Il microscopio ottico
La parola microscopio è stata coniata dai
membri dell’Accademia dei Lincei di cui faceva
parte anche Galileo Galilei
Ingrandimento
Un oggetto può essere visto a fuoco se
posizionato ad una distanza non inferiore a
circa 250 mm
L’ingrandimento di un oggetto a 250 mm è
cosiderato 1x
Individui giovani che possono mettere a
fuoco a distanza inferiori di 250 mm,
potendo così portare l’ingrandimento a
circa 2x,
RETINA
LENTE SEMPLICE
CAMPIONE
IMMAGINE VIRTUALE
II LENTE
IMMAGINE INTERMEDIA
I LENTE
CAMPIONE
IMMAGINE VIRTUALE
Su questo principio si
basa il
microscopio
composto.
OCULARE
OBIETTIVO
Ingr. totale =
Ingr. oculare
X
Ingr. obiettivo
Anche il microscopio ha dei limiti:
non basta infatti ingrandire per
potere risolvere due oggetti vicini.
L’ingrandimento eccessivo porta
all’ingrandimento a vuoto: gli oggetti
risultano più grandi ma non meglio risolti.
Il potere di risoluzione
Potere di risoluzione (R): la minima distanza tra due oggetti a cui i
due oggetti si vedono distinti
Per quello che riguarda l’occhio umano: R=50mm
Per quello che riguarda il microscopio ottico: R=250nm
R
Il microscopio in campo chiaro
Tubo Bi/Tri oculare
Oculari
Revolver porta obiettivi
Tavolino porta oggetti
con traslatore
Edicola porta lampada
con lampada
Condensatore
con diaframma d’apertura
Diaframma di campo
Condensatore di campo
Gli obiettivi
Sistema di lenti a corta focale, responsabili del
primo ingrandimento dell’immagine
Costruttore
Correzioni
Ingrandimento
Obj. Per usi
particolari
Lunghezza tubo
stativo
Spessore coprioggetto
Correzioni
Apertura
numerica
Obiettivo ad
immersione
Working
distance
Codice colore
N.A.
Indice di qualità dell’obiettivo: potere di risoluzione,
luminosità ecc.
La risoluzione del microscopio dipende da:
• lunghezza d’onda della luce utilizzata;
• apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo.
R = 0,61 λ / N.A.
N.A.= n sen α
Descritta per la prima volta da Ernest Abbe e Carl Zeiss
E’ un parametro della qualità dell’obiettivo
α sempre inferiore a 90°
R = 0,61 l / n sen a
• Maggiore è l’angolo con cui l’obiettivo è in grado di raccogliere la
luce maggiore è il potere di risoluzione
• Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro
R = 0,61 l / n sen a
N.A
Resolution
(µm)
4x
0.13
2.12
10x
0.30
0.92
20x
0.50
0.55
40x
0.75
0.37
60x
0.85
0.32
100x
1.30
0.21
Rifrazione
Plan Achromat
Plan Fluorite
Plan Apochromat
Magnification
N.A
Resolutio
n
(µm)
N.A
Resolution
(µm)
N.A
Resolution
(µm)
4x
0.10
2.75
0.13
2.12
0.20
1.375
10x
0.25
1.10
0.30
0.92
0.45
0.61
20x
0.40
0.69
0.50
0.55
0.75
0.37
40x
0.65
0.42
0.75
0.37
0.95
0.29
60x
0.75
0.37
0.85
0.32
0.95
0.29
100x
1.25
0.22
1.30
0.21
1.40
0.20
Gli obiettivi all’infinito
OCULARE
OCULARE
IMMAGINE
IMMAGINE
INTERMEDIA
INTERMEDIA
Fascio a
raggi
paralleli
OBIETTIVO
OBIETTIVO
CAMPIONE
all’infinito
CAMPIONE
Il condensatore
Il condensatore è posto sotto al tavolino del microscopio.
E’ un sistema di lenti che converge la luce proveniente dal
condensatore di campo all’obiettivo
E’ fornito di un diaframma: il diaframma di apertura
Il diaframma di apertura, invia nell’obiettivo un cono di luce più o
meno ampio a seconda dell’N.A. dell’obiettivo. Permette quindi
di sfruttare al massimo il potere di risoluzione del microscopio.
Le tre regole del buon condensatore
Il condensatore deve essere di massima qualità,
paragonabile a quella dell’obiettivo.
Il condensatore deve avere la stessa apertura numerica
dell’obiettivo. Per questo esiste il diaframma di apertura.
In “teoria” il miglior condensatore per un dato
obiettivo è l’obiettivo stesso.
La regolazione secondo Kohler
1. La distribuzione uniforme della luce su tutto il campo
2. Il massimo sfruttamento dell’ A.N dell’obiettivo
3. L’eliminazione di raggi marginali e di luce diffusa che
possono ridurre la qualità dell’immagine
4. La riproducibilità delle condizioni di osservazione
Il metodo di Kohler si applica in tre momenti successivi:
1. Centratura e regolazione in altezza del
condensatore.
2. Regolazione del diaframma di campo.
3. Regolazione del diaframma di apertura.
I punti 2 e 3 vanno attuati ad ogni cambio di obiettivo.
3°: REGOLAZIONE DEL DIAFRAMMA DI
APERTURA.
NO
Vale la pena di sottolineare ulteriormente la funzione
dei diaframmi di campo e di apertura.
DIAFRAMMA
DI APERTURA
DIAFRAMMA
DI CAMPO
Il diaframma di campo varia la sezione
del fascio ottico, illuminando superfici
più o meno ampie del campo
microscopico.
La sua regolazione, in funzione
dell’obiettivo usato, permette di
inviare sul campione solo la luce
necessaria ad illuminare il campo
visto da quell’obiettivo.
Fotomicrografia di qualità scadente a causa del
condensatore tenuto troppo basso.
Fotomicrografia di pessima qualità a causa del
diaframma di apertura troppo chiuso, che determina una
forte riduzione del potere di risoluzione.
Il condensatore dovrà essere accuratamente centrato,
pena la difformità di illuminazione del campo.