BEIA Mab SYPHILIS Screen
22151
22155
Edizione
20-04-2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00522
Pag. 1 - 24 BEIA Mab Syphilis Screen Ed. 20-04-2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Mab Syphilis Screen è un test immunoenzimatico “ Back
Titration” qualitativo (ELISA) per il dosaggio nel siero o nel
plasma degli anticorpi di classe IgG, IgM ed IgA specifici verso il
Treponema pallidum.
SIGNIFICATO CLINICO
Lo screening sierologico della Lue ha acquistato, nell’ultimo
decennio, una rinnovata importanza per l’aumento dei casi di
sifilide latenti, per l’incremento della positività ai test sierologici
nelle diverse categorie a rischio e per la stretta correlazione tra
Sifilide e HIV.
Comunemente, a questo scopo, sono utilizzati metodi con antigene
lipoideo come VDRL e RPR unitamente a test con antigene
treponemico come TPHA, in grado di offrire una buona sensibilità
diagnostica durante tutte le fasi della malattia.
Un’importante evoluzione per lo screening della Lue è
rappresentata dall’introduzione dei test ELISA, facilmente
automatizzabili ed in grado di superare problemi legati alla
soggettività dell’interpretazione ed al fenomeno di prozona,
normalmente riscontrabili con i test d’agglutinazione. Approfondite
valutazioni hanno dimostrato come questi test ELISA consentano di
ottenere una sensibilità maggiore nei confronti del TPHA stesso.
In quest’ambito si colloca il kit BEIA Mab SYPHILIS Screen, in
grado di offrire, grazie al metodo immunoenzimatico “backtitration” la massima sensibilità nelle diverse fasi della malattia
luetica.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Mab SYPHILIS Screen è un dosaggio basato sul
principio dell’analisi “back titration” in due fasi. Gli anticorpi
specifici (IgG, IgM, IgA) anti-Treponema pallidum presenti nel
campione in esame reagiscono con gli antigeni adesi al
micropozzetto. Dopo aver allontanato con un lavaggio tutto quanto
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non si è legato alla fase solida, si procede ad una seconda
incubazione dopo avere dispensato anticorpi monoclonali antiTpN47 e anti-TpN15,5, coniugati con perossidasi (HRP) che
permettono di valutare quanti determinanti antigenici presenti sulla
fase solida sono rimasti reattivi. Maggiore è la concentrazione degli
anticorpi nel campione, minore è la quantità di determinanti
antigenici rimasti reattivi e minore è la quantità di anticorpi
coniugati che si legano alla fase solida. Dopo allontanamento del
coniugato enzimatico non legato viene aggiunto il Substrato-TMB
che, per azione dell’enzima presente sulla fase solida, sviluppa una
colorazione azzurra. L’aggiunta di una soluzione di acido solforico
1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall’azzurro al
giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente
proporzionale alla quantità di anticorpi coniugati legati e perciò
inversamente correlata alla concentrazione degli anticorpi
IgM/G/A presenti nel campione.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96/480 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti
frazionabili
22151
22155
12x8x1
5x12x8x1
CAL
CO
B
Calibratore Cut-off
1 x 2 mL
2 x 2 mL
CONTROL
+
C
Controllo Positivo
1 x 2 mL
2 x 2 mL
D
Coniugato
1 x 13,5 mL
5 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
E
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
2 x 100 mL
SUBS
TMB
F
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
5 x 13,5 mL
G
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
2 x 42 mL
Istruzioni per l’uso
1
1
H2SO4
A.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con T. pallidum purificato, ceppo Nichols,
in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate
nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in
micropozzetti singoli.
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B.
C.
D.
E.
F.
G.
Calibratore Cut-off
Siero umano a concentrazione nota di anticorpi anti-T.
pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all'uso.
Controllo Positivo
Siero umano positivo per anticorpi anti-T. pallidum. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
Coniugato
Soluzione contenente anticorpi monoclonali anti-TpN47 e antiTpN15,5 , coniugati con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata
sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono
intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI


Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
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


Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI








Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C).
Evitare l'essiccamento dei micropozzetti, tra gli step di
reazione del test.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario, aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e
congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni lipemici, torbidi ed
emolizzati.
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PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata
o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è
stabile 15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la
data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel
Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei
precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a
37°C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la
quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi
dell'analisi in corso.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C). Nel caso si utilizzino pozzetti di più micropiastre,
anche dello stesso lotto, si consiglia di inserire il Calibratore
Cut-off per ciascun gruppo di pozzetti.
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame, del Calibratore Cut-off e
Controllo Positivo (vedi il paragrafo “Schema del dosaggio”).
Richiudere accuratamente la busta.
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Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in
esame, del Calibratore Cut-Off e Controllo Positivo.
3. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
4. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
5. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Coniugato.
6. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
7. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
8. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
9. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
10. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
11. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
2.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :


la DO del Calibratore Cut-off deve essere  0.500
il valore di I.A. del Controllo Positivo deve essere ≤ 0.6
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio.
Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità
interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle
sedute ed alla gestione di eventuali non conformità.
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CALCOLO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
_______________________________________________
Index Anticorpale (I.A.) =
DO Calibratore Cut-off
Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore
medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Calibratore Cut-off
Controllo Positivo
Campione A
Campione B
Campione C
1ª DO
2ª DO
DO
I.A.
1.177
0.590
2.257
0.760
0.357
1.087
0.678
2.043
0.824
0.310
1.132
0.634
2.150
0.792
0.334
0.56
1.90
0.70
0.29
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
I.A.
< 0.9
> 1.0
0.9 1.0
INTERPRETAZIONE
Il campione è da considerare POSITIVO per
la presenza di anticorpi anti-T.pallidum
Il campione è da considerare NEGATIVO per
la presenza di anticorpi anti-T.pallidum
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare
DUBBIO per la presenza di anticorpi anti-T
pallidum
Pag. 8 - 24 BEIA Mab Syphilis Screen Ed. 20-04-2013
Ritestare i campioni risultati positivi. Se il risultato non è
confermato il campione deve essere considerato non reattivo per
anticorpi anti-T.pallidum.
Va tenuto presente che:
- Il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici anti-T.
pallidum. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo.
- Una decisione medica non può essere basata sul risultato di un
solo test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili.
Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello.
- Risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ
Sono stati testati 51 sieri di pazienti con diagnosi accertata di
infezione da Treponema pallidum. Tutti i 51 sieri hanno evidenziato
presenza di immunoglobuline specifiche anti-T. pallidum con il
BEIA Mab Syphilis Screen. La sensibilità risulta essere del 100.0 %.
SPECIFICITÀ
Sono stati testati 692 sieri supposti negativi per anticorpi antiTreponema pallidum. I sieri testati sono stati confrontati verso un
kit in emoagglutinazione (TPHA) ed un altro kit EIA presenti sul
mercato con prestazioni accettabili. 691 sieri risultarono negativi
per la presenza di immunoglobuline specifiche anti-T. pallidum con
il kit BEIA Mab Syphilis Screen. La specificità risulta essere del
99.85%.
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SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con I.A. 2.0 e due campioni
positivi rispettivamente con I.A. di 0.7 e 0.3. I campioni sono stati
replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono
stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20% per il
campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di Immunoglobuline
specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA








Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.
Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.
Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.
Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.
Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.
Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.
Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.
Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
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Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO











A
B
C
D
E
F
G
H
Preparare i reattivi
Dispensare:
100 L di Calibratore Cut-off in doppio
100 L di Controllo Positivo in doppio
100 L di campione in singolo o doppio,
Incubare 60 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
1
2
3
4
5
CC
P5
CC
…
CP
…
CP
…
P1
..
P2
..
P3
..
P4
…
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BEIA Mab SYPHILIS Screen
22151
22155
Version 20-04-2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
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INTENDED USE
The BEIA Mab Syphilis Screen kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) ” Back Titration” for the detection of
IgG, IgM and IgA antibodies to Treponema pallidum , in human
serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
Serological screening of Lue has gained great importance during the
last decade due to a larger number of cases with latent syphilis, an
increase of positive results in different high-risk categories, and the
close correlation between syphilis and HIV.
Test commonly used are those using a lipoid antigen as VDRL and
RPR and those using a treponemic antigen, as TPHA, able to offer a
good diagnostic sensitivity in all stages of disease.
The introduction of the ELISA tests, which can be easily performed
in automation and allow to overcome misinterpretation results or
prozone phenomenon, usually found with agglutination tests, has
been an important evolution.Extensive trials have demonstrated that
ELISA tests grant a higher sensitivity when compared with TPHA
itself. BEIA Mab Syphilis Screen is more sensitive and specific than
other methods, is a rapid test and can be performed in automation.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Mab Syphilis Screen kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) based on “back titration” method for
the detection of Igs antibodies to T. pallidum, in human serum or
plasma samples. During the first incubation, only anti-T. pallidum
specific antibodies (IgG, IgA, IgM) present in serum or plasma bind
to the inner surface of the wells coated with the T. pallidum antigen
Nichols strain. After the first incubation the wells are washed to
remove non-reactive serum components. During the second
incubation monoclonal antibodies anti-TpN47 and anti-TpN15,5
conjugated with horseradish peroxidase (HRP) are added binding
to the left reactive antigenic determinants. Higher is the antibodies
anti-T. pallidum concentration in the samples lower will be the
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amount of reactive antigenic determinants left availables for the
monoclonal anti-TpN47 and anti-TpN15,5. After a second washing
cycle, a Substrate-TMB solution is dispensed into the wells in order
to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The
enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which
changes to yellow the blue colour developed into the wells. The
amount of colour is directly proportional to conjugated monoclonal
antibodies present on the wells and in inverse proportion to specific
Igs anti-T. pallidum concentration present in the patient samples.
KIT COMPONENTS
Package size: 96/480 tests.
Component
SORB
22151
22155
A
Coated Strips
12x8x1
5x12x8x1
CAL
CO
B
Cut-Off Calibratore
1 x 2 mL
2 x 2 mL
CONTROL
+
C
Positive Control
1 x 2 mL
2 x 2 mL
D
Conjugate
1 x 13,5 mL
5 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
E
Wash Buffer
1 x 100 mL
2 x 100 mL
SUBS
TMB
F
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
5 x 13,5 mL
G
Stop Solution
1 x 25 mL
2 x 42 mL
Package Insert
1
1
H2SO4
A.
B.
Coated strips
Breakable strips coated with purified T. pallidum, Nichols
strain, packed in sealed pouch. Place the unused strips in the
pouch and reseal.
Cut-off Calibrator
Human serum, containing antibodies anti-T. pallidum with
known concentration. Contain 0.09% w/w of sodium azide as
preservative. Ready to use reagent.
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C.
D.
E.
F.
G.
Positive Control
Positive human serum for antibodies anti-T. pallidum.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready
to use reagent.
Conjugate
Monoclonal anti-TpN47 e anti-TpN15,5 antibodies conjugated
with horseradish peroxidase. Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Solution containing H2O2/TMB (Tetramethylbenzidine) in
stabilizing buffer. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop Solution are common to all
BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,200,500,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
Pag. 15 - 24 BEIA Mab Syphilis Screen Ed. 20-04-2013
WARNINGS AND PRECAUTIONS








Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Avoid wells drying through the reaction steps.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
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Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at
least 30-60 minutes at 18-25 °C. If strips coming from more
microplate, although of the same lot, are run , the Cut-off
Calibrator should be analysed for each group of strips.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed, the Positive Control and
the Cut-off Calibrator (see paragraph “Summary of protocol”
below). Reseal the pouch.
Dispense 100 µL of Cut-off Calibrator, Positive Control, and of
the samples.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 60
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
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9.
10.
11.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15
minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:

The OD for the Cut-off Calibrator must be ≥ 0.500

The A.I. of Positive Control must be ≤ 0.6
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the data.
The not conformity must be addressed and treated according to each
laboratory’s Quality Assurance procedures. Each lab should
establish and follow its own internal Quality Control procedures
and use the QC results to validate runs and manage non
conformities.
CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
OD sample
____________________
Antibody Index (A. I.) =
OD Cut-Off
For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean
OD value (OD).
The data below show typical results for the test. These data are
intended as an example only and should not be used to calculate
results from another run.
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Cut-off Calibrator
Positive Control
Sample A
Sample B
Sample C
1ª O.D.
1.177
0.590
2.257
0.760
0.357
2ª O.D.
1.087
0.678
2.043
0.824
0.310
O.D.
1.132
0.634
2.150
0.792
0.334
A.I.
0.56
1.90
0.70
0.29
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
A.I.
INTERPRETATION
< 0.9
Sample should be considered POSITIVE for the presence
of anti-T.pallidum antibodies.
Sample should be considered NEGATIVE for the presence
> 1.0
0.9  1.0
of anti-T.pallidum antibodies.
GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE
for the presence of anti-T.pallidum antibodies.
All samples found positive must be tested again. If the positive
result isn’t confirmed, the sample must be considered not reactive
for the antibodies to T. pallidum.
Please consider that:
- The test only detects specific Igs antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection.
- A medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data.
Discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level test.
- Results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
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PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance
specifications of the kit, but only experimental evidence that the
performance of the kit is within such specifications, as intended by
the manufacturer.
SENSITIVITY
The sensitivity was assessed by testing 51 specimens from patients
with diagnosed Syphilis infection. 51 specimens were observed
positive for the presence of antibodies anti-T. pallidum. The
sensitivity is of 100.0%.
SPECIFICITY
The specificity was assessed by testing 692 specimens from a
population expected to be negative for Igs to Treponema pallidum
The specificity was evaluated comparing the BEIA Mab Syphilis
Screen results versus an established Hemoagglutination commercial
kit (TPHA) and a EIA kit with acceptable performances. 691
specimens were found negative for the presence of antibodies antiT. pallidum with the BEIA Mab Syphilis Screen. The specificity is of
99.85%.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with A.I. of 2.0 and two positive samples, with
A.I. of 0.7 and 0.3. These samples were tested 6 times per single run
in 12 different analytical runs. Coefficients of variation lower
than 20% have been obtained for the negative sample and lower
than 10% for the two positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific Immunoglobulins.
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GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents
and samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent
solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers
and provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and
rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since
no known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as
hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately
with plenty of water, and seek for medical advice.
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SUMMARY OF PROTOCOL











A
B
C
D
E
F
G
H
Prepare reagents
Dispense:
100L of Cut-off Calibrator in duplicate
100L of Positive Control in duplicate
100 L of samples in single or duplicate
Incubate 60 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
1
CC
CC
PC
PC
P1
P2
P3
P4
2
P5
…
…
…
..
..
..
3
4
5
…
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REFERENCE - BIBLIOGRAFIA
- L.Lewis et al: Evaluation of immunoglobulin M Western Blot analysis in the
diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Mirobiolol. 28: 296 (1990).
- G.Dettori, R.Grillo, et al.: Evaluation of western immuno-blotting technique in
the serological diagnosis of human syphilitic infections. Eur. J. Epidemiol. 5 :22
(1989)
- G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin.Chem. 22:1243 (1976)
- S.A. Lukehart: Identification and characterization of Treponema pallidum
antigens by monoclonal antibodies. in: Monoclonal Antibodies, Academic Press
1986, p.1.
- S.Norris, S. Sell Antigenic complexity of Treponema pa-lidum : antigenicity
and surface location of major polipeptide. The Journ. of Immun. 133 :1686
- A.A. Codd, M.S. Sprott et al. Competitive enzyme-linked immunosorbent
assay for Treponema pallidum antibodies. J. Med. Microbiol. 26:153 (1988).
- P.A. Hanff, S.J. Norris et al. Purification of Treponema pallidum, Nichols
strain, by Percoll density gradient centrifugation. Sexually Trasmitted Diseases
11:275 (1984).
- J.D. Radolf, N.R. Chamberlain et al. Identification and localization of integral
membrane proteins of virulent Treponema pallidum by phase partitioning with
the nonionic detergent Triton X-114. Infect. Immunity 56:490 (1988).
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NOTE
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