Diagnostica di laboratorio della tubercolosi:
le antiche certezze e le nuove frontiere
La diagnosi immunologica
dell’infezione tubercolare
Dr. Chiara Agrati, PhD
Laboratorio di Immunologia cellulare
INMI L. Spallanzani
Mycobacterium tubercolosis e l’uomo:
Un equilibrio complesso e delicato
Una malattia persistente
Rappuoli R. Nat Med 2004
Infezione latente e malattia attiva
Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno)
Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico,
batteriologico e/o radiologico.
Infezione tubercolare latente (2 miliardi)
Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza
segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia
manifesta. Tipicamente si tratta di individui con
intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx
torace normale, che possono essere contatti di un
precedente caso di tubercolosi.
Risposta immunologica e esito
dell’infezione
High Innate
immunity
MTB clearence
NO Infection
Controlled
>90%
Innate
immunity
Adaptive
immunity
Latent
Infection
Reactivation
<10%
Innate
immunity
Defective
Adaptive
immunity
Disease <10%
Gran parte del “successo” di Mtb
come agente patogeno è dovuto
alla
sua capacità di interferire con
praticamente ogni meccanismo
battericida del macrofago
utilizzando tale tipo cellulare
come
un cavallo di “Troia” per
sfuggire
al riconoscimento immune
Diagnosi
• Infezione attiva:
a) Microbiologica (Microscopia, Coltura e Metodi molecolari)
b) Radiologica
• Infezione latente
a) Test immunologici che valutano la risposta immune
(Mantoux, IGRA)
• Immunità umorale - Riscontro in circolo di anticorpi
• Immunità cellulo-mediata - Riscontro in circolo di
cellule T specifiche per il patogeno
Immunità umorale e cellulo-mediata
IMMUNITA’ UMORALE
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA
ANTIGENE
BATTERI EXTRA-CELLULARI
MICROBI INTRA-CELLULARI
ALL’INTERNO DI UN MACROFAGO
MICROBI INTRA-CELLULARI
IN UNA CELLULA INFETTATA
LINFOCITI
RESPONSIVI
LINFOCITA B
LINFOCITA T
LINFOCITA T
MECCANISMO
EFFETTORE
ANTICORPI
SECRETI
ELIMINAZIONE
DEI BATTERI
ATTIVAZIONE DEL MACROFAGO
UCCISIONE DEI MICROBI
LISI DELLA CELLULA
INFETTATA
Il ruolo dei linfociti T
• CD4:
- Induzione dei meccanismi battericidi del macrofago
- Rimozione del blocco della maturazione
del
fagosoma e della fusione del fagolisosoma
- aumento delle molecole costimolatorie
- Produzione di citochine infiammatorie
• CD8:
- Lisi delle cellule infette mediata da citochine
- Lisi delle cellule infette mediata da granulolisine
Il principale obiettivo dei
test immunologici
è di identificare le
infezioni tubercolari latenti
Ma non discriminano tra
infezione latente e attiva
I test immunologici
1) Mantoux, introdotta nel 1891
2) IGRA: Interferon-gamma release assay (dal 2001)
2a) Quantiferon TB Gold
2b) Quantiferon TB In tube
2b) QTSPOT-TB
La Mantoux
• E’il più vecchio test diagnostico ancora in uso
-1891: filtrato di brodo di coltura (reazione febbrile)
-1934 PPD (reazione cutanea di ipersensibilità ritardata)
-Oggi: inoculazione intradermica di 5UI di PPD e lettura dopo
48-72h.
–il soggetto che ha immunità specifica
produce una papula
(lettura dopo 48-72 h)
– si misura l’infiltrato, non l’eritema
Vantaggi della Mantoux
• Utile per predire la TBC attiva
• Il trattamento dei soggetti Mantoux positivi
riduce drasticamente il rischio di passaggio alla
tubercolosi attiva
• Basso costo
• Non richiede l’intervento del laboratorio
Limiti della Mantoux (1)
Problemi di ordine pratico
• 2 visite (inoculo e lettura
• 30% dei test rimane senza lettura
falsi positivi
• legati a cross-reazione con altri micobatteri
• legati a vaccinazione con BCG
• effetto booster
• legati alla somministrazione
• legati alla lettura
Vantaggi della Mantoux (2)
falsi negativi
• legati al soggetto testato
– infezioni
– disturbi metabolici
– malattie degli organi
linfoidi (HD, linfomi…)
– fattori nutrizionali
– età (neonati, anziani)
– farmaci (corticosteroidi,
– infezione di MTB recente
agenti immunosoppressivi…)
– stress (chirurgia, GVHD…)
• legati alla tubercolina
– improprio stoccaggio, diluizione…
• legati alla somministrazione
– ritardo dopo la
preparazione della siringa
– quantità insufficiente di
antigene somministrato
• legati alla lettura
– inesperienza del lettore
– errori consci o inconsci
Lettura della Mantoux: cut-off
Cut-off di positività per gruppi di rischio
≥ 5 mm
- HIV positivi
- contatti recenti
di TB
- rx compatibile
con TB
- trapiantati e
immunosoppressi
≥ 10 mm
≥ 15 mm
- immigrati di recente - soggetti senza
da aree ad alta
fattori di rischio
prevalenza
- tossicodipendenti
- residenti e operatori
di ambienti a rischio
- silicosi, diabete
mellito, IRC,
leucemie, carcinomi…
I test IGRA
IGRA: Interferon gamma release assay
3 principali modifiche rispetto alla Mantoux:
a) test in vitro
b)Antigeni utilizzati: per la stimolazione vengono
utilizzati gli antigeni ESAT-6 e CFP-10, specifici per
MTB ed assenti nel BCG
c)Hanno un controllo positivo di immunocompetenza
IGRA: tests in vitro
Measurement of IFN-γ
IGRA: antigeni specifici
La scelta degli antigeni
• La Manotux si base sull’inoculazione di PPD (purified
proteic derivative) che è presente in molti altri micobatteri
> specificità
ambientali e anche nella vaccinazione con BCG.
Gli IGRA utilizzano antigeni codfificati in una regione
genica (RD-1) che manca nel BCG e in quasi tutti i
micobatteri ambientali. I principali di questi antigeni sono:
– ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)
– CFP-10 (culture filtrate protein 10)
IGRA: controllo positivo
E’ importante per evidenziare
FALSI NEGATIVI
Vantaggi degli IGRA
Test in vitro
Nessun effetto booster
Specificità elevata (antigeni ESAT-6 e CFP-10 codificati in una regione genica
(RD1)
Non influenzati dalla vaccinazione con BCG
Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione
del paziente
Interpretazione oggettiva (fornisce un dato di Laboratorio, positivo o negativo,
rispetto ad un “cut-off” universale per tutti i soggetti, indipendentemente dal
fattore di rischio cui sono esposti)
Disponibilità di un controllo mitogeno (QFT-TB GOLD) che permette di
verificare la risposta immunitaria del paziente.
Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari
Limiti degli IGRA
• I campioni di sangue devono essere processati entro
8-16 ore
• Esistono meno dati sull’utilizzo di questi test in alcune
popolazioni di soggetti come immunocompromessi,
bambini e nei follow up seriali
Sensibilità
NON esiste un gold standard
1)Proporzione di test positivi in soggetti con TB attiva
2)Stima della sensibilità usando il gradiente di esposizione
Specificità
NON esiste un gold standard
Il Quantiferon è chiaramente più sensibile negli individui vaccinati
Quale test è più opportuno utilizzare ?
E’ preferibile usare Mantoux
1) Nei bambini al di sotto dei 5 anni di età.
Alcuni esperti suggeriscono che per aumentare la sensibilità sarebbe
meglio farli entrambi.
E’ preferibile usare IGRA
1)
Persone ad alto rischio di non presentarsi alla 2 visita
per la lettura (tossicodipendenti, senza tetto, etc);
2) Persone vaccinate con BCG;
3) Nei follow-up per evitare l’effetto booster
Quale test è più opportuno utilizzare ?
Paragonabili
=
1) Contatti recenti con persone con TB attiva o sospetta TB attiva. Sul
TST ci sono più dati ma c’è rischio effetto Booster; per gli IGRA meno
dati sui tempi di conversione
2) Screening occupazione per persone a rischio (HCWs). Problema
delle conversioni/reversioni
Mantoux + IGRA
+
1) Test iniziale negativo:
1a) gruppi ad alto rischio di infezione e progfresisone (HIV, bambini < 5
anni);
2a) sospetto fondato di infezione e si desidera conferma
2) Test iniziale positivo:
2a) servono ulteriori evidenze per convincere pazienti;
2b) grupi a bassissimo rischio
3) Nei casi in cui test IGRA è indeterminato/borderline/etc.
Laboratorio di Immunologia
Cellulare
Federico Martini
Cristiana Gioia
Alessandra Rinaldi
Domenico Viola
Federica Turchi
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE