INCONTRO CON I MEDICI DI MEDICINA GENERALE
AREZZO ORDINE DEI MEDICI 15 MAGGIO 2010
Regione Toscana
Azienda USL 8 Arezzo
ESAMI NUOVI-ESAMI OBSOLETI
Sede legale e
Centro Direzionale
Via Curtatone, 54
52100 Arezzo
Telefono 0575 2551
Dott. Moreno Matteucci
Sieroimmunologia e Biologia Molecolare
Laboratorio Analisi USL 8
Arezzo
Dipartimento Patologia Clinica
QUANTIFERON TB GOLD
TBC attiva
–8 milioni di nuovi
casi per anno
TBC latente
Due miliardi di
persone
Tubercolosi dimensioni del
problema
E’ responsabile, ogni anno, nel mondo:
▪5% di tutti i decessi (2 milioni)
▪9,6% dei decessi in soggetti tra 15 e 59 anni
▪il maggior numero dei morti per malattia
infettiva
▪La letalità nei casi non trattati è di circa il
50%
▪ nei paesi in via di sviluppo è responsabile di
oltre il 25% dei decessi evitabili.
▪devastante impegno economico
MYCOBACTERIUM
TUBERCOLOSIS
Patogeno intracellulare, a trasmissione interumana
La ricchezza in lipidi della parete cellulare
conferisce ai micobatteri alcune particolari
ssenza di infezione (5%)
caratteristiche:
Infezione (95%) TBC attiva (5%)
(entro 2 anni)
Lento
di moltiplicazione
TBC tempo
latente (95%)
Riattivazione (5%)
nessuna riattivazione
Alcool acido resistenza
Reazione del S.I. tipo “corpo estraneo”
Inefficacia dei comuni antibiotici
ESPOSIZIONE AL M.TUBERCOLOSIS
INFEZIONE (95%)
TBC LATENTE (95%)
NESSUNA RIATTIVAZIONE
ASSENZA DI INFEZIONE (5%
TBC ATTIVA (5% ENTRO 2 ANNI)
RIATTIVAZIONE (5%)
Produzione di interferone-γ
(IFN-γ)
L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T
Le cellule-T attivate secernono citochine
IFN-Ү
TNF
IL8
Le cellule-T effettrici producono IFN-γ entro poche ore
dalla stimolazione
Le cellule-T memoria devono prima proliferare
trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado
di produrre IFN-γ prima di 24h
L’IFN-γ non è normalmente presente in circolo, è stabile e
misurabile
INTRADERMOREAZIONE DI
MANTOUX
Introdotta nel 1890, è il più vecchio test
diagnostico ancora in uso
Si basa sull’inoculo intradermico del PPD,
(miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni
dei quali sono presenti anche nel BCG e nei
micobatteri non tubercolari)
VANTAGGI DELLA MANTOUX
►Utile
per individuare la TBC latente
►Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi
riduce drasticamente il rischio di passaggio alla
tubercolosi attiva
►Basso costo
►Non richiede l’intervento del laboratorio
LIMITI DELLA MANTOUX
Falsi positivi
●
(5-60% dei vaccinati)
Tempo trascorso dalla vaccinazione
Numero di vaccinazioni
Età al momento della vaccinazione
- Esposizione a micobatteri non tubercolari
(NTM)
- Effetto booster
Effetto della vaccinazione
con BCG sul TST
Analisi di 24 studi con N = 240,243
soggetti
Quando il BCG è somministrato
nell’infanzia, 6% falsi-positivi nei
risultati del TST a causa del BCG
Quando il BCG è somministrato dopo
l’infanzia, 40% falsi-positivi a causa
del BCG
LIMITI DELLA MANTOUX
Falsi negativi
Anergia (soggetti immunodepressi,
malnutriti, con tubercolosi avanzata)
●Errori di inoculo
●Errori di lettura (soggettività,
inaccuratezza della misurazione)
LIMITI DELLA MANTOUX
Problemi di ordine pratico
Doppia presentazione del paziente
Mancata lettura nel 30% dei casi
Soggettività della misurazione
CRITERI DI LETTURA DELLA
MANTOUX
Interferon Gamma Release
Assay
TEORIA: i linfociti T
precedentemente sensibilizzati
con antigeni tubercolari
producono alte concentrazioni
di IFN-gamma quando riesposti
allo stesso antigene.
I TEST BASATI SULL'
INTERFERONE γ
I linfociti del soggetto in esame vengono posti in
contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo
di antigene e con un controllo positivo contiene
fitoemoagglutinina
Ricerca dell’IFN-γ dopo opportuna incubazione
assenza di IFN-γ = ASSENZA DI INFEZIONE
presenza di IFN-γ = INFEZIONE
presenza di IFN-γ nel controllo NEG = TEST NON VALIDO
assenza di IFN-γ nel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO
SCELTA DEGLI ANTIGENI
I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare
producono interferone-γ se vengono in contatto con uno
o più antigeni del M. tuberculosis
PPD (purified proteic derivative)
ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)
CFP-10 (culture filtrate protein 10)
ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica
(RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT
QUANTIFERON TB GOLD
RACCOLTA SANGUE IN
PROVETTE EPARINATE
C-NEG
ESAT6
CFP10
INCUBAZIONE PER 16-24 h A 37
MITOGENO °
CENTRFUGAZIONE
COLORE
MISURA DELLA D.O
DOSAGGIO IFN
CONTRO CURVA
DI TARATURA
RECUPERO DEL PLASMA
DOSAGGIO DELL' IFNγ
(SANDWIC ELISA)
LAVAGGIO
AGGIUNTA SUBSTRATO
AGGIUNTA STOP
Vantaggi dei metodi basati su
IFN-γ
Test in vitro
Nessun effetto booster
Specificità elevata
Non influenzati dalla vaccinazione con BCG
Praticità: occorre solo un prelievo di sangue
e non è richiesta la collaborazione del
paziente
Interpretazione oggettiva
Test IFN-γ vs.
Mantoux
Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva:
SOVRAPPONIBILE
Sensibilità nei casi di sospetta infezione
latente: MAGGIORE per IFN-γ
I casi con Mantoux NEG e IFN-γ POS sono
generalmente associati con l’esposizione
I casi con Mantoux POS e IFN-γ NEG non
sono generalmente associati con l’esposizione
Correlazione IFN-γ/Mantoux
Sensibilità
Specificità
IFN-γ
Mantoux
89.0%
65.7%
(105/118)
(50/76; 5 mm)
98.2%
35.4%
(213/217)
(73/113; 10 mm)
VANTAGGIDELL' IGRA
Nessuna correlazione con la vaccinazione
Nessuna correlazione con le micobatteriosi
Nessuna variazione in corso di terapia
Alta riproducibilità
Maggior sensibilità negli immunodepressi
LINEE GUIDA
CDC
Nelle “Guidelines for the Investigation
of Contacts of Persons with Infectious
Tuberculosis” (CDC Atlanta, 2005) si
suggerisce che il QFT-G assay
POTREBBE essere usato al posto del
TST in tutti i casi (Dr. Vernon)
LINEE GUIDA
NICE
National Institute for Health and
Clinical Excellence TB guidelines”
(Regno Unito, 2006) si consiglia uno
screening iniziale con TST seguito da
un test IGRA (se disponibile) per i
casi TST+, oppure (se il risultato del
TST non è affidabile) per la
conferma del TST.
Screening della
popolazione
NESSUNA strategia è costo efficace se
l’incidenza della LTBI < 10%.
Con incidenza della LTBI del 10-40%, il
test della tubercolina , seguito da un test
IGRA sui pazienti positivi alla tubercolina,
è cost-effective.
L’uso del solo IGRA test è costo efficace
SOLO SE l’incidenza della LTBI è ≥ 40%.
CONCLUSIONI
NELLA SITUAZIONE EPIDEMIOLOGICA
ITALIANA LA STRATEGIA DI
UTILIZZO DEL TEST
TUBERCOLINICO CUTANEO CON
SUCCESSIVA CONFERMA DEI TEST
CUTANEI POSITIVI USANDO I TEST
SU SANGUE APPARE QUELLA IN
GENERALE POTENZIALMENTE
DOTATA DI UN MIGLIOR RAPPORTO
COSTO-BENEFICIO.
CALPROTECTINA
CALPROTECTINA
La Calprotectina è una proteina di 36 KDa
presente in tutte le cellule, tessuti e liquidi
di tutti i distretti del corpo umano.
Le è stato attribuito il nome
Calprotectina
per sua la capacità di legare il calcio e lo
zinco e di inibire la crescita microbica.
è presente in elevata concentrazione nel
citoplasma dei globuli bianchi neutrofili
(granulociti neutrofili) – 5-15 mg/l =
5%delle proteine totali, 50-60% delle
proteine solubili
viene rilasciata dai granulociti neutrofili in
conseguenza della loro distruzione o
di una stimolazione ed è quindi un marker
del loro turnover
Nella popolazione sana la Calprotectina
Fecale(FCal) è presente nelle feci ad una
concentrazione circa 10 volte più alta
rispetto a quella del plasma.
Nelle feci la proteina è stabile fino a sette
giorni a temperatura ambiente e per mesi se
il materiale viene congelato a -20°
rappresenta una diretta misura della
attività infiammatoria della parete intestinale è
in grado di registrarla anche a uno stadio
così lieve da non essere sufficiente a modificare
la VES o la CRP
i livelli nelle feci non sembrano essere
influenzati da flogosi in altri distretti che
possono invece provocare un innalzamento dei
marcatori sistemici di infiammazione
Incremento significativo:
tumore dello stomaco
tumore o l’adenoma del colon
malattia di Crohn
colite ulcerosa.
Valori sostanzialmente normali di
calprotectina sono stati invece evidenziati
nelle patologie funzionali e nella celiachia
LA CALPROTECTINA NELLE PATOLOGIE
ADDOMINALI
Aumenta nelle feci del 96% di pazienti con Crohn
- discrimina tra Crohn e “intestino irritabile”
- aumenta nelle feci di pazienti con colite ulcerosa e
neoplasie intestinali
- elevata predittività negativa
- aumento maggiore nelle fasi clinicamente attive di
malattia
- marcatore predittivo di riacutizzazione
INDICAZIONI ALLA RICHIESTA DI
DOSAGGIO DELLA CALPROTECTINA
FECALE
*
*per monitorare l’attività infiammatoria
intestinale
*come indicatore di ricorrenza della
patologia
*nel follow-up terapeutico
*per escludere MICI in soggetti con
diarrea cronica o dolore addominale cronico
sconosciuto
MATERIALE PER LA RACCOLTA DEL CAMPIONE
฀
INTERPRETAZIONE DEI
RISULTATI
< 40 μg/g NEGATIVO
40 – 60 μg/g DUBBIO
–ripetere la determinazione con un nuovo campione
> 60 μg/g POSITIVO
> 300 μg/g POSITIVO
Oltre il limite di linearità
PARVOVIRUS B19
PARVOVIRUS B19
PARVOVIRUS B19 E' ANCHE CONOSCIUTO
COME:
ERITROVIRUS B19
PARVOVIRUS UMANO
E' L'AGENTE EZIOLOGICO DELLA “QUINTA
MALATTIA” O ERITEMA INFETTIVO
CARATTERISTICHE DEL VIRUS
DNA virus a filamento singolo lineare (famiglia
Parvoviridae, genere Erythrovirus)
Codifica tre proteine
VP1, VP2 (Proteine del capside)
NS1 (non-strutturale, usato dal virus per replicare se
stesso)
Le Proteine del Capside sono composte per il 5% dalla
VP1 e per il 95% dalla VP2 (tutti i saggi sierologici
sono basati sulla rilevazione di una o di entrambe le
proteine)
Non ha involucro - il virus sopravvive al calore e ai
trattamenti usati per gli emoderivati
MECCANISMO DI INFEZIONE DELLE
CELLULE ERITROIDI
Il bersaglio del virus sono le cellule nucleate che appartengono alla
serie eritroide, precursori degli eritrociti. Si ha lisi cellulare,
diminuzione di globuli rossi,della emoglobina e quindi grave anemia
Le cellule eritroidi dispongono dello specifico recettore (l'antigene
eritrocitario P o globoside P) ed inoltre sono cellule in
proliferazione, caratteristica determinante per la possibile
replicazione virale, che necessita di fattori presenti solo nella fase
S di replicazione cellulare
L’antigene P si trova anche sulle
Cellule Endoteliali,
Megacariociti
Cellule della Placenta
Cellule cardiache ed epatiche del feto
L’uomo è l’unico ospite conosciuto
VIE DI TRASMISSIONE
Contatto mano-bocca
Sangue ed emoderivati
Trapianto di midollo e altri organi
Dalla madre al feto (trasmissione verticale )
Per via aerea
Periodo di incubazione: 4 – 20 giorni
Il periodo di maggiore trasmissione del virus si
ha nei primi 7-14 giorni (prima della comparsa
dei sintomi)
RISPOSTA ANTICORPALE
CATEGORIE A RISCHIO
BAMBINI (4-11 anni
d’età)
Eritema Infettivo(EI) /
“Quinta malattia”
Le epidemie in genere si
segnalano ogni 3-4 anni
Il 50-70% degli adulti
sono siero-positivi
IMMUNOCOMPROMESSI
TRAPIANTATI
TRASFUSI
PARVOVIRUS E GRAVIDANZA
Il feto è sensibile all’infezione verso la 6°
° settimana di
gestazione.
I
Diminuzione di periodo di vita dei globuli rossi.
Alto rischio di sviluppare idrope nel secondo trimestre
quando la massa dei globuli rossi fetali aumenta da 3 a 4
volte.
FISIOPATOLOGIA DELL'INFEZIONE FETALE
Infezione materna con viremia
Virus trasmesso attraverso la placenta
Il virus si fissa all’antigene P delle cellule eritroidi, del fegato e del
cuore fetali
Il virus si replica con conseguente morte delle cellule
Anemia fetale dovuta alla diminuzione dei globuli rossi e
emoglobina
Anemia porta ad una diminuzione di ossigeno nei tessuti
(ipossia)
Compensazione con un aumento del lavoro da parte del cuore
collasso & idrope fetale
NB: l’infezione della milza, fegato e cuore fetale può essere la
causa che contribuisce al collasso degli organi
INFEZIONE PRIMARIA IN
GRAVIDANZA
Rischio di trasmissione
intrauterina 25-33%
EisEis-Hubinger 19981998-Yaegashi 19981998-Koch 1998
Rischio danno fetale
5-10 %
Harger, Koch and Adler 1998 - Kerr 1994 -Koch
1993
STATISTICHE RECENTI
4 milioni di nascite in Europa /anno
Il 30% delle donne non sono immunizzate
quindi 1.200.000 di donne sono a rischio di
infezione
Stima di aborti è di circa 3000/anno
PAZIENTI DA CONTROLLARE
Sospetta esposizione
(NOTA: il 25-50% delle donne sono
asintomatiche)
Presenza di un rash
Poliartralgia non spiegabile
Idrope fetale non immune
Controlli pre gravidanza per gruppi
professionali ad alto rischio
PARVOVIRUS E SINTOMATOLOGIA
ARTRITICA
Rare in bambini.
Più comuni nelle donne:
60% donne, 30% uomini soffrono di dolori artritici
Principalmente colpite le articolazioni delle mani,
piedi e ginocchia
Di solito persiste 1-3 settimane raramente qualche
mese
E'comune una reinfezione anni più tardi a causa
della replicazione del DNA virale a livello della
membrana sinoviale
PARVOVIRUS E TRAPIANTI
L’infezione da Parvovirus B19 può essere
cronica nei trapiantati di organo o di midollo
osseo a causa delle terapie immunosoppressive
usate.
Può contribuire ad alcuni casi di rigetto.
A CHI FARE IL TEST'?
• Screening sulle donne in gravidanza
• Reumatologia
• Trasfusioni/Trapianti
•Immunocompromessi (HIV+,
leucemia)
I TEST IN BIOLOGIA
MOLECOLARE
I TEST IN BIOLOGIA MOLECOLARE
SONO TEST BASATI SULLA
AMPLIFICAZIONE DI SPECIFICI
SEGMENTI DEL GENOMA DI
MICROORGANISMI (VIRUS O BATTERI)
OPPURE UMANO
E' UNO DEI CAMPI IN GRANDE
ESPANSIONE NEI TEST DI
LABORATORIO
I TEST ESEGUITI NEL
NOSTRO LABORATORIO
HCV RNA QUANTITATIVO
GENOTIPIZZAZIONE HCV
HBV DNA QUANTITATIVO
HIV RNA QUANTITATIVO
MBT QUALITATIVO
TUTTI I TEST UTILIZZANO LA
TECNOLOGIA REAL-TIME
APPROPRIATEZZA DELLA
RICHIESTA
I TEST IN BIOLOLOGIA MOLECOLARE DEVONO
ESSERE RICHIESTI CON APPROPRIATEZZA
ALTRIMENTI
SONO INUTILI(O ADDIRITTURA DANNOSI)
SUL PIANO DIAGNOSTICO/ TERAPEUTICO
RAPPRESENTANO UN COSTO NOTEVOLE E
INGIUSTIFICATO
QUANDO RICHIEDERE LA RICERCA
DI HCV-RNA
• PAZIENTI CON ANTICORPI POSITIVI
• PAZIENTI IMMUNOSOPPRESSI O
IMMUNOCOMPROMESSI CON ALT
ELEVATE E ANTI HCV NEGATIVI (POSS.
FALSI NEGATIVI)
• NEONATI DA MADRE HCV POSITIVA E/O
HIV POSITIVA (3, 6 e18 MESI DALLA
NASCITA)
• A TERMINE GRAVIDANZA NELLA MADRE
ANTI-HCV POSITIVA
QUANDO RICHIEDERE LA RICERCA
DI HCV-RNA
FOLLOW-UP DEI PAZIENTI IN
TERAPIA ANTIVIRALE
1 DOSAGGIO PRIMA DELL'
INIZIO DELLA TERAPIA
• DUE DOSAGGI A DISTANZA DI
UN MESE E TRE MESI PER
VALUTARE LA RISPOSTA
• SE RESPONDER CONTROLLO A SEI
MESI E UN ANNO
QUANDO RICHIEDERE LA
GENOTIPIZZAZIONE
PRIMA DELLA AMMISSIONE
ALLA TERAPIA
HBV-DNA
SOGGETTI CON HbsAg POSITIVO DA OLTRE 6 MESI
SE HbeAg + o DELTA +
INDIPENDENTEMENTE DAI VALORI DI
ALT E HBV-DNA
VALUTAZIONE CLINICA DI AMMISSIONE
ALLA TERAPIA CON
LAMIVUDINA O ADEFOVIR
FOLLOW-UP
ALT E HBV-DNA OGNI 3-6 MESI
SE HbeAg – e DELTA SE HBV-DNA
>2000 UI/ml e/o
ALT ELEVATA
SE HBV-DNA
<2000 UI/ml e ALT
NORMALE
RIPETERE ALT e HBV-DNA DOPO
3 e 6 MESI
se ALT ELEVATE o
HBVDNA
> 2.000 UI/ml (anche 1
volta)
Se ALT sempre normali
e HBV DNA < 2.000
Continua follow-up dal
medico curante con ALT
ogni 12 mesi
QUANDO RICHIEDERE HIV RNA
DURANTE IL FOLLOW-UP DELLA
TERAPIA
IL TEST NON DEVE ESSERE
ESSERE UTILIZZATO COME
TEST DI SCREENING
GRAZIE PER L'ATTENZIONE