PATOLOGIE BULLOSE DELLA CUTE
(classificazione eziologica)
CONGENITE
- Epidermolisi Bullose
- Pemfigo Familiare Cronico Benigno
INFETTIVE
- S.S.S.S. (da epidermolisine)
- Virus
IMMUNOLOGICHE
- Pemfigo
- Pemfigoidi
- Dermatite Erpetiforme
- Epidermolisi Bullosa Acquisita
- Dermatosi Bullosa Cronica del Bambino
- IgA Lineari
- Lichen
- Lupus Eritematoso
ALTRE
- Porfirie
- Necrolisi Epidermica Tossica (TEN) / S. di Lyell
- Dermatosi Pustolosa Subcornea
- Dermatosi Acantolitica Transiente (Grover)
- Traumi / Ustioni
- Neoplastiche
ANATOMIA DELLA CUTE
L’epidermide è un epitelio polistratificato ad elementi labili
STRATI DELL’ EPIDERMIDE
¾Strato basale (emidesmosomi)
profondità
¾Strato spinoso (desmosomi)
¾Strato granuloso (granuli di cheratoialina, c.Odland)
¾Strato corneo (12 – 48 giorni per il processo)
superficie
Le patologie autoimmuni bollose della cute sono
caratterizzate dalla presenza di autoanticorpi diretti
contro i principali sistemi di adesione della cute.
Tali patologie sono suddivise a seconda del livello al quale si
verifica la lesione bollosa
Πέμφιξ = bolla
¾Pemfigo
caratterizzato dallo scollamento dell’epidermide, causato
dalla perdita di adesione delle cellule epidermiche
¾Pemfigoide
caratterizzato dallo scollamento sottoepidermico per
perdita di adesione tra i cheratinociti basali ed il derma.
Autoimmune bullous
skin diseases
• Loss of epidermal cell-cell adhesion
causes intraepidermal blisters
Autoimmune
bullous skin
diseases
・・Pemphigus
=
Pemphigus vulgaris (PV)
Pemphigus foliaceus (PF)
• Loss of dermo-epidermal adhesion
causes subepidermal blisters
・・Bullous pemphigoid
Cicatricial pemphigoid
Bullous pemphigoid (BP)
Stanley JR: Adv Immunol 53:291-325, 1993
DERMATOSI BULLOSE ACANTOLITICHE
PEMFIGO
]
_
- VOLGARE (PV) - VEGETANTE
- SEBORROICO – FOLIACEO(PF)
- ad IgA
- ad IgM
-erpetiforme
-farmacoindotto
-Pemfigo Paraneoplastico (PNP)
DERMATOSI BULLOSE NON ACANTOLITICHE
PEMFIGOIDI
_
]
- bolloso di Lever
- Gestazionale
- Cicatriziale ( tra cui OCP e AECP)
- Anti p-200
EBA ( Epidermolisi bollosa acquisita)
DERMATITE ERPETIFORME
DERMATOSI AD IgA LINEARI
DIAGNOSI delle malattie bullose autoimmuni
• Clinica
• Biopsia
• Istologia
• Immunofluorescenza diretta
• Immunofluorescenza indiretta
• Immunoprecipitazione (metodica di rif. per PPN)
• Elisa
• Immunoblotting
• Microscopia elettronica
IMMUNOFLUORESCENZA
diretta e indiretta
Ab-FITC per:
FITC
anti IgG
anti IgA
anti C3
anti IgM
FITC
La ricerca di anticorpi circolanti o tessuto-legati attraverso il
metodo di immunofluorescenza (IF) rappresenta un importante
criterio per la diagnosi in entrambi i gruppi di patologia.
Matusim . J. Am. Acad. Dermatol. 2001
IMMUNOFLUORESCENZA
INDIRETTA
Utilizza esofago di primate come substrato
E’ il metodo routinariamente utilizzato per la ricerca di
autoanticorpi circolanti e permette di identificare
due principali pattern di fluorescenza
Membrana
basale
dell’epidermide
sostanza
intercellulare
Può essere utilizzata lingua di scimmia
Nel pemfigo paraneoplastico è indicata
la mucosa vescicale di topo
La titolazione permette di valutare la gravità della malattia e
seguire le fasi di risoluzione in corso di terapia (C. Betterle)
Targets antigenici
Lo studio delle strutture dermiche coinvolte nel meccanismo
patogenetico ha portato alla identificazione degli antigeni
target degli anticorpi presenti nelle patologie bollose cutanee e
alla loro identificazione e classificazione
Pemfigo
PV,PF,PP
ICS (desmosomi)
Desmogleina 3
Desmogleina 1
Desmoplachina 1- 2
IFA
EIA,WB
Pemfigoide
BP
EBA
PC
OCP
MBZ (emidesmosomi) IgG-M
BP 230, 180
Collageno VII
Laminina
Alfa 6 beta 4 integrina
IFA
EIA,
EIA, WB
Vitiligine
Anti-melanina
EIA, IDD
EIA, WB
Ag dei PEMFIGOIDI
Ag del
PEMFIGO
Ag del LICHEN
130kDa
160kDa
BP230
BP180
105kDa
97kDa
Coll. IV
Fibrille
ancoranti**
(Coll. VII
20-60 nm x 200-800 nm)
Ag della D.Erpet.
ed IgA lineari
145/290 kDa
200 kDa
LAMINA LUCIDA
LAMINA DENSA#
Coll. IV
Coll. V
FIBRILLE ANCORANTI
( SUB-LAMINA DENSA )
Coll. VII, I, III, V, VI
Precoll. I, III
Ag dell'EBA e LES
Antigeni del Pemfigo
Filamenti intermedi
Tonofilamenti
Placca Desmosomiale
α3β1
α2β1
Plakoglobina
α6β4
Ag del Pemfigo Foliaceo (150-160kDa)
DESMOGLEINA I (Dsg1)
Ag del Pemfigo Volgare (130-140kDa)
DESMOGLEINA III (Dsg3)
Pattern di fluorescenza
Principali antigeni target
Aspetto a “ rete di pescatore “
sostanza intercellulare
Desmogleina 1(130 KD) - PF
Desmogleina 3 ( 160 KD)- PV
Desmoplachina I e II
Envoplachina
PPN
Periplachina
Pemfaxina 75 KD
Desmocollina 1 - P. ad IgA
MEMBRANA BASALE
E’ struttura formata da tre strati paralleli e sovrapposti: Polo basale
della membrana cellulare dei cheratinociti basali, con gli
emidesmosomi
1. Lamina lucida, attraversata dai filamenti di ancoraggio che
ancorano le membrane dei cheratinociti basali alla lamina densa.
Contiene la laminina che si lega al Collagene IV ed ai
Proteoglicani favorendo l’adesione. C’è anche l’ Ag del
pemfigoide bolloso (BP180).
2. Lamina densa, di Collagene IV che si lega all’Eparansolfato,
regolatore di permeabilità della GDE
3. Lamina fibroreticolare presenta fibrille d’ancoraggio di
Collagene VII e vi si localizza l’Ag dell’Epidermolisi bollosa
acquisita.
COMPONENTI DELLA GIUNZIONE DERMOERPIDERMICA
Desmosomi (dsg 1,3)
Cheratinocita basale
Giunzione dermoepidermica
tonofilamenti
AgPB230KD
LL
AgPB230KD
emidesmosomi
BP180
BP180
Filamenti di ancoraggio
LD
Laminina 5
Laminina 5
Fibrille di ancoraggio
Sub
LD
Collagene di tipo VII
Placche di ancoraggio
Derma papillare
Fibre collagene
Pattern di fluorescenza
membrana basale dell’epidermide
Principali antigeni target
strutture di adesione
giunzione dermo-epidermica
I pemfigoidi
Affezioni bollose di riscontro più frequente e a prognosi più benigna
rispetto a quelle del gruppo del pemfigo
Incidenza ≈10 nuovi casi/ 1.000.000/anno
• La diagnosi differenziale con altre lesioni
bollose si avvale dell’immunofluorescenza
diretta ed indiretta
• Meglio la metodica Salt Split Skin( siti antigenici più
esposti) per differenziare le diverse varietà
cliniche.
• Ricerca di anticorpi rivolti verso gli autoantigeni
con metodiche di immunoblotting ,
immunoprecipitazione e più di recente in
immunoenzimatica.
Salt Split Skin ( Gammon 1984)
Metodo di separazione della giunzione dermo-epidermica con 1 M di
NaCL
separa artificialmente l’epidermide dal derma (a livello della lamina lucida) e permette di
differenziare due differenti quadri di fluorescenza.
tetto epidermico .
Antigeni emidesmosomiali:
ƒAlfa 6 beta 4 integrina
ƒBP 180
ƒBP 230
ƒ Con IgA ( DAL)
pavimento dermico
Antigeni lamina densa e sub-lamina:
ƒlaminina 5
ƒcollagene tipo IV
ƒcollagene tipo VII (fibrille di
ancoraggio)
ƒ200 kDa
Pemfigoide Bolloso di Lever
Dermatite bollosa a patogenesi immunologica, caratterizzata da
bolle sottoepidermiche, ad evoluzione cronica, colpisce l’anziano >
60 anni.
Epidemiologia. In Francia e Germania, incidenza di 7 casi/106
abitanti/anno;
Patogenesi. Anticorpi anti-membrana basale (anti BP180 ed anti
BP230), dimostrabili anche in circolo nel 70 %, causano la
formazione delle bolle. Non correlano con l’evoluzione.
Contribuiscono anche linfociti Th2.
Evoluzione. Cronica, con successive eruzioni bollose. Esiti
eritemato-cianematosi e discromici. Escludere la coesistenza di un
tumore maligno.
Diagnosi. Bolla sottoepidermica. Immunofluorescenza diretta su
biopsia di un elemento bolloso (DIF o IFD).
Pemfigoide Bolloso di Lever
Clinica. Le lesioni sono spesso precedute da placche orticarioidi
recidivanti molto pruriginose. Compare poi la bolla, tesa e
resistente, che predilige l’addome inferiore e le pieghe flessorie. Vi
sono rare varianti localizzate.
Alterazioni laboratoristiche. Aumento delle IgE (correla con il
prurito), eosinofilia ematica.
Associazioni. Un tempo si riteneva vi fosse una stretta associazione
con le neoplasie, che oggi è messa in discussione; c’è associazionie
con altre malattie autoimmuni, tra cui il Lichen e la Psoriasi.
Pemfigoide Bolloso di Lever
Prognosi.
In assenza di terapia a volte la malattia va in remissione dopo circa
15 mesi. Dei pazienti trattati, il 50 % va in remissione entro 2,5 – 6
anni.
Terapia topica:
•Potenti steroidi.
Terapia sistemica:
Solo nei casi refrattari, 40-60 mg di Prednisone/die, da
somministrare a giorni alterni appena possibile.
Azatioprina e Ciclofosfamide per ridurre la posologia dello steroide.
Talora, Eritrocina/Nicotinamide o Dapsone.
PEMFIGOIDE BOLLOSO
Malattia autoimmune frequente, bollosa ,
simile per caratteristiche cliniche al pemfigo volgare
E’ dovuta alla formazione di anticorpi IgG fissanti il complemento diretti contro due
proteine della membrana basale BPAG1 e BPAG2
BPAG1è una proteina di 230KD localizzata nella porzione intracellulare
dell’emidesmosoma della cellula basale
BPAG2 è una proteina di 180KD che attraversa la membrana plasmatica e si
estende alla lamina lucida superiore.
Il complesso antigene- anticorpo può danneggiare la
membrana basale attraverso la formazione dei complessi
C5b-C9 (attivazione del complemento). Interferenza
sull’elaborazione di fattori di adesione da parte dei
cheratinociti basali.
•Produzione di anafilotossineC3a e C5b che inducono la
degranulazione dei mastociti e rilascio di fattori
chemiotattici per eosinofili, neutrofili e linfociti.
I granuli degli eosinofili contengono sostanze in grado di
danneggiare i tessuti(Perossidasi eosinofila e la proteina
basica principale) che causano la separazione dermoepidermica.
Sistemi antigene-anticorpo nei pemfigoidi
Le malattie autoimmuni
Di Corrado Betterle
Pubblicato da PICCIN, 2001
Malattia
Autoantigeni(BMZ) Frequenza anticorpi
Pemfigoide bolloso
BPAG1( 230KDa)
BPAG2( 180KDa)
P.gestationis
BPAG2
BPAG1
P.cicatriziale
BPAG2
BPAG1
Epilegrina
(laminina 5)
EBA
Collagene tipo VII
Dermatosi IgA lineari LAD-1
47%
16%
26% associati
100%
rari
70%
10%
20%
100%
70-80%
IMMUNOENZIMATICA
Recentemente sono stati commercializzati
per la ricerca degli autoanticorpi
metodi immunoenzimatici che utilizzano antigeni
ricombinanti
Tali metodi, comparati al metodo IFI, presentano
indubbi vantaggi: sono anticorpo specifici, sono
facili da eseguire, forniscono risultati quantitativi,
possono essere completamente automatizzati e in
quanto tali sono più standardizzabili secondo le
procedure di laboratorio.
Svantaggi : restrittiva ( possibile perdita di altre specificità antigeniche)
ELISA kits per
pemfigo e pemfigoidi
Human recombinant protein of DSG1 (MBL, Nagoya, Japan)
Human recombinant protein of DSG3 (MBL, Nagoya, Japan)
I principali epitopi
riconosciuti dai sieri di
pazienti con PB sono
N-terminale e C-terminale.
Human recombinant protein of BP180 (NC16A domain)
(MBL, Nagoya, Japan)
(C- Human recombinant protein of BP230 and N-terminal domain)
(MBL, Nagoya, Japan)
QUESTIONI BP 230 e BP 180 ELISA
• SCELTA del CUT-OFF
– Sensibilità ( 60-80%)
– Specificità (> 80%)
• Raffronto con IFI
• Associazione BP230 e BP 180
• Informazioni sull’attività della malattia
M. Yoshida, T. Hamada, M. Amagai, K. Hashimoto, R. Uehara, K. Yamaguchi, K. Imamura, E.
Okamoto, S. Yasumoto, T. Hashimoto.
Enzyme-linked immunosorbent assay using bacterial recombinant proteins of human BP230 as a
diagnostic tool for bullous pemphigoid. Journal of Dermatological Science (2006) 41,21-30
CUT OFF
BP230 9.2
CUT OFF
BP 180 9.1
Sensibilità: Se si associano i risultati dei due test, nella fase acuta si raggiunge una
positività del 93,8%, nella fase di remissione una positività del 98,3%: in totale è stata
riscontrata una positività del 97,1%.
Specificità: Nessuno dei 94 sieri provenienti da pazienti affetti da Pemfigo è risultato
positivo alla BP180 mentre sono stati trovati positivi 5 controlli normali su 336 analizzati
mostrando una specificità totale pari al 98,8%.
Il test BP230 ELISA ha fornito n°1 risultato positivo sui 94 sieri di pazienti affetti da
Pemfigo e nessuna positività sui 109 sieri di controllo normale mostrando una specificità
totale pari al 99.5%.
Se si associano i risultati dei due test si ottiene una specificità totale pari al 98,9%.
L’associazione dei test BP180 e BP230 fornisce una sensibilità
superiore al 97% ed una specificità superiore al 98%.
Sensibilità (239 sieri di pazienti affetti da BP)
Fase attiva
Remissione
Totale risultati
175 sieri(41 pz)
positivi
84,40%
64,60%
69,90%
(53/64)
(113/175)
(167/239)
57,80%
77,70%
72,40%
(37/64)
(136/175)
(173/239)
BP180 +
93,80%
98,30%
97,10%
BP230-EIA
(60/64)
(172/175)
(232/239)
64 sieri
BP180-EIA +
BP230-EIA +
Specificità
Pemfigo
Controllo normale
Totale risultati
0,00%
1,50%
98,80%
(0/94)
(5/336)
(425/430)
1,10%
0,00%
99,50%
(1/94)
(0/109)
(202/203)
94 sieri
BP180-EIA
BP230-EIA
BP180 +
1,10%
98,90%
BP230-EIA
(1/94)
(93/94)
VALIDATION OF A NEW ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR DETECTION OF BP230 ANTIBODIES IN BULLOUS PEMPHIGOID
M. Tampoia1, R. Filotico2, V. Lattanzi2, A. Zucano1, M.C. Petrelli1, A. Fontana1, G.A. Vena2, F. Di Serio1
1
Patologia Clinica I, Policlinico Universitario, Bari, Italy, 2Clinica Dermatologica Universitaria, Bari, Italy
Autoimmunity, 6th International Congress, Porto 2008
Sensitivity and the specificity for autoantibodies anti-BP230 and anti-BP180
Autoantibody
(cut-off value)
*Sensitivity (%)
Specificity (%)
+LR
(positive
Like Ratio )
-LR
(negative Like
Ratio )
BP230 (8.9 U/ml )
AUC 0.893
80
97.8
36
0.21
BP180 (7.2 U/ml )
AUC 0.938
80
95.6
18
0.21
BP230 + e BP180+
80
98
-
-
*sensitivity determined in patients in active stage of disease.
IFI sensitivity was 80%
Dati in via di pubblicazione
Pazienti
38 pemfigoide
età mediana 76 anni (range 71-85)
20 PB in fase di attività( score >1)
35 pemfigo vulgaris
24 F; età mediana 58 anni (range 35-78)
22 altre patologie cutanee (psoriasi, lichen ruben planus,
LED, dermatosi eczematosa)
20 controlli sani
BP180 cut-off 8.2
BP230 cut-off 8.1
Sensitivity 90%
Specificity 98.8%
Sensitivity 60%
Specificity 98.8%
Anti-BP230 and anti-BP180 in BP patients
in active stage and in remission stage
Autoantibody
Active stage
20 patients
Remission
18 patients
BP180 +
18 (90%)
6 (33%)
BP230 +
12 (60%)
0 (0%)
IFI method
Active stage
6 (30%)
P value
0.007
Chi-square
7.000,1
Il test per la ricerca di autoanticorpi anti-BP 180 con metodo EIA è
più sensibile del test per la ricerca di autoanticorpi anti-BP 230,
entrambi più sensibili dell’immunofluorescenza indiretta.
Anti-BP230 and anti-BP180 autoantibodies are directed against different proteins, it
could play a different pathogenetic role and show different levels in clinical activity
of BP.
In remission stage only anti-BP180 autoantibodies were positive; no patient positive
for anti BP230
clinical remission of disease.
Score clinico e risultati in immunoenzimatica
Numero di lesioni (bolle)
0= assenza di lesioni
1= < 3 lesioni
2= 3-10 lesioni
3= > 10 lesioni
Estensione della malattia
0= assenza di malattia
1= < 10% della superficie corporea
2= 11- 36%
3= > 36%
Intensità del prurito
0= assente
1= presente
2= presente con disturbo del sonno
Significativa correlazione tra attività di malattia
( valutazione in score) e titoli IgG anti BP180
Considerazioni sulle metodiche diagnostiche autoanticorpali
•metodo di immunofluorescenza indiretta
permette di identificare contemporaneamente più autoanticorpi, ma
presenta modesta sensibilità diagnostica ( 80%), è soggettivo, è
semiquantitativo.
•salt split skin
rende il precedente metodo più sensibile e specifico, ma è piuttosto
indaginoso
•metodo immunoenzimatico
Mostra una elevata specificità diagnostica (> 95%) ed una sensibilità
paragonabile a quella dell’immunofluorescenza indiretta, è
automatizzabile, è quantitativo e permette di monitorare il decorso della
malattia.