BEIA Syphilis IgM Capture
22565
Edizione
20/04/2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00541
Pag. 1 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Syphilis IgM Capture è un test immunoenzimatico
qualitativo (ELISA) per la determinazione nel siero degli anticorpi
di classe IgM specifici verso il Treponema pallidum.
SIGNIFICATO CLINICO
La ricerca delle IgM anti-Treponema pallidum in parallelo al test per le
IgG specifiche costituisce un parametro utile per la diagnosi sierologica
della sifilide primaria, quella in fase avanzata non curata, per il
monitoraggio della terapia, per la diagnosi dell’infezione congenita e la
definizione dello stadio della malattia. La ricerca degli anticorpi di classe
IgM anti-Treponema pallidum, viene solitamente eseguita con test di
immunofluorescenza con adsorbimento (FTA-ABS-M). Tale test è però
affetto da soggettività nell’interpretazione dei risultati e da scarsa
affidabilità, in particolar modo se viene effettuato su siero non
frazionato.In questo ultimo caso si possono avere risultati falsi positivi
causati da fattori reumatoidi (RF), oppure una riduzione della sensibilità
causata dalla competizione delle IgG anti-Treponema pallidum presenti
in concentrazioni elevate. Il kit BEIA Syphilis IgM Capture è un metodo
d’analisi automatizzabile per la determinazione delle IgM specifiche antiTreponema pallidum, dotato di maggiore sensibilità e specificità rispetto
ad altre tecniche di uso routinario, che consente inoltre, grazie alla
tecnologia “immunocapture” di superare le problematiche sopracitate
dell’FTA-ABS.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Syphilis IgM Capture è un dosaggio ELISA basato
sulla tecnica “a cattura”. I campioni da esaminare vengono incubati
nei micropozzetti sensibilizzati con anticorpi monoclonali anti-IgM
umane. Le IgM del campione vengono catturate dagli anticorpi
presenti sulla fase solida.
Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non
legati alla fase solida, la presenza di IgM anti- Treponema pallidum
viene rilevata attraverso il legame con una miscela di proteine
ricombinanti purificate del T.pallidum, coniugata con perossidasi.
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Dopo allontanamento del complesso non legato viene aggiunto il
Substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla fase
solida, sviluppa una colorazione azzurra. L’aggiunta di una
soluzione di acido solforico 0,3 M blocca la reazione e provoca il
viraggio del colore dall’azzurro al giallo. La densità ottica letta a
450/620 è direttamente proporzionale alla quantità di IgM specifiche
presenti nel campione in esame.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CONTROL
-
B
Controllo Negativo
1 x 1.6 mL
CAL
CO
C
Calibratore Cut-Off
1 x 2.5 mL
CONTROL
+
D
Controlo Positivo
1 x 1.6 mL
E
Diluente Campioni
1 x 100 mL
F
Coniugato
1 x 15 mL
DIL
SPE
CONJ
BUF
WASH 10X
G
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
H
Substrato-TMB
1 x 15 mL
K
Soluzione Stoppante
1 x 15 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con anticorpi monoclonali anti-IgM umane, in
busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella
busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in pozzetti singoli.
Controllo Negativo
Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-T.pallidum. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
Calibratore Cut-off
Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgM anti-T.
pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all’uso.
Pag. 3 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
D.
E.
F.
G.
H.
I.
Controllo Positivo
Siero umano positivo per anticorpi IgM anti-T.pallidum. Contiene
0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso.
Diluente Campioni
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine 10% p/v. Contiene
0,09% di sodio azide come conservante e colorante (metilarancio).
Reagente pronto all'uso
Coniugato
Soluzione contenente proteine ricombinati del T. pallidum marcate
con perossidasi. Contiene fenolo 0.05% e Bronidox 0.02%. Reagente
pronto all’uso.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 10 volte contenente
Brij 0.5%. Vedi Preparazione dei reagenti .
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB e stabilizzanti. Reagente pronto
all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 0.3 mol/L di acido solforico.
Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza del kit riportata
sull’ etichetta. I reagenti hanno una stabilità limitata dopo apertura
e/o preparazione:
Micropiastra
Controlli
Coniugato
Substrato
Diluente Campioni
Tampone di Lavaggio
Soluzione stoppante:
5 settimane 2-8°C in busta di polietilene
5 settimane 2-8°C
5 settimane 2-8°C
Fino data scadenza a 2-8°C, 1 sett. a 15-30°C al buio
Fino data scadenza a 2-8°C
Ricostistuito 2 settimane a 2-8°C, 5 giorni a 15-30°C.
Fino data scadenza a 2-8°C
Pag. 4 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
REAGENTI INTERCAMBIABILI
I Diluente Campioni, il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la
Soluzione Stoppante ed il Controllo negativo sono intercambiabili tra
lotti diversi. Tutti i reattivi del kit NON sono intercambiabili con gli
altri kit della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI
 Incubatore a 37°C
 Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
 Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
 Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µL.
 Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
 Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI







Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei pozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Pag. 5 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013


Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio deve essere eseguito su siero. Non è possibile utilizzare
il Plasma. Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i
campioni possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario
aliquotare i campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti
scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni
lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere diluiti 1:51
con il Diluente Campioni BEIA Syphilis IgM Capture prima del
dosaggio
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Tampone di Lavaggio BEIA Syphilis IgM Capture
Diluire il Tampone di Lavaggio (10x) 1:10 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si
possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano
portando il reagente a 37°C prima della diluizione. Si raccomanda di
diluire la quantità di tampone necessaria.
Pag. 6 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti a 1825°C).
1.
2.
3.
4.
Diluire (1:51) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA
Syphilis IgM Capture System (esempio 10 µL di siero e 500 µL di
Diluente Campioni . Agitare su Vortex.
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del
numero di campioni in esame, del Calibratore Cut-off e dei Controlli
(vedi “Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la busta.
Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame
prediluito, del Calibratore Cut-off e dei Controlli.
Coprire la micropiastra con un foglio adesivo ed incubare a
temperatura di 37°C per 45 minuti.
5.
Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di coniugato.
7. Coprire la piastra con un foglio adesivo ed incubare a
temperatura di 37°C per 45 minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
Pag. 7 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :



La DO del Controllo Positivo dev’essere  1.5 la DO del Calibratore
Cut-off.
il rapporto tra la DO del Controllo Negativo e la DO del Calibratore
Cut-off dev’essere < 0.6
La DO del Controllo Cut-off dev’essere  0.2 a 450 nm e > 0,16 a
450/620 nm.
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione
Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare
procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati
concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non
conformità.
CALCOLO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
= _____________________________________________
DO Calibratore Cut-off
Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore
medio di densità ottica (DO).
Index anticorpale (I.A.)
Pag. 8 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
Qualitativo
IA
INTERPRETAZIONE
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti- T.
> 1.2
pallidum
< 0.8
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti- T.
pallidum
0.8 1.2
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare
DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe
IgM anti- T. pallidum
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgM. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. Dati
clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente con il conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; con il confronto con un test di
riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
Pag. 9 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
SENSIBILITÀ & SPECIFICTA’
Sono stati testati 180 campioni di cui 5 sieri avevano diagnosi
accertata di infezione da Treponema pallidum. Tutti i sieri sono
stati testati con altro metodo immunoenzimatico e si è avuta una
concordanza del 100% tra i due metodi sia sui campioni negativi che
positivi. La sensibilità e la specificità risultano essere del 100 %.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 11
mg/dL di bilirubina, fino a 1048 UI/mL di fattore reumatoide, fino a
1281 mg/dl di trigliceridi.
L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque
sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
ottenendo i seguenti risulatati:
Intra-saggio
N
D.O
CV%
TPM1
24
0.22
19
TPM2
24
0.5
5
TPM3
24
1.45
5
CUT-OFF
12
0.29
2
CP
12
2.49
4
Inter-saggio
INDEX
CAMPIONE
TMP3
TMP2
TMP1
CP
MEDIA
CV%
4.1
1.5
0.7
7.5
11
16
16
8
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgM specifiche.
Pag. 10 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA

Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni
previste per l'esecuzione del test.

Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.

Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.

Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando
guanti monouso e camici.

Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.

Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di
lavoro eventualmente contaminate.

Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in
appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme
vigenti.

Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e
trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV. Poiché
nessun metodo può garantire che tali derivati non possano
trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di
manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un
medico.
Pag. 11 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
SCHEMA DEL DOSAGGIO


Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:51 con il Diluente Campioni BEIA Syphilis
IgM Capture
Dispensare:

100 L di Controllo Negativo in singolo
100 L di Calibratore Cut-off in doppio
100 L di Controllo Positivo in singolo
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,









Incubare 45 minuti a 37°C
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato-HRP
Incubare 45 minuti a 37°C
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
CN
CC
CC
CP
P1
P2
P3
P4
2
P5
…
…
…
..
..
..
3
4
5
6
..
Pag. 12 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
BEIA Syphlis IgM Capture
22565
Version
20/04/2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
INTRODUCTION
The BEIA Syphilis IgM Capture kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgM
antibodies to Treponema pallidum, in human seru.
CLINICAL RELEVANCE
The determination of IgM anti-Treponema pallidum in association
to specific IgGs, is an useful diagnostic tool, for the serological
diagnosis of primary syphilis, untreated syphilis in advanced phase
and congenital infection besides being an aid for monitoring
theraphy and defining the stage of disease. IgM anti-Treponema
pallidum
are
usually
determined
with
absorption
immunofluorescence tests (FTA-ABS-M) but this kind of tests can
hardly be relied upon due to subjectivity of interpretation.Moreover,
false positive results can occur due to the presence of rheumatoid
factors (RF) or sensitivity can be reduced due to competition with
IgG anti-Treponema pallidum when present in a great quantity.
BEIA Syphilis IgM Capture is a test for the determination of
specific IgM anti-Treponema pallidum which can be performed in
automation, more sensitive and specific than other routinary tests
and better than FTA-ABS thanks to the “immunocapture”
technology.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Syphilis IgM Capture kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) based on “capture method”. During
the first incubation, IgM antibodies present in serum bind to the
inner surface of the wells coated with the monoclonal anti-human
IgM. After the first incubation the wells are washed to remove nonreactive serum components. During the second incubation a
Conjugate (Purified recombinant protein of Treponema pallidum
labelled with HRP) binds only to the specific IgM anti-T. pallidum,
bound in the anti-IgM-IgM complex present on the wells.
Pag. 14 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
After a second washing cycle, a Substrate - TMB solution is
dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during
a subsequent incubation.
The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution
which changes to yellow the blue colour developed into the wells.
The amount of colour is directly proportional to the specific IgM
anti-T. pallidum concentration in the patient samples.
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CONTROL
-
B
Negative Control
1 x 1.6 mL
CAL
CO
C
Cut-off Calibrator
1 x 2.5 mL
CONTROL
+
D
Positive Control
1 x 1.6 mL
E
Sample Diluent BEIA Syphilis IgM
1 x 120 mL
DIL
SPE
capture
CONJ
BUF
WASH 10X
F
Conjugate BEIA Syphilis IgM capture
1 x 15 mL
G
Wash
1 x 100 mL
Buffer
BEIA
Syphilis
IgM
capture
SUBS
TMB
H
Substrate-TMB BEIA Syphilis IgM
1 x 15 mL
capture
H2SO4
I
Stop Solution BEIA Syphilis IgM
1 x 15 mL
capture
Package Insert
A.
B.
1
Coated strips
Breakable strips coated with monoclonal anti-human IgM
antibodies packed in sealed pouch. Place the unused strips in
the pouch and reseal.
Negative Control
Human serum negative for anti-T. pallidum IgM antibodies.
Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to
use reagent.
Pag. 15 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
Cut-off Calibrator
Human serum containing anti-T. pallidum IgM antibodies
with known concentration. Contains 0.09% w/w Sodium
azide as preservative. Ready to use reagent.
Positive Control
Human serum positive for anti-T. pallidum IgM antibodies.
Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to
use reagent
Sample Diluent
Buffered salt solution (PBS). Contains proteins 10% w/v, 0,09
% w/w Sodium azide and methyl orange as dye. Ready to use
reagent.
Conjugate
Solution containing purified recombinant of T. pallidum
conjugated with peroxidase (HRP) and stabilizers. Contains
phenol 0.05% e Bronidox 0.02%. Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 10x concentrated. Contains Brij
0.5%. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Ready to use reagent.
Stop Solution
0.3 mol/L Sulphuric acid solution. Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use reagents
after the expiry date indicated on the label. Reagents have a limited
stability after opening and/or preparation
Microplate
Controls
Conjugate
Substrate
Sample Diluent
Wash Buffer
Stop solution:
5 wks 2-8°C polythjene bag
5 wks at 2-8°C
5 wks at 2-8°C
up to exp date at 2-8°C, 1 wk at 15-30°C in the dark
up to exp date at 2-8°C
Reconstituted 2 wks at 2-8°C, 5 days at 15-30°C.
up to exp date at 2-8°C
Pag. 16 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent, Wash Buffer, Substrate-TMB,Stop Solution and
Negative Control are interchangeable between lots. All reagents are
NOT interchangeable with the other kits of the BEIA line.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED






Incubator at 37°C
Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS









Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Only take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the chromogenic substrate shows a change from pink to blue
colour, discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
Pag. 17 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed only with serum. It’s not possible to use
plasma. Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or
turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted
with Sample Diluent BEIA IgM Capture 1:51 prior to assay. See assay
protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (10 X)
Dilute 1:10 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer,
warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute the quantity
necessary for the assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform
the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
Pag. 18 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least
30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
Dilute the samples to be assayed (1:51) with the Sample Diluent
(i.e. 10 µL of serum and 500 µL of Sample Diluent) . Shake on
Vortex.
2.
Select the number of strips required for the assay according to the
number of samples to be assayed, the Negative Control, Cut-off
Calibrator and the Positive Control (see paragraph “Summary of
protocol” below). Reseal the pouch.
3.
Dispense 100 µL of Negative Control, Cut-off Calibrator, Positive
Control and of the diluted samples.
4.
Cover the microplate and incubate at 37 °C for 45 minutes.
5.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
6.
Dispense 100 µL of conjugate-HRP complex in each well.
7.
Cover the microplate and incubate at 37 °C for 45 minutes.
8.
Perform a washing cycle following the suggested procedure (see
Washing Cycles).
9.
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
10.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15 minutes.
11.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop Solution
into each well.
12.
Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620 nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:
 The OD for Positive Control must be ≥ 1.5 to the OD for the
Cut-off Calibrator.
 The ratio of the OD for Negative Control the OD for the Cutoff Calibrator must be < 0.6
 The OD for Calibrator Cut-off must be ≥ 0.2 at 450 nm and >
1.6 at 450/620 nm.
Pag. 19 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the data.
The non conformity must be addressed and treated according to
each laboratory’s Quality Assurance procedures.
Each lab should establish and follow its own internal Quality
Control procedures and use the QC results to validate runs and
manage non conformities.
CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
O.D. sample
________________________________________
Antibody Index (A I) =
O.D. Cut-off Calibrator
For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean
OD value (OD).
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
QUALITATIVE
A.I.
> 1.2
 0.8
0.8 1.2
INTERPRETATION
Sample should be considered POSITIVE for the
presence of anti -T. pallidum IgM antibodies
Sample should be considered NEGATIVE for the
presence of anti-T. pallidum IgM antibodies.
GREY ZONE: Sample should be considered
BORDERLINE for the presence of anti-T. pallidum
IgM antibodies.
Pag. 20 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
Please consider that:
- the test only detects specific IgM antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance specifications of
the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is
within such specifications, as intended by the manufacturer.
SENSITIVITY & SPECIFICITY
The sensitivity and the specificity were assessed by testing 180 specimens
of which 5 patients with diagnosed Syphilis infection. The samples were
analysed with another commercial immunoenzymatic method: 100%
agreement was found between the two method, both in the positive and
in the negative samples. The sensitivity ans the specificity of the kit are of
100 %.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with 11 mg/dL of
bilirubin up to 1048 UI/mL of RF, up to 1281 mg/dl triglycerides.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined with the
followings steps
Intra-assay
N
D.O
CV%
TPM1
24
0.22
19
TPM2
24
0.5
5
TPM3
24
1.45
5
CUT-OFF
12
0.29
2
CP
12
2.49
4
Pag. 21 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
Inter-assay
INDEX
SAMPLE
TMP3
TMP2
TMP1
CP
AVERAGE
4.1
1.5
0.7
7.5
CV%
11
16
16
8
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgM
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE








Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.
Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.
Do not pipette solutions or samples by mouth.
Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.
Wash hands thoroughly after assay.
Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.
Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.
Periodically check contamination level of operators and rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HBsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since
no known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as
hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately
with plenty of water, and seek for medical advice.
Pag. 22 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013
SUMMARY OF PROTOCOL


Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:51 with Sample Diluent BEIA Syphilis
IgM capture
Dispense:

100L of Negative Control (single)
100L of Cut-off Calibrator (duplicate)
100L of Positive Control (single)
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate









Cover and incubate 45 minutes at 37°C
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate-HRP
Cover and incubate 45 minutes at 37°C
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
NC
CC
CC
PC
P1
P2
P3
P4
2
P5
…
…
…
..
..
..
3
4
5
6
..
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BIBLIOGRAFIA / REFERENCES
- L.Lewis et al: Evaluation of immunoglobulin M Western Blot
analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Mirobiolol.
28: 296 (1990).
- G.Dettori, R.Grillo, et al.: Evaluation of western immuno-blotting
technique in the serological diagnosis of human syphilitic infections.
Eur. J. Epidemiol. 5 :22 (1989)
- G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin.Chem. 22:1243 (1976)
- S.A. Lukehart: Identification and characterization of Treponema
pallidum antigens by monoclonal antibodies. in: Monoclonal
Antibodies, Academic Press 1986, p.1.
- S.Norris, S. Sell Antigenic complexity of Treponema pa-lidum :
antigenicity and surface location of major polipeptide. The Journ. of
Immun. 133 :1686
- A.A. Codd, M.S. Sprott et al. Competitive enzyme-linked
immunosorbent assay for Treponema pallidum antibodies. J. Med.
Microbiol. 26:153 (1988).
- P.A. Hanff, S.J. Norris et al. Purification of Treponema pallidum,
Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation. Sexually
Trasmitted Diseases 11:275 (1984).
- J.D. Radolf, N.R. Chamberlain et al. Identification and localization
of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum by
phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect.
Immunity 56:490 (1988).
Pag. 24 - 24 BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013