et al., 2000]; [Slots et al., 1995];
[Tang et al., 2006]; [Tran, Rudney, 1996].
Solo poche pubblicazioni riportano l’utilizzo di primer che amplificano altre
sequenze batteriche specifiche [Lau et
al., 2004]; [Lyons et al., 2000]; [Nadkarni
et al., 2004]. Le sequenze nucleotidiche codificanti l’rRNA 16S rappresentano una regione molto conservata del
genoma batterico intercalata da porzioni altamente differenziate che caratterizzano il passaggio filo-evolutivo da una
specie all’altra. L’utilizzo dei geni per
l’rRNA ribosomiale come target di PCR
pone, per la sua caratteristica strutturale, il problema di possibili fenomeni di
cross-reattività se non conosciuto il profilo di tutte le specie rilevabili nel cavo
orale. A questi consegue l’amplificazione di DNA batterico aspecifico che compromette la attendibilità dell’analisi. Per
ovviare a tali problematiche abbiamo
cercato di individuare dei target a alta
specificità da utilizzare come bersagli
L’individuazione di primers specifici da
utilizzare nella diagnosi parodontale
mediante PCR è senz’altro il punto che
condiziona l’affidabilità e la specificità
della diagnosi stessa. I dati presenti in
letteratura riferiti ai nove batteri che abbiamo preso in considerazione in questo studio, riportano, tranne alcune eccezioni, coppie di primer che amplificano tratti di geni codificanti l’rRNA 16S.
Nell’intento di identificare delle sequenze di proteine specie-specifiche, candidate ottimali come nuovi target di PCR,
ci siamo avvalsi di due delle principali
banche dati:
GenBank:
www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/
DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp/
Le banche dati hanno permesso di trovare sequenze nucleotidiche complete
di proteine batterio-specifiche di recente pubblicazione. Nelle tabelle I, II, III
per ogni proteina, indicata con il proprio acronimo, abbiamo riportato il codice identificativo GeneBank della sequenza (ID sequenza) e la data di immissione in banca dati. Abbiamo successivamente valutato il livello di omologia delle sequenze scelte rispetto a
tutte quelle pubblicate in banca dati al
fine di avvalorarne la specie- specificità.
Inoltre, per arricchire l’algoritmo che
bassa omologia
bassa omologia
bassa omologia
AB001892
S83213
AY545217
AJ272339
AJ277354
AY611605
AB059419
AY338191
AY656999
AY559244
AY633706
AB111111
Z35494
AB258533
prtH
tetB
lrrA
prtP
FLABII
HprK
GirA
RpoB
FimX
KgP
prtC
Pg-II
hagB and PgiIM
nrdG
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
bassa omologia
omologia rilevante
bassa omologia
rilevante
omologia rilevante
bassa omologia
bassa omologia
omologia rilevante
omologia rilevante
bassa omol. prima di 1700bp
bassa omologia
AY423857
AJ006516
AY069941
AY184489
AF054892
tfsA
groEL
siaHI
susB/susC
BspA
2
2
8
1
2
2
2
1
1
1
2
2
2
10
NR. DI STRAIN
ALLINEATI
1
1
1
1
1
ATCC43037
ATCC 35405; ATCC33520
ATCC 35405; ATCC33520
ATCC 35405; ATCC33520
ATCC 35405
ATCC 35405
ATCC 35405
W83;381
ATCC33277; W83
W83/ 381
47A-1; W83; PZ.GD38;
PZ eli55;
PZ eli47; PZ eli165; PZ eli85 ;
PZ eli88; ATCC33277;
ATCC53977
AU00301; OMZ314
HW24D1; HG405;
BH18/10; 409381;
381; ATCC33277
381; W83
W83
ATCC43037
ATCC43037
ATCC43037
ATCC43037
ATCC43037
ID STRAIN
[Meurman J.H., et al., 2004]
[Sakamoto M., et al., 2001]
[Nadkarni M.A., et al., 2002]
[Orrù G., et al., 2006]
[Lau L., et al., 2004]
[Meurman J.H., et al., 1997]
PRIMER
PUBBLICATI
11:11
P. gingivalis
OMOLOGIA CON
ALTRE SEQUENZE
bassa omologia
omologia rilevante
bassa omologia
omologia rilevante
bassa omologia
ID. SEQUENZA
GENE
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T. denticola
SPECIE
BATTERICA
T. forsythensis
Tabella I
Rappresentazione dei dati relativi ai batteri T. forsytensis, T. denticola, P. gingivalis
TARGET…
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Target genici
utilizzabili nella
diagnosi di
parodontite mediante
tecnologia di PCR
Genic targets relevant
for the identification
of periodontal
pathogens by PCR
base method
161
F. nucleatum
C. gracilis
P. intermedia
bassa omologia
AY635938
A and Boperon
P. nigriscens
parziale omologia con
DQ012979
DQ020251
fadA
apopt. induc.
15
2
PK1594; ATCC10953
ATCC25586; ATCC10953
strain VIT
parziale omologia
2
ATCC23726; ATCC25586
ATCC33568
ATCC3150; ATCC2079
ATCC2929; ATCC3349
ATCC1356; ATCC49256
bassa omologia
AB077041
mg1
1
ATCC33236
periodonticum
bassa omologia
AY227054
fus1
1
ATCC33236
ATCC25586; ATCC51190
bassa omologia
DQ059467
Cpn60
1
strain 17
Fusobacterium
bassa omologia dal 270 nt
DQ174225
rpoB
1
ATCC25611
ATCC25261
ID STRAIN
ATCC12230; ATCC23726
bassa omologia
AB127116
dpp-IV gene
1
1
NR. DI STRAIN
ALLINEATI
Fusobacterium simiae
bassa omologia
AY734539
synt.
Seril-tRNA
OMOLOGIA CON
ALTRE SEQUENZE
ID. SEQUENZA
GENE
PRIMER
PUBBLICATI
11:11
SPECIE
BATTERICA
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Tabella II
Rappresentazione dei dati relativi ai batteri P. nigrescens, P. intermedia, C. gracilis, F. nucleatum.
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LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
TARGET…
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Tombaccini et al.
omologia rilevante
omologia rilevante
parziale omologia
parziale omologia
bassa omologia
bassa omologia
AY198131
AY123719
Z12609
AB243068
U89166
EF165100
Pip and Asp
Cpn60
EcpA and EcpB
LuxS
ECORLD
ltx
E. corrodens
LAVORI ORIGINALI/ORIGINAL ARTICLES
cetecomitans
9
1
1
1
clone PEK30
clone PTD28;
clone PCJ6; lambdaOP8:
clone PCJ2
HK1651; clone P2.17;
clone P10.2;
ATCC29523;
ATCC23834
cell line 1073
ATCC23834
ATCC23834
YA9 isolato
ID STRAIN
[Orrù G., et al., 2006]
[Levine M., et al., 2001]
PRIMER
PUBBLICATI
11:11
1
1
NR. DI STRAIN
ALLINEATI
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A. actinomy-
OMOLOGIA CON
ALTRE SEQUENZE
ID. SEQUENZA
GENE
SPECIE
BATTERICA
Tabella III
Rappresentazione dei dati relativi a A. actinomycetemcomitans e E. corrodens.
TARGET…
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Target genici
utilizzabili nella
diagnosi di
parodontite mediante
tecnologia di PCR
Genic targets relevant
for the identification
of periodontal
pathogens by PCR
base method
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garantisce la loro specificità, le sequenze sono state allineate e confrontate tramite i seguenti software :
BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
ClustalW
http://www.ebi.ac.uk/clustalw/
Per quanto riguarda i target identificativi relativi al 16S rRNA sono stati controllati anche con le piattaforme disponibili nel Ribosomal Database Project
(RDP) all’ indirizzo http://wdcm.nig.ac.
jp/RDP/html/index.html [Maidak B.L., et
al., 2001].
Alcuni microrganismi, come T .forsythensis , P. gengivalis e T. denticola,
hanno un numero elevato di proteine
utilizzabili come possibili target di PCR.
Per contro altri batteri ( come C. gracilis
e P. nigriscens) hanno, in questo senso,
un numero di possibilità limitate. Questo probabilmente è associato in parte a
quanto sono stati studiati nel tempo.
Questo lavoro non è stato fatto per l’A.
actinomycetemcomitans in quanto, come precedentemente sottolineato, avevamo già a disposizione dei primer altamente specifici, disegnati sul gene codificante la leucotossina, e già pubblicati
in letteratura [Orrù et al., 2006]. I risultati ottenuti dall’allineamento con tutte le
sequenze depositate in GenBank, e riferiti alle diverse proteine, sono riportati
nella quinta colonna delle Tabelle I, II,
III. Il grado di omologia riscontrato è
stato indicato come bassa omologia e in
alternativa omologia rilevante. Quando
il grado di omologia interspecifica varia
diversamente lungo la sequenza, è stata
indicata la regione di bassa omologia
(P.gingivalis proteina KgP tabella I e
C.gracilis proteina RpoB Tabella II). Le
sequenze a bassa omologia interspecifica sono quelle più indicate per l’utilizzo
come target specifici di PCR in quanto
abbassano il rischio di falsi positivi. Le
sequenze con omologia rilevante tra le
diverse specie, sono soggette al rischio
di falsi positivi e se non esistono alternative richiedono uno studio approfondito prima di essere utilizzate come validi target di PCR. Dall’analisi di questi
parametri si è potuto valutare che le migliori sequenze su cui disegnare nuovi
target specifici di PCR sono quelle a bassa omologia interspecifica ma individuate costantemente in più ceppi dello
stesso batterio.
RISULTATI
Agregatibacter
actinomycetemcomitans
Per quanto riguarda l’ A. actinomycetemcomitans, i dati sono riportati in Tabella III. Per questa specie sono presenti in banca dati un numero consistente e
svariato di sequenze nucleotidiche codificanti proteine specifiche. Tuttavia la
letteratura offre pubblicazioni in cui sono stati descritti dei primer specifici che
hanno come target l’operone della leucotossina (ltxC), proteina caratteristicamente prodotta dall’A. actinomycetemcomitans. [Cortelli et al., 2005]; [Cortelli
et al., 2003]; Orrù et al., 2006[; [Wu et
al., 2007]. Il vantaggio di questo target,
oltre alla specificità del bersaglio, è la
capacità di poter distinguere tra due diversi genotipi batterici (JP2 e 652), associati ad un grado differente di patogenicità [Orrùet al., 2006]. Nel dettaglio il
genotipo JP2 è fortemente associato allo
sviluppo della malattia parodontale,
mentre il 652 sembra essere un ceppo
attenuato. La distinzione tra i due ceppi
si definisce grazie alla diversa struttura
del gene codificante la leucotossina nei
due diversi genotipi di A.actinomycetemcomitans che produce amplificati di
PCR di lunghezza diversa. La bassa
omologia e la capacità di allineare più
ceppi dello stesso batterio confermano
l’alta specificità di questa proteina e avvalorano l’utilizzo dei primer segnalati
per l’analisi in PCR.
Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis è un microrganismo studiato approfonditamente e per il quale
sono state individuate molte sequenze
genomiche potenzialmente utilizzabili
come bersagli specifici di PCR. In particolare in letteratura si trovano lavori in
cui sono state utilizzate per l’amplificazione le sequenze codificanti i geni KgP,
prtC, Pg-II, che hanno un alto grado di
specificità legato sia alla bassa omolo-
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Tannerella forsytensis
I risultati ottenuti relativi a T. forsythensis mostrano l’esistenza di molteplici sequenze specifiche di questo microrganismo che possono rappresentare target
di PCR alternativi all’rRNA16S. La sequenza del gene BspA è stata utilizzata
nelle reazioni di amplificazione ed i risultati sono pubblicati (vedi riferimenti
bibliografici in Tab I). L’analisi della sequenza del gene BspA ha evidenziato un
basso grado di omologia con altre sequenze depositate. Questo ne avvalora
l’utilizzo nella reazione di PCR in quanto viene ridotta la possibilità di ottenere
risultati falsi positivi.
Treponema denticola
Anche per T. denticola i risultati riportati nella Tabella I mostrano l’esistenza di
sequenze specifiche e alternative per
l’amplificazione in PCR. Tra queste tetB
è stata già utilizzata come bersaglio specifico di PCR, la pubblicazione è riportata in Tabella I. Tuttavia, rispetto ad altre
sequenze individuate e riportate nella
stessa tabella, tetB possiede un grado di
omologia rilevante con sequenze depositate in banca dati. Questa caratteristica
potrebbe produrre reazioni di amplificazione aspecifica. A questo proposito,
geni quali lrrA o GirA risultano più specifici e si prestano meglio ad essere utilizzati come target di PCR.
Batteri appartenenti alla serie
arancione di Socransky
I risultati ottenuti e relativi ai microrganismi della serie arancione sono riportati in Tabella II.
Per i vari ceppi di microrganismi (P. nigrescens, P. intermedia, C. gracilis, F.
nucleatum) abbiamo individuato sequenze alternative per l’analisi di PCR.
Tuttavia, non esistono lavori in letteratura che riportano l’utilizzo delle sequenze da noi individuate in reazioni di
amplificazione.
In particolare merita attenzione il F.
nucleatum per il quale sono state indi-
viduate varie sequenze alternative :
molte di queste sono comuni a diversi
sottogruppi di Fusobacterium e risultano aspecifiche all’interno della specie.
Batteri appartenenti alla serie verde di Socransky
I risultati ottenuti per i batteri della serie
verde sono riportati in Tabella III. I risultati ottenuti per l’ A. actinomycetemcomitans sono stati descritti in precedenza. Per l’ E. corrodens possiamo affermare che esistono e abbiamo identificato diverse sequenze alternative che
possono essere usate come novelli targets di PCR. Tra queste una, ECORLD, è
stata già utilizzata come bersaglio nelle
reazioni di amplificazione.
Target genici
utilizzabili nella
diagnosi di
parodontite mediante
tecnologia di PCR
Genic targets relevant
for the identification
of periodontal
pathogens by PCR
base method
CONCLUSIONI
L’esigenza di una diagnosi ad alta specificità per il rilevamento dei patogeni
parodontali ha fornito i presupposti per
questo studio. Considerando che l’esame colturale normalmente utilizzato
come metodo di indagine microbiologica possiede, rispetto agli attuali metodi
molecolari di rilevamento in PCR e PCR
real-time, un limite di sensibilità maggiore, abbiamo concentrato i nostri studi sul potenziamento della specificità
diagnostica delle moderne metodologie
molecolari. Le metodologie molecolari
possiedono il vantaggio di permettere
in tempi rapidi un’analisi qualitativa e
quantitativa del campione. Queste
caratteristiche, oltre ad avere una forte
valenza diagnostica, costituiscono un
prezioso strumento per comprendere
l’eziopatogenesi della malattia parodondale e di patologie secondarie, anche a
carattere sistemico, ad essa correlate
che si sviluppano a seguito della delocalizzazione dei patogeni parodontali in
altre sedi dell’organismo. Obiettivo primario di questo studio è stato quello di
fornire, revisionando le sequenze nucleotidiche codificanti proteine speciespecifiche presenti in banca dati, uno
strumento di rapida consultazione per la
scelta di nuovi target su cui disegnare
primer specifici di PCR, in modo da
creare un’alternativa valida ai target
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gia con altre sequenze depositate sia alla loro presenza in ceppi diversi della
stessa specie batterica.
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solitamente utilizzati, che marcano i
geni codificanti l’rRNA 16S. Le tabelle
che proponiamo riportano per ogni sequenza individuata, indicazioni di
specificità relativa, verso tutte le sequenze depositate in banca dati, e assoluta, all’interno della stessa specie batterica. La combinazione algoritmica di
questi due fattori costituisce uno strumento fondamentale per la scelta di un
buon bersaglio specie-specifico su cui
costruire nuovi primer di PCR. I target
alternativi che proponiamo vogliono essere un invito alla revisione critica dell’utilizzo dei geni dell’rRNA 16S come
target di analisi, da parte di chi solitamente usa la PCR come metodologia
molecolare di indagine microbiologica.
Alla luce dell’evolversi delle conoscenze molecolari e microbiologiche che evidenziano i limiti dell’analisi in PCR è infatti opportuno accrescere la specificità
dei risultati in un campo, quale la diagnostica parodontale e microbiologica
in genere, in cui le variazioni significative sono solitamente di lieve entità e
richiedono un monitoraggio attraverso
metodi sempre più sofisticati e sensibili.[Amano et al., 1999].
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