DIAGNOSI DI LABORATORIO
Diagnosi microbiologica
• Scopo:
• Identificazione agente infettante
• Determinazione sensibilità agli antibiotici
Diagnosi microbiologica:
identificazione agente infettante
- Prelievo dei campioni:
- prima di iniziare terapia antibiotica
- effettuato sterilmente nella sede del processo morboso
- evitare ogni contaminazione esogena o endogena del
campione
- Il trasporto del campione al laboratorio deve avvenire
in tempi e condizioni che non alterino le caratteristiche
microbiologiche del materiale patologico
- Al campione deve essere allegato modulo di richiesta
compilato (con eventuali dati anamnestici).
Diagnosi batteriologica
• Raccolta campione e prelievo:
– urocoltura - emocoltura - coprocoltura liquor - tamponi
• Esame microscopico:
– osservazione a fresco
– colorazione di Gram
– colorazione di Ziehl - Neelsen
Urocoltura (prima della terapia antibiotica)
• Prelievo: pulizia locale, mitto intermedio
• Semina: valutazione quantitativa: conta UFC dopo
piastratura di aliquote di urina (diluizioni fino 1:1000) o
semina del sedimento dopo centrifugazione. Un valore
≥105 UFC/ml è indice di infezione.
• Valutazione qualitativa: isolamento su terreni selettivi e
differenziali (agar sangue, Mac Conkey, selettivo per
Enterococchi,…), vetrino a fresco e colorazione di Gram
del sedimento.
• Identificazione: Gram+ : S. epidermidis; S. aureus; E.
faecalis ; Gram - : E. coli; Proteus; Providencia;
P.aeruginosa; Klebsiella; Serratia.
• Antibiogramma
Emocoltura
• Prelievo: disinfettare la cute, eseguire il prelievo
sterilmente
• Test in flacone con terreno liquido
• Test in bottiglia difasica
• Test su coagulo
• Test speciali e test rapidi
• I microorganismi indicativi di possibile batteriemia sono:
Staphylococcus; Listeria; Bacillus;Pseudomonas;
Brucella; Haemophilus; E.coli, ecc.
Emocoltura
Per aumentare la probabilità di isolamento occorre:
– effettuare il prelievo immediatamente prima del
rialzo febbrile
– eseguire prelievi ripetuti nel corso della giornata
(almeno 3)
– inoculare due bottiglie: una per aerobi e una per
anaerobi
Il sangue può essere raccolto con la siringa o mediante un
sistema chiuso
Flaconi per
emocoltura
E’ preferibile non eseguire il prelievo da cateteri venosi
centrali a permanenza.
Nel caso di sospetta sepsi a partenza dal catetere, eseguire
l’emocoltura dal catetere e da una vena periferica con la
tecnica della lisi e centrifugazione, che permette la
determinazione della carica batterica. Nel caso di sepsi da
catetere, la carica batterica nel sangue periferico sarà di
almeno 5 volte inferiore rispetto a quella del prelievo da
catetere.
I campioni vanno processati immediatamente.
Le emocolture e mielocolture per la ricerca dei
micobatteri sono eseguite inoculando 10 ml di
sangue in una provetta contenente anticoagulante e
saponina (che lisa le cellule).
A lisi ultimata la provetta si centrifuga e i batteri
vengono ricercati nel sedimento.
Coprocoltura
• Prelievo: raccolta di feci e tampone rettale
• Esame diretto: per la ricerca di miceti e parassiti
intestinali
• Semina in terreni di arricchimento: per facilitare lo
sviluppo di Salmonelle
• Isolamento in terreno solido (selettivo e differenziale):
per la ricerca di E.coli enteropatogeni, Yersinia, C.
perfringens, C. jejuni, Shigelle.
• Antibiogramma
Liquor (LCR)
• Prelievo: puntura lombare (trasporto immediato senza
refrigerazione del campione che potrebbe uccidere le
Neisserie)
• Test rapido: campione a 80°C per liberare antigeni e poi
test di agglutinazione per la ricerca di Haemophilus,
Neisserie, Streptococchi gr. B, Cryptococcus.
• Identificazione: centrifugazione a 3000 g per 15’,
osservazione a fresco del sedimento e colorazione con blu
di metilene e Gram; semina in aerobiosi e anaerobiosi.
Tampone vaginale e uretrale
Prelievo: 3 tamponi dal fornice vaginale prima
della minzione):
– 1 per l’esame microscopico a fresco (protozoi e funghi),
– 1 per l’esame microscopico con colorazione,
– 1 per l’esame colturale.
• Tampone nasale
per la ricerca di S. aureus
• Tampone faringeo
per la ricerca di Streptococcus spp., Staphylococcus
spp., Neisseria spp., Corynebacterium spp., Candida.
• Tampone rinofaringeo
– Prelievo: tampone sottile montato su filo di alluminio
attraverso una narice per la ricerca di Mycoplasma,
Neisseria, C. diphteriae, S. aureus.
Per la ricerca di B. pertussis si fa tossire vicino ad una
piastra con terreno selettivo adatto per questa specie.
• Tampone auricolare: tamponi sottili
• Tampone congiuntivale: prelievo con tampone
dalla congiuntiva tarsale.
• Espettorato (prima della terapia antibiotica)
– Prelievo a digiuno, pulizia cavo orale, induzione
colpo di tosse con aerosol.
– Identificazione: omogenizzato per aumentarne la
fluidità, osservazione microscopica a fresco e
con colorazione; arricchimento per Micobatteri
(in questo caso servono tre campioni prelevati in
tre mattine successive).
Diagnosi batteriologica
Esame colturale
- terreni normali
terreni arricchiti
- terreni selettivi e differenziali
• Valutazione di fattori di virulenza (enzimi,
tossine,…)
– coagulasi - catalasi - ….
• Prove biochimiche
– da una coltura pura
– sistemi API, Enterotube,…
– sistemi automatizzati (Phoenix,Vidas,ecc.)
Diagnosi batteriologica
• Ricerca di enterotossine
• Indagini sierologiche
• Antibiogramma
• Tecniche di biologia molecolare –
PCR - test di ibridazione (sonde)
Ricerca del batterio patogeno
- esame microscopico diretto (utile per materiale
normalmente sterile o con popolazione normale
diversa da quella ricercata) - colorazione - IF
- esame colturale - isolamento - terreni selettivi e
differenziali - identificazione
- ricerca antigeni batterici con metodi immunologici
- evidenza sequenze di genoma batterico con sonde
genetiche - PCR
- ricerca endotossine Gram - (Limulus o LAL test) –
siero- liquor - orine
Emocoltura - urocoltura - coprocoltura
liquor-escreato-essudato faringeo o tonsillare (tamponi)secreti (organi genitali)- pus (ferite e ascessi).
Antibiogramma
colonie resistenti

Diagnosi sierologica
Scopo:
• Valutare lo stato
immunitario di un
soggetto
• Porre diagnosi di
infezione in atto (o
superata)
L’indagine sierologica può avere
diversi scopi:
• Test di screening (scopo epidemiologico, valutazione
della sieropositività in vista di una vaccinazione)
• Scopo diagnostico
• Scopo prognostico
Possibili approfondimenti dei test sierologici
• Titolazione separata di IgG e IgM
• Doppia campionatura (è significativo un
aumento del titolo di 4 volte)
Diagnosi sierologica
- Valutazione dello stato immunitario di un soggetto.
- Doppio campionamento a distanza di 1-2 settimane
per valutare differenze di titolo anticorpale e porre
diagnosi di infezione in atto o superata.
- utile per malattia con reazioni umorali apprezzabili,
- utile per malattia con sospetto clinico che indirizza
verso un preciso agente eziologico.
Ricerche sierologiche
Tecniche:
- precipitazione : diffusione radiale su agar
- agglutinazione: - ricerca anticorpi (salmonellosi, brucellosi,…)
- identificazione antigeni batterici con siero
immune noto
- reazione di immobilizzazione: TPI (batteriocidia)
- reazione di fissazione del complemento (IgM)
- reazioni di immunofluorescenza
- reazioni immunoenzimatiche: ricerca antigeni e anticorpi
Test di
immunoprecipitazione
Test di Elek-Frobisher per la
ricerca della tossina difterica
Agglutinazione
Test di
agglutinazione
con antigene
corpuscolato
Salmonelle
Agglutinazione di Vidal
(Salmonelle)
Fissazione del complemento
reazione di Wasserman
ELISA
Kit per determinare la presenza di tossina di
C. difficile nelle feci (metodo immunocromatografico)
Rilevazione di macromolecole
• Ricerca di proteine
• Western blot, tecnica immunoenzimatica,
immunofluorescenza, agglutinazione al lattice,
emoagglutinazione indiretta
• Ricerca di metaboliti batterici
• gas-cromatografia
• Ricerca degli acidi nucleici
• PCR (polymerase chain reaction), sonde marcate