SCREENING IMMUNOLOGICO
DELLA INFEZIONE
TUBERCOLARE
DANIELA CAMPISI
S.C. MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
A.O. OSPEDALE NIGUARDA MILANO
[email protected]
VARESE 09 NOVEMBRE 2011
TUBERCOLOSI “I PERSONAGGI”
Robert Koch Medico e
Batteriologo tedesco nel XIX
secolo scoprì il bacillo agente
eziologico della Tubercolosi.
Vinse il premio Nobel nel 1905
Carlo Forlanini titolare
della cattedra di “Patologia
Speciale Medica” dell’
Università di Pavia
nel XIX secolo esegue il
primo pneumotorace
artificiale terapeutico “
collassoterapia”
Accettato a livello
internazionale nel 1913
Clemens von Pirquet medico austriaco nel 1907 sviluppò la prima prova diagnostica della
tubercolosi reazione “allergica” dopo applicazione di una goccia di tubercolina su una
scarificazione praticata sulla cute di soggetti che erano stati esposti al bacillo di Koch
PATOGENESI
Esposizione a
M.tuberculosis
(inalazione di
aerosol infetti)
MTB prolifera nello spazio
extracellulare e
vengono reclutate cellule infiammatorie
Ingestione da parte dei macrofagi
alveolari inattivi
INFEZIONE LATENTE E MALATTIA
INFEZIONE
le cellule T
controllano
l’infezione,
che rimane subclinica
nel 95% dei casi
Infezione latente: MTB
controllato dal sistema
immunitario per tutto il
resto della vita (tuttavia i
micobatteri rimangono vitali)
TB attiva e sintomatica:
I soggetti possono trasmettere la
malattia ad altri
L’INFEZIONE
I micobatteri rimangono vitali a livello intracellulare nei
macrofagi alveolari, dove si replicano.
La produzione di nuovi bacilli, insieme a detriti cellulari e
batterici inducono fattori chemiotattici dell’ospite e richiamano macrofagi
e linfociti circolanti
Infiltrazione di
Granulociti neutrofili
(sostituiti da)
Monociti – macrofagi
T linfociti
LA RISPOSTA CELLULO-MEDIATA
Un ruolo centrale è rivestito dai linfociti T helper che
producono IFN gamma e IL (2, 4, 5, 6, 10 e 12).
Le citochine attivano i macrofagi rendendoli in grado di
contrastare i micobatteri e limitare l’infezione primaria.
I macrofagi attivati possono fagocitare e uccidere i
micobatteri.
I linfociti T citotossici possono lisare cellule
fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione,
permettendo così la fagocitosi e l’uccisione dei
micobatteri da parte delle cellule fagocitiche attive
Classic Model of the Pathogenesis of TB
• Primary TB
Healthy Host
Infection contained in the Lung and/or Lymph Nodes
Progressive Pulmonary Disease
Extrapulmonary TB
Latent TB Infection (LTBI)
90% remain well
10% reactivate
Factors
Hematologic malignancy
Steroids
Anti TNF
ageing
•
Reactivation or Post-Primary TB
Comorbidity avert or occult
– Pulmonary in 85%
– Extrapulmonary in 15%
T Cells produce IFN-γγ in response to TB
infection
TUBERCOLOSI PRIMARIA - SECONDARIA
E DIAGNOSI DI INFEZIONE LATENTE
La prima infezione conferisce immunità acquisita nei confronti di M. Tuberculosis
nell’organismo rimangono batteri vitali ma in una specie di letargo metabolico anche
per decenni
Il persistente controllo dell’infezione avviene ad opera delle cellule immunocompetenti,
macrofagi attivati e linfociti T CD4 / CD8 della memoria
TUBERCOLOSI : malattia manifesta sia clinicamente che batteriologicamente
polmonare e/o extra-polmonare
INFEZIONE TUBERCOLARE LATENTE : subclinica senza segni batteriologici o
radiologici di malattia ( solitamente soggetti con intradermoreazione positiva che
possono essere contatti di soggetti con tubercolosi )
Nel caso in cui il complesso primario non venga completamente sterilizzato si può
osservare una riattivazione anche a distanza di tempo “tubercolosi secondaria”
Moltiplicazione batterica
Formazioni di lesioni granulomatose
Micobatteri in circolo
Diffusione dell’infezione in altre sedi polmonari e extrapolmonari
FATTORI GENETICI NELL’UOMO INFLUENZANO
LA SUCETTIBILITA’ ALL’INVEZIONE MALATTIA
TUBERCOLARE
Numerosi studi dimostrano l’associazione di Antigeni HLA con la suscettibilità alla
malattia a seconda delle diverse etnie
I geni coinvolti nella maggiore o minore suscettibilità sono diversamente distribuiti a
seconda delle regioni geografiche
In Nord Europa bassa endemia di alleli correlati
I geni coinvolti nella difesa contro le infezioni evolvono molto più rapidamente di altri
nel genoma umano probabilmente in seguito alla pressione esercitata dai contatti
continui con agenti e patogeni
Nelle regioni Asiatiche e in particolare in India Ag HLA-DR2 e DQ1
In Canada HLA-B8 in Egitto HLA-A2 e –B5 in Grecia – B27
Nelle popolazioni di colore del Nord America prevalgono HLA-B5 –B15 e DR5
I geni VDR (Vitamine D Receptor) e MBP (Mannose-Binding Protein) sono
associati alla suscettibilità o resistenza a TB polmonare perché essi influenzano la
risposta cellulomediata
Il gene NRAMP1 associato a una proteina macrofagica rinominato SCL11A1 è uno
dei più noti e studiato esso controlla la disponibilità di ioni ferro che rendono la
cellula maggiormente permissiva all’infezione sia in soggetti HIV POSITIVI e in
soggetti HIV negativi
DIAGNOSI IMMUNOLOGICA
DI INFEZIONE LATENTE
TEST CUTANEO ( TST ) CON PPD : intradermoreazione “ in vivo “
comparsa di infiltrato e lettura dopo 48/72 ore misurazione dell’alone con
cut off variabile per gruppi specifici
QUANTIFERON-TB Gold : test “ in vitro “ misura, con tecnica ELISA, la
quantità di Interferone gamma ( IFN ) rilasciato dai linfociti T in risposta a
stimolazione con antigeni tubercolari ESAT-6 e CFP-10 specifici per MTB e
assenti nel BCG
T-SPOT - TB : test “ in vitro “ misura il numero di linfociti T che producono
Interferone gamma con tecnica Elispot
Inserted Properly
Needle Too Deep
TUBERCULIN SKIN TEST
Iniezione intradermica di 0,1 di
derivato tubercolinico proteico
purificato (PPD) sulla superficie
volare dell’avambraccio metodo di
Mantoux
Needle Too Shallow
Latent TB and TST
The Tuberculin Skin Test: Major Limitations
TST & IGRAs - IFN-γγ release: rationale
TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL
2001 a oggi (1)
2001 1°IGRA approvato FDA con specificità tuttavia < a TST misurava la quantità di
gamma interferone rilasciato in risposta a PPD
Un nuovo IGRA misura la risposta a peptidi sintetici – proteine specifiche di
M. Tuberculosis “Early Secretory Antigenic Target-6” ESAT-6 , “ Culture Filtrate
Protein 10” CFP-10 (assenti nei ceppi BCG) esse sono presenti in tutti i ceppi di
M.Tuberculosis
Tuttavia ESAT-6 e CFP-10 sono presenti anche in M.Kansaii, M. szulgai e M. marinum si
possono avere risposte falsamente positive
2005 nuovo Quantiferon - TB Gold (QFT-GT) 2°IGRA approvato FDA : aliquote
separate di sangue vengono incubate con controllo e due combinazioni diverse di
ESAT-6 e CFP-10 , viene calcolata la differenza tra la concentrazione di gamma
interferon del campione stimolato con Ag e la concentrazione del CN quindi
esclusione di falsi positivi tramite cut off del Nil che deve essere < 0,7 UI / ml
2007 Quantiferon - TB Gold in tube:
1°provetta TB contiene una combinazione di 14 peptidi che coprono l’intera sequenza
aminoacidica di ESAT-6 e CFP-10 e una parte della sequenza TB7.7
2°provetta Nil contiene solo eparina Controllo Negativo
3°provetta MIT ( Mitogeno )contiene eparina destrosio e fitoemagglutinina verifica
l’immunocompetenza del soggetto
Dopo un’ incubazione a 37 °C di 16-24 ore nel plasma separato viene misurata la
concentrazione di gamma interferon con metodica ELISA
Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB > del 25-50% del Nil viene interpretata
come positivo piuttosto che indeterminato
Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB < 25% del Nil viene interpretata come
Indeterminata
TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL
2001 a oggi (2)
2008 T-SPOT diventa il 4°IGRA approvato FDA : le cellule mononucleate del
sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells ) PBMC vengono incubate
con sostanze controllo e con due combinazioni di peptidi ( intera sequenza di
ESAT-6 e di CFP-10 ) il principio del metodo è ELISpot che misura il > numero di
cellule secernenti gamma interefrone - spot- in ciascun pozzetto di reazione dopo
stimolazione antigenica specifica, rispetto alla media della risposta nel pozzetto
controllo ( Nil )
Una risposta borderline è considerata quella con 5,6,7 spot (N.B: la maggior parte
degli studi non statunitensi che hanno utilizzato T-SPOT per lo screening non
hanno usato il cut off indicato da FDA )
Sia QFT TB Goold che T-SPOT sono approvati come test di identificazione in vitro
di infezione da M. Tuberculosis ( compresa l’infezione da malattia attiva ) se
utilizzati congiuntamente a una valutazione del rischio a indagini radiologiche e
altre valutazioni mediche e diagnostiche
Ciascuno dei test QFT-TB Gold, T-Spot e TST misura aspetti diversi della risposta
immune e utilizza antigeni e criteri interpretativi differenti i risultati dei test
possono non essere intercambiabili .
Test differenti = risultati differenti
Interferon Gamma Release Assays (IGRAs)
QuantiFERON-TB Gold In-Tube
T-Spot.TB
by
by
www.cellestis.com
www.oxfordimmunotec.com
(AUS)
(UK)
Comparison of Methods
Collect blood in QuantiFERON tubes.
DAY 1
Incubate tubes at 37°C for 16-24 hours.
T-Spot.TB
Collect blood in specialized CPT tube.
Separate lymphocytes by centrifugation.
Collect PBMC.
Centrifuge PBMC.
Wash PBMC in pre-warmed media.
Centrifuge PBMC.
Wash PBMC in pre-warmed media.
Centrifuge PBMC.
Stain cells.
Count viable cells in haemocytometer.
Adjust concentration of PBMC.
Dispense PBMC and antigens.
T-Cell Xtend reagent option
QuantiFERON-TB Gold In-Tube
DAY 2
Incubate at 37°C with C02 for 16-20 hours.
Centrifuge QuantiFERON tubes.
Harvest plasma (automated / batched).
ELISA.
Read plate.
Obtain results using QuantiFERON Software.
ELISA.
Dry plate.
Count spots.
Analyze results.
Interpretation of IGRA Results
T-Spot.TB cut-off
> 6 spots according to manufacturer (Europe)
> 8 spots according to FDA (USA)
Antigens: ESAT-6, CFP-10
QFT-IT cut-off
> 0,35 IU/mL according to manufacturer
> 0,35 IU/mL confirmed by FDA
Antigens: ESAT-6, CFP-10, TB 7.7
Interpretation of IGRA Results
Mitogen Control & Indeterminate Results for QFT
Mitogen Control:
Indication of the immune status of the person being tested.
Controls for correct blood handling and storage before
incubation.
Indeterminate Result (no response to Mitogen):
Is meaningful
It does not indicate necessarily just a failed test.
CONCORDANZA TRA I TEST E
RIPRODUCIBILITA’
Varia ampiamente essendo influenzata da fattori quali :
prevalenza di infezione
proporzione di infezioni confermate microbiologicamente
stime di esposizione recente o remota
età ( Osservazione: in età avanzata TST potrebbe essere più sensibile degli IGRA )
etnia
pregressa vaccinazione con BCG
un recente TST
patologie concomitanti comprese altre infezioni da Micobatteri non tubercolari
condizioni di immunosoppressione inclusa l’infezione da HIV
Studi longitudinali hanno rivelato considerevoli fluttuazioni nel rilascio di
Interferon gamma in singoli pazienti : limiti della precisione ? O effettive
fluttuazioni ? Nuova infezione ? Conversione /Reversione ?
Problema dei valori di cut off IFN
Da un valore >0.50 UI/ml a < 0.20 True Reversion ( Pai et Al. 2009 )
Dati Sud Africani suggeriscono che un incremento del valore da < 0.35 UI/ml a
> di 0.70 UI/ml True Conversion
ACCURATEZZA SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’ DEI TEST
QFT T-Spot
Un limite della valutazione è la mancanza di un “GOLD STANDARD” per confermare la
diagnosi di LTBI ( infezione latente ) e di Tubercolosi attiva con esami colturali negativi
RICORDANDO CHE:
L’accuratezza è una misura della % di risultati di un test che sono effettivamente corretti e tiene
conto della specificità ( % di veri negativi che risultano negativi al test ) e della sensibilità ( la
proporzione di veri positivi che risultano positivi al test )
Le valutazioni di accuratezza sono molto difficoltose le stime delle performance dei test
possono variare a seconda delle popolazioni oggetto di studio, in conseguenza alle differenze di
prevalenza dell’infezione da M. tuberculosis e di Micobatteri non tubercolari di malnutrizione e
immunosoppressione
Essendo TST e IGRA test indiretti le valutazioni di sensibilità dei test attraverso le loro
performance tra gli individui affetti da tubercolosi attiva confermata da esami colturali
potrebbero non essere affidabili nella LTBI
Le differenze immunologiche che favoriscono la progressione dell’infezione a malattia possono
influenzare i test immunologici
Un trattamento può alterare la risposta immunologica e il risultato del test
Gli studi pubblicati utilizzano spesso criteri, cut off diversi da quelli FDA e anche misure
diverse del diametro dell’infiltrato
I valori di sensibilità e specificità stimate hanno un ampia variabilità
Nelle popolazioni a bassa probabilità di infezione la specificità del QFT TB può raggiungere il
99% vs quella del 85% di TST e del 88% di T-Spot la specificità di IGRA può anche essere
sovrapponibile confrontando soggetti vaccinati BCG e soggetti non vaccinati ( BCG utilizzato in
popolazioni con aumentato rischio di infezione )
Summary of National Guidelines Around the World
General testing approach
Countries
TST must be replaced by IGRA
Germany ,Swiss , Denmark( BCG-vaccinated
contacts/adults)
Either TST or IGRA can be used
USA
France
Australia (refugees)
Japan (QFT preferred in all groups except in children <5 y)
Denmark (child contacts)
Two-step approach: TST first, followed by IGRA
(either to improve specificity or sensitivity)
UK, Canada, Italy, Spain, Australia, Slovakia,
Germany[contacts], Swiss[contacts], Netherlands[contacts,
immigrants], Norway, Korea[contacts]
Madhu Pai
Meta-Analysis Key findings:
IGRA and TST Sensitivity and Specificity
SPECIFICITY
QFT:
•
5 published studies involving 513 subjects
•
4 tested QFT positive
•
Specificity (509/513)
99.2%
T-Spot.TB*:
•
3 published studies involving 255 subjects
•
35 tested T-Spot.TB positive
•
Specificity (220/255)
86.3%
TST
•
All Studies
59.0%
* Manufacturer spots cut-off
Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009
Meta-Analysis Key findings:
IGRA and TST Sensitivity and Specificity
SENSITIVITY
QFT:
•
All studies (n=19; 988 patients)
81.0%
•
Developed country studies (n=13; 619 patients )
84.5%
•
Developing country studies (n=6; 369 patients) 74.3%
T-Spot.TB*:
•
All studies (n=17; 837 patients)
87.5%
•
Developed country studies (n=15; 812 patients) 88.5%
•
Developing country studies (n=2; 25 patients)
52.0%
Significantly different, P<0.001
TST:
•
All studies (n=25; 1238 patients)
69.9%
•
Developed country studies (n=23; 1184 patients) 71.5%
•
Developing country studies (n=2; 54 patients
35.2%
* Manufacturer spots cut-off
Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009
LE DOMANDE A CUI RISPONDERE IN FUTURO
Gli IGRA sono in grado di predire una futura tubercolosi attiva?
Quale il significato dei risultati discordanti?
Gli IGRA hanno performance diverse nei bambini in confronto agli adulti (Mitogeno –
età < 5 anni ), nei soggetti HIV positivi rispetto ai negativi, in soggetti con infezione
recente rispetto a soggetti con infezione acquisita anni prima, e in soggetti con
infezione latente rispetto a pazienti con infezione attiva?
Come spiegare risultati differenti dei test TST QFT T-Spot eseguiti simultaneamente ?
Potranno essere migliorate sensibilità e specificità dei test IGRA modificando
lametodologia e adottando criteri di interpretazione diversi o aggiungendo ulteriori
antigeni ?
Quale il migliore approccio per stabilire i cut off di interpretazione degli IGRA incluse
situazioni in cui i valori di Nil sono elevati o i valori di Mitogeno sono bassi ?
L’introduzione del “borderline “ potrebbe migliorare l’accuratezza
Qual’ è il significato clinico della conversione/regressione ?
Come monitorare la qualità degli IGRA ( preanalitica: ritardo dell’incubazione oltre le 12
ore > n°indeterminati danneggia l’interpretazione neg/pos particolarmente importante
nei campioni pediatrici) ?
Esiste correlazione tra conta linfocitaria e produzione di interferone (HIV positivi ) ?
In che modo fattori genetici del microrganismo o dell’ospite interferiscono con i test
IGRA ?
Quali effetti può produrre la terapia sui test IGRA ?
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO Stop TB
Department ) RACOMANDATION 2011 IN LOW AND MIDDLE
INCOME COUNTRIES
IGRA non devono essere usati in questi paesi per la diagnosi di TB
polmonare o extra-polmonare sia in soggetti HIV negativi che HIV
positivi per evitare il trattamento non necessario nei falsi positivi
data la bassa specificità dei test IGRA e TST in questo contesto
IGRA non possono sostituire TST per la diagnosi di infezione
latente o attiva nei bambini e nei soggetti HIV positivi ( n°CD4 <
200 correla con il decremento di test positi del 27% con T-Spot e
del 35 % con TST )
IGRA non possono sostituire TST nello screening dei lavoratori
impiegati in assistenza a soggetti con infezione
IGRA non possono sotituire TST nello screening dell’infezione
latente nei contatti sia adulti che pediatrici o in eventi epidemici
IGRA e valori predittivi IGRA e TST non possono essere utilizzati
per identificare individui a rischio di progressione di TB attiva
RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L’UTILIZZO
DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010
POSSONO ESSERE UTLIZZATI PER SCOPI DI SORVEGLIANZA SANITARIA O PER IDENTIFICARE SOGGETTI CHE
TRARREBBERO BENEFICIO DAL TRATTAMENTO
DOVREBBERO ESSERE ESEGUITI E INTERPRETATI SECONDO PROTOCOLLI PRESTABILITI
DOVREBBERO ESSERE RIPORTATI SIA L’INTERPRETAZIONE QUALITATIVA CHE IL DATO QUANTITATI VO
INSIEME A CRITERI DI INTERPRETAZIONE DEL DATO
DOVREBBE ESSERE SCRUPOLOSAMENTE TENUTA SOTTO CONTROLLO LA FASE PREANALITICA
CONSIDERARE LE CARATTERISTICHE DELLA POLAZIONE DA SCREENARE
ANALOGAMENTE AL TST GLI IGRA NON DOVREBBERO ESSERE UTILIZZATI PER TESTARE SOGGETTI CON
BASSO RISCHIO DI INFEZIONE O PROGRESSIONE A TUBERCOLOSI ATTIVA
ANCHE USANDO UN UN TEST CON SPECIFICITA’ PROSSIMA AL 99 % QUANDO LA PREVALENZA
E’ < 1% LA PROBABILITA’ DI RISULTAT FALSAMENTE POSITIVI E’ MOLTO ELEVATA
LA SCELTA DEL TEST PIU’ ADEGUATO O DELLA COMBINAZIONE DI PIU’ TEST DOVREBBE ESSERE BASATA
SULLE RAGIONI E SUL CONTESTOIN CUI VENGONO ESEGUITI
RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L’UTILIZZO
DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010 II parte
1.
2.
3.
4.
IGRA è preferibile ma TST è accettabile : in persone senza fissa dimora o che fanno uso di
stupefacienti – in soggetti vaccinati BCG per aumentare la specificità e l’accettabilità di un trattamento
per LTBI
TST è preferibile ma un IGRA è accettabile : in bambini di età < 5 anni ( alcuni ricercatori suggeriscono
di usarli entrambi ) American Academy of Pediatrics
Uso indifferente di uno dei due : screening dei contatti risultati negativi prima di 8 settimane
dall’esposizione ( ripetizione a 8-10 settimane )
screening di soggetti a rischio di esposizione occupazionale con attenzione particolare a
CONVERSIONE-REVERSIONE
Conversione di TST = negativo vs positivo infiltrato>= 10 mm entro 2 anni
Conversione di IGRA = negativo vs positivo entro 2 anni ?
non dimostrata associazione tra IGRA e rischio di progressione
Utilizzare sia IGRA che TST : in bambini < 5 anni e soggetti HIV positivi con rischio aumentato di
infezione, progressione e di esito infausto – quando i valori misurati di un primo test sono
anomali es. valore di Nil > di quanto normalmente osservato nella popolazione oggetto del test
( > 0.7 UI/ml ) – la risposta al Mitogeno del QFT è < 0.5 UI/ml o il numero di spot nel pozzetto
stimolato con mitogeno del di T-Spot è < 20 per la ripetizione di un test IGRA è preferibile un
secondo campione
L’esperienza del nostro
laboratorio
CONCLUSIONI
Le conversioni e reversioni esistono “wait and see”
Un risultato Borderline va ripetuto a 1 mese 2 mesi 6 mesi 1 anno
Negli esposti il rischio non è pari a zero se TST ha un diametro < 5
mm
E’ possibile avere TST positivo QFT negativo oppure TST negativo e
QFT positivo
Non è consigliato l’uso della quantizzazione degli IGRA per il
monitoraggio della terapia
Speranza per un futuro vaccino
Ricercatori americani dalla Albert Einstein college of Medicine, della
Howard Hughes Medical Institute e della Colorado State University
hanno pubblicato su Online Nature Medicine i risultati incoraggianti di
uno studio effettuato sul topo manipolando il gene “ESX-3” correlato
con la risposta immunitaria cellulomediata verso M.smegmatis letale
per questo animale
RINGRAZIAMENTI
VIRGINIA
MIA FIGLIA CHE A SOLI UNDICI
ANNI HA COLLABORATO ALLA
REALIZZAZIONE GRAFICA
DELLA RELAZIONE