Diagnosi immunologica di
infezione acuta e latente
Myco-09 corso di micobatteriologia
avanzata
DM Cirillo, HSR Milano
IGRA
Interferon Gamma Release Assay
• TEORIA: i linfociti T precedentemente
sensibilizzati con antigeni tubercolari
producono alte concentrazioni di IFN-gamma
quando riesposti allo stesso antigene.
IGRA
Cellestis QuantiFERON-TB Gold In-Tube
Oxford Immunotec
T-SPOT.TB
Antigeni specifici
• ESAT6
• CFP10
• Presenti in tutti gli organismi del MTB
complex
• ASSENTI nel BCG (RD1)
• ASSENTI nella maggior parte dei
micobatteri non-tubercolari
EVIDENZE
•
•
Specificità TST alta in individui non vaccinati, bassa o variabile nei
vaccinati
IGRAs alta specificità (QFT>Tspot)
– Specificità >TST
– Non modificati da BCG
• Molto utili in settings in cui la vaccinazione viene ripetuta dopo la nascita
• Sensibilità degli IGRAs variabile rispetto a TST e
popolazione dipendente:
– QFT=TST
– QFT> in popolazioni a bassa incidenza rispetto alle popolazioni ad
alta incidenza
– Tspot > sensibilità rispetto a a QTF e TST
• In popolazionei a bassa incidenza correla meglio con i
livelli di esposizione
IGRA Tests: specificità
Pai M, Zwerling A, Menzies D. Ann Int Med 2008; 149:
177-84
• Review sistematica e aggiornata
• Eccellente specificità del QFT (meno dati disponibili
sul T-spot commerciale)
• Alta specificità del TST in soggetti non-BCG vaccinati
ma bassa e variabile in soggetti BCG vaccinati
• Sensibilità del TST e degli IGRA test non consistente
tra test e tra popolazioni (differenti)
?? T-spot più sensibile del QFT/TST
LTBI: specificità e
sensibilità (Pai 2006)
Sensibilità 75%-97%
Specificità 92%-98%
IGRA e TB attiva
QFT sensibilita TB attiva 55-88%
TST 33-90%
elispot 83-95%
IGRA e EP-TB
• Song 2008
QFT-G 48 EP-TB casi confermati (110
totali)
Sensibilità 69%
Specificità 87%
Non può essere utilizzato come unico
criterio per la diagnosi di EP-TB
T SPOT TB: peptidi utilizzati
17 peptidi
ESAT-6
18 peptidi
CFP-10
QF-TB Gold: peptidi utilizzati
6 peptidi
CFP-10
1 peptide
TB 7.7
7 peptidi
ESAT-6
T-SPOT.TB
– Utilizza gli antigeni TBC-specifici ESAT-6 e CFP10
– Cellule mononucleate vengono estratte da 8 cc di
sangue (PBMC), isolate ed esposte agli antigeni
TBC-specifici. Dopo incubazione “overnight”, si
“contano” i linfociti T che producono IFN-γ.
– I casi di indeterminati non sono frequenti; è un test
definito “laboratory intensive”.
QuantiFERON-TB Gold InTube
– 1ml di sangue intero viene esposto agli
antigeni ESAT6, CFP10 and TB7.7, al
controllo negativo (nulla) e positivo
(mitogeno) in tre diverse provette
– Dopo incubazione “overnight” il plasma
viene estratto e la concentrazione di IFN-γ
determinata mediante ELISA.
– Cut-off arbitrario per determinare i risultati
positivi
TST e IGRA
IGRA - TST
TEST
TST
IGRA
VANTAGGI
SVANTAGGI
• Molto studiato
• Trials clinici basati sui
risultati del TST
• Economico
• 2 visite
• Specificità inferiore
(BCG)
• Sensibilità inferiore in
immunocompromessi
• operatore dipendente
• Alta specificità
• Simile sensibilità
• 1 visita
• MOLTI DATI
CONTRASTANTI
•Costi ($35-$120 US)
•Risultati indeterminati
Risposta CD4 specifica
Se un individuo è esposto alla TBC
• Le cellule CD4 dovrebbero reagire a
ESAT6 e CFP10
• Queste producono IFN-γ
• Che può essere misurato
- nel siero
- oppure colorando le cellule reattive
All Theories of
memory cell
development suggest
memory T cell
formation is a
function of
withdrawal of antigen
(Kaech et al 2002)
Effector cells are detected
by IFN- tests
• Effector cells produce IFN- within a few hours of
stimulation
• Memory cells must proliferate, and take >24 hours before
significant IFN- production
• Most in vitro IFN-  tests incubate for <24 hours
The IFN- is from effector T cells
®
QuantiFERON -Gold In Tube
Fase 1 – Raccolta del sangue
Nil
TBC
Mitogeno
Il plasma si conserva
per massimo 8
settimane.a 2-8°C,
per anni a -20°C
3x1mL campioni sangue
Incubazione a 37ºC
per16-24 ore
Centrifugare per 5
min.
 Opzione 1: Trasporto dei campioni in laboratorio entro 16 ore dalla raccolta,
prima dell’incubazione.
 Opzione 2: Trasporto dei campioni in laboratorio entro 3 giorni
dall’incubazione.
 Possibilità di raggruppare i campioni.
®
QuantiFERON -Gold In Tube
Fase 2 – Interferone-γ ELISA
Aggiunta di
plasma e
coniugato
Incubazione per
120min. a
temperatura
ambiente
Lavaggio e
aggiunta di
substrato
Aggiunta
della.stopsolution e
lettura
dell’assorbanza
 “Standard” ELISA
 User-friendly software fornito gratuitamente da Cellestis
 Non necessita di nuove apparecchiature
Calcolo e
stampa dei
risultati
Step 1 – Preparazione delle cellule
• Sangue raccolto in tubi
Vacutainer CPT™
• Centrifugazione dei tubi
• Rimozione dell’anello
linfocitario
• Lavaggio e conta cellule
• Cellule trasferite su piastra a
96 pozzetti
• Aggiunta degli antigeni nei
pozzetti
• Incubazione overnight
Step 2 – Formazione degli spot
• Lavaggio della piastra
• Aggiunta di soluzione
coniugato per 60 minuti
• Lavaggio della piastra
• Aggiunta del substrato;
formazione di spot dopo 7
minuti
• Lavaggio ed asciugatura
della piastra
Neg.
Pos.
CDC
• Nelle “Guidelines for the Investigation of
Contacts of Persons with Infectious
Tuberculosis” (CDC Atlanta, 2005) si
suggerisce che il QFT-G assay
POTREBBE essere usato al posto del
TST in tutti i casi (Dr. Vernon)
NICE
• “National Institute for Health and
Clinical Excellence TB guidelines”
(Regno Unito, 2006) si consiglia uno
screening iniziale con TST seguito da
un test IGRA (se disponibile) per i casi
TST+, oppure (se il risultato del TST
non è affidabile) per la conferma del
TST.
2007 Canadian Guidelines
– IGRAs are recommended for:
4. Contacts of active TB
– Close contacts (HIGH RISK) can get both TST and
IGRA and if either is positive, be treated for LTBI
– Casual contacts (LOW RISK) can have IGRA
confirmation if TST positive to verify infection vs BCG or
MOTT
5. Immunocompromised
– TST first, if negative do IGRA and if IGRA positive treat
as LTBI
6. Low risk people who are TST positive
– Do an IGRA, if positive consider as LTBI
2007 Canadian Guidelines
– IGRAs not recommended for:
1. Serial testing
2. Children
3. Immigrant screening
7. Diagnosing active TB
2007 Canadian Guidelines
DIAGNOSIS OF ACTIVE TB DISEASE
– IGRA sensitivity in active TB has been found to
be comparable to the sensitivity of TST (up to
30% negative). This reflects the diminished
immune response in patients with active TB
particularly in those with more advanced
disease, malnutrition or older age.
– Therefore, IGRAs are NOT recommended for
the diagnosis of active TB.
Screening della popolazione
• NESSUNA strategia è costo efficace se
l’incidenza della LTBI < 10%.
• Con incidenza della LTBI del 10-40%, il test
della tubercolina a 2-step, seguito da un test
IGRA sui pazienti positivi alla tubercolina, è
cost-effective.
• L’uso del solo IGRA test è costo efficace
SOLO SE l’incidenza della LTBI è ≥ 40%.
Test nei bambini
QuickTime™ and a
decompressor
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A total of 243 children (median age: 18 months) were recruited,88% had
interpretable T-SPOT.TB results. Children >12 months of age were more likely
than younger children to have positive T-SPOT.TB resuts TSTs were unaffected
by age.
CONCLUSIONS. For young children presenting in a community setting after
exposure to tuberculosis or with symptoms suggesting tuberculosis, T-SPOT.TB
cannot be used to exclude active disease. The sensitivity of this assay may be
impaired for very young children.
Test nei bambini
QuickTime™ and a
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Data for 207 children with valid tuberculin skin test and QuantiFERON-TB Gold In-Tube test results:
excellent correlation between negative tuberculin skin test results and negative QuantiFERON-TB Gold In-Tube
only 23% of children with positive tuberculin skin test results had positive QuantiFERON-TB Gold In-Tube
Positive QuantiFERON-TB Gold In-Tube test results were associated with increased likelihood of M tuberculosis
exposure.
Younger children produced lower interferon levels
Performance characteristics were similar across all age groups.
CONCLUSION
The QuantiFERON-TB Gold In-Tube test is a specific test for M tuberculosis exposure in children
performance characteristics similar to those for adultsin regions with low levels of endemic disease.
Concerns about test sensitivity, especially for young children will require additional prospective
long-term evaluation.
Pediatrics 2009;123:30–37
IGRA e HIV
• Stephan et al AIDS 2008
Scopo del lavoro: valutazione incidenza e fattori
di rischio in HIV+ e pragone tra i test
286 pazienti in paese a bassa prevalenza
Entrambi IGRA più sensibili di TST ma meno
sensibili che in non HIV
Bassa concordanza tre i test
Tspot indipendente dalla conta di CD4
Alcune questioni fondamentali
ancora poco chiare
• Qual è il valore predittivo degli IGRA nello
sviluppo di una TBC attiva?
• Qual è l’interpretazione delle conversioni e
delle reversioni del test IGRA?
• Qual è la prognosi di una conversione IGRA?
• Possiamo utilizzare i livelli di IFN-gamma per
diagnosticare la malattia?
• Può un TST “boosterare” successive risposte
IGRA?
IGRA Tests PPV?
• Menzies et al. Meta-analysis: New test for the
diagnosis of LTBI: areas of uncertainty and
recommendations for research. Ann Int Med
2007:146:340-54
• I nuovi test IGRA si rivelano un’importante
promessa e posseggono un eccellente
specificità. Ulteriori studi sono necessari per
una più accurata valutazione delle
performance in popolazioni ad alto rischio e
nel testing seriale. Studi longitudinali sono
necessari per definire il valore predittivo degli
IGRA test.
NPV
• Il Valore Predittivo Negativo di un test
negativo non è ancora stato definito né
in setting ad alta prevalenza né in quelli
a bassa prevalenza
IGRA e anti TNF alfa
• Raccomandazioni per lo screening della TBC
prima di una terapia anti-TNF-alfa, in Svizzera:
– Swiss Med Wkly 2007; 137:621-622. (November 3,
2007) (Official journal of the Swiss ID, GIM and
Resp. Societies)
– Screening raccomandato utilizzando la storia del
paziente, e IGRA test invece del TST.
– “Indeterminato” significa utilizzare solo la storia
del paziente e la RX torace, con approccio
conservativo.
? Ruolo degli IGRA pre-TNF
Dati solo da alcune coorti
Pratt A et al. Rheumatology 2007
• 101 pazienti AR, 99% bianchi
• Età media 55; 78.5% BCG vaccinati
• 7 QFT+ ; 84 QTF- ; 11 indeterminati
• 6-30 mesi di FU (media 18.3)
• No TBC (ma..)
IGRA Testing pre TNF
• Incidenza TBC, bianchi, 50 anni = 5/100.000
• Incidenza LTBI, bianchi, 50 anni =
50/100.000
• Perciò: veri positivi = 1/2.000
• Numero di test IGRA per veri +vi = 2.000
• QFT (a £35)
= £70.000
• T-Spot (a £100)
= £200.000
IGRA testing pre TNF
• In gruppi ad alto rischio (Asia meridionale
/neri-Africani, nati all’estero)
• Circa 200/100.000 malati
• 2.000/100.000 LTBI
• 50 test per individuare 1 vero positivo
• £1.750 QFT, oppure £5.000 T-spot
• Ma il NPV di un test negativo NON È
ANCORA NOTO
Effetto della vaccinazione con BCG
sul TST
• Analisi di 24 studi con N = 240,243 soggetti
• Quando il BCG è somministrato nell’infanzia,
6% falsi-positivi nei risultati del TST a causa del
BCG
• Quando il BCG è somministrato dopo l’infanzia,
40% falsi-positivi a causa del BCG
Vantaggi degli IGRA’s nei test
seriali
• I test IGRA offrono alcuni vantaggi nei
test seriali :
– una più alta specificità
– mancanza di effetti dovuti al BCG
– numero inferiore di visite richieste
– non necessita di un protocollo a 2-step
– il boosting non rappresenta un problema
Prima che gli IGRA possano essere usati
efficacemente nel test seriale vi sono alcune
domande a cui è necessario rispondere
1.
2.
3.
4.
5.
Qual è la riproducibilità della risposta dei linfociti T
nel tempo
Cos’è una “reversione” IGRA e qual è il valore
soglia per definire una reversione?
Cos’è una “conversione” IGRA e qual è il valore
soglia per definire una conversione?
Qual è l’associazione tra una conversione IGRA e il
rischio di progressione a malattia?
Il trattamento dei casi di conversione IGRA riduce il
rischio di progressione a malattia?
Cosa sappiamo della riproducibilità della
risposta dei linfociti T nel tempo?
• I dati sono limitati
• Se ulteriori studi confermeranno queste
scoperte:
– Se i risultati IGRA intorno al cut-off mostrano una
maggiore “oscillazione” allora ciò ha implicazioni
sulla reversione e conversione
• Gli IGRAs sono troppo “dinamici” da compromettere la
stabilità nei test seriali?
• Può la natura “dinamica” spiegare gli alti tassi di
reversione?
• Il fatto che i casi IGRA-positivi in pratica non sono
ritestati, può essere rilevante?
– Nella pratica clinica, i casi TST-/IGRA+ dovrebbero essere
ritestati?
Riproducibilità del QTBgoldIT
Cosa sappiamo della reversione
IGRA?
•
•
Le reversioni sono ben documentate
Le reversioni sono meno probabili quando i risultati baseline sono
doppi-positivi (TST+/IGRA+)
–
•
Le reversioni sono più probabili quando i i livelli basali sono discordanti
(TST-/IGRA+)
–
–
–
•
Nei doppi-positivi si attende una marcata risposta IFN-gamma
I risultati discordanti sono in genere risposte deboli
Bassi livelli di IFN- gamma are sono vicini al cut-off
variazioni non-specifiche intorno al cut-off possono portare a reversione
Quindi, perché le reversioni avvengono?
1. Alcune reversioni potrebbero riflettere la scomparsa dell’infezione
2. Alcune reversioni potrebbero semplicemente essere dovute a variazioni
biologiche (“oscillazione”) negli IGRA-positivi, e noi selezioniamo pazienti
che si trovano nella fase di diminuzione della risposta all’infezione
3. Alcune reversioni potrebbero essere dovute a variazioni nelle procedure di
laboratorio (manipolazione del campione, lavaggio nell’ELISA, etc.)
Conversioni
• Domande chiave:
– Quale aumento nella concentrazione di
IFN-gamma è biologicamente indicativo di
una nuova infezione, e quanto è dovuto al
solo test o è oscillazione biologica?
– Dovremmo usare il cut-off diagnostico
anche per le conversioni?
– Qual è il miglior modo per stabilire i cutoff?
Cosa sappiamo delle
conversioni IGRA?
• Le reversioni sono ben documentate
• A seconda del cut-off usato per la conversione, i
livelli variano molto!
• Se per definire le conversioni si usa un semplice cutoff negativo-positivo, allora le conversioni saranno
maggiori con IGRA che con TST (Pai et al, 2006; Pai
et al, 2009 & Corbett et al, 2006)
– Ciò può indicare una maggiore sensibilità per le
“conversioni” (non necessariamente per “diagnosi”)
– Ad ogni modo, parte dei maggiori livelli di conversioni è
probabilmente dovuta a variazioni minori non-specifiche
introno al cut-off (Pai et al, AJRCCM 2006; Pai et al. IJTLD
2009)
– Un cut-off più stringente per la conversione potrebbe aiutare
ad evitare di interpretare variazioni minori come conversioni
Associazione tra i livelli di IFNgamma e il rischio di progressione a
malattia
• Evidenza diretta limitata nell’uomo
– La correlazione con la carica batterica e la
patologia può essere solo dedotta
• Però, è stato suggerito che il forte incremento
nella risposta linfocitaria T agli antigeni RD1
potrebbe essere predittivo di TBC attiva
– Questo dev’essere ancora confermato sebbene
siano disponibili dati verosimili e supportati da
alcuni dati indiretti
Effetto Booster del TST su
IGRA’s
• Il prelievo va effettuato entro tre giorni
dal TST
Riflessioni conclusive
• NON approvato per la diagnosi o alla
gestione di casi di malattia attiva
• NON differenzia i casi di malattia da quelli di
infezione.
• Falsi Neg. nei casi di malattia attiva
• Utilità NON dimostrata nel monitoraggio della
terapia
• Altri studi su coorti di pazienti sono necessari
per definire PPV e NPV
• Mancano dati sui bambini inferiori a 2 anni
Riflessioni conclusive
• I test basati su linfociti T sono dinamici e inclini a conversioni e
reversioni
• Dovremo definire una soglia per la conversione, basata su dati
empirici e studi di riproducibilità
• La prognosi delle conversioni e reversioni IGRA dovrà essere
determinata
• Soggetti con marcato aumento in risposte IFN-gamma hanno
maggiore probabilità di progredire verso la malattia (questo
potrebbe non essere vero per la riattivazione della TBC)
• Nei soggetti immonodepressi sensibilità maggiore rispetto al TST
con Tspot meno influenzato dal numero di linfociti
• Studi di coorte sono necessari per rispondere a questioni
fondamentali e fornire dati che aiutino a interpretare i risultati degli
IGRA test seriali
• Giustificato economicamente il test a 2
step, come indicato nel NICE per lo
screening dei contatti e generale
• ‘Esclude’ i falsi positivi dovuti a BCG
and MNT
• Economicamente non giustificato l’uso
di pre-TNF Rx in popolazioni ad
incidenza molto bassa