SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ELETTROFORESI CAPILLARE
O SU GEL D’AGAROSIO?
www.sebia.com
Capillarys™ 2
Un nuovo strumento per l’elettroforesi capillare delle proteine
sieriche
Lavoro svolto da
Rossi Marco
SSMT, Locarno
Giugno 2006
Con la supervisione di
Dr. Phil. II, Togni Giovanni
Lavoro di ricerca svolto presso
Reparto Chimica Clinica
Istituto Viollier, sede Allschwil (BL)
Responsabile
Véronique Zygmunt
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INDICE
INDICE ...............................................................................................................................................1
1. RIASSUNTO/ABSTRACT..............................................................................................................2
2. INTRODUZIONE ...........................................................................................................................3
2.1 PROTEINE.......................................................................................................................................... 3
2.1.1 FRAZIONI ELETTROFORETICHE ED INTERPRETAZIONE CLINICA DEL PROFILO ................... 3
2.2 EVOLUZIONE DELL’ELETTROFORESI .................................................................................... 5
2.3 ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO (AGE)...................................................................... 5
2.4 ELETTROFORESI CAPILLARE (CE)........................................................................................... 6
2.4.1 PRINCIPI dell’ELETTROFORESI CAPILLARE........................................................................................ 7
2.5 OBBIETTIVI....................................................................................................................................... 9
3. MATERIALI E METODI.............................................................................................................10
3.1 ELETTROFORESI CAPILLARE .................................................................................................. 10
3.2 ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO ................................................................................ 11
3.3 RACCOLTA DEI CAMPIONI........................................................................................................ 12
3.3.1 DETERMINAZIONE DEI VALORI di riferimento................................................................................... 12
3.3.2 STUDIO DELLA PRECISIONE ................................................................................................................. 12
3.4 Strumenti analizzati.......................................................................................................................... 14
3.5 ANALISI DEI COSTI ...................................................................................................................... 14
3.6 STATISTICA .................................................................................................................................... 14
4. RISULTATI...................................................................................................................................15
4.1 PRECISIONE (IMPRECISIONE).................................................................................................. 15
4.2 RISULTATI DELLE COMPARAZIONI ...................................................................................... 17
5. DISCUSSIONE .............................................................................................................................21
5.1 PRECISIONE.................................................................................................................................... 21
5.2 COMPARAZIONI ............................................................................................................................ 22
5.3 VALORI DI RIFERIMENTO ......................................................................................................... 23
5.4 ALTRE CARATTERISTICHE....................................................................................................... 24
5.4.1 ANALISI DEI TEMPI ................................................................................................................................. 24
5.4.2 ANALISI DEI COSTI.................................................................................................................................. 25
5.4.3 EVENTUALI PROBLEMI .......................................................................................................................... 25
5.5 RACCOMANDAZIONI................................................................................................................... 25
5.5.1 IMMUNOTYPING ...................................................................................................................................... 26
6. CONCLUSIONE ...........................................................................................................................27
7. RINGRAZIAMENTI ....................................................................................................................28
8. BIBLIOGRAFIA...........................................................................................................................29
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1. RIASSUNTO/ABSTRACT
RIASSUNTO
ABSTRACT
Introduzione: L’elettroforesi capillare è
una
tecnica
analitica
d’introduzione
relativamente recente. Se i primi sviluppi
sono stati realizzati nei laboratori di ricerca,
viene oggi adottata anche nei laboratori
clinici. In effetti, grazie alla sua maggiore
capacità di risoluzione, rapidità, ampie
potenzialità
d’applicazione,
facile
automazione e costi derivati inferiori, è
un’interessante alternativa agli altri metodi di
separazione, meno efficaci e che hanno tempi
d’analisi più lunghi.
Background: Capillary electrophoresis
represent a relatively new technique that has
been introduced recently. Although the
capillary electrophoresis was first introduced
in research laboratories, this technique is now
making an entrance to the clinical laboratory.
This is due to its rapid and highly-efficient
separation power, its potential application and
its possible automation. Thus, capillary
electrophoresis represent a reliable alternative
to some time-consuming and less effective
separation techniques.
Strategia di realizzazione: L’elettroforesi
capillare delle proteine sieriche è un’analisi
che sta aumentando il suo impatto sui
laboratori clinici. Nel 2006, è stato comparato
il
sistema
d’elettroforesi
capillare
completamente automatizzato Capillarys™ 2
(CE) con il sistema semi-automatico
d’elettroforesi su gel d’agarosio HydrasysHyrys™(AGE), ed attualmente in uso nella
maggior parte dei laboratori, entrambi
prodotti della ditta Sebia. Questo studio si è
basato sulla valutazione delle caratteristiche
analitiche e di comparazione, includendo 285
campioni della routine di laboratorio, un pool
patologico, 2 pool normali ed un siero di
controllo, misurando anche una capacità
analitica di 90 elettroforesi/h.
Strategy
of
realization:
Capillary
electrophoresis of serum proteins is
increasingly gaining impact in clinical
laboratories. In 2006, the fully automated
capillary electrophoresis (CE) system,
Capillarys™ 2 from Sebia, was compared
with
the
method
of
agarose
gel
electrophoresis Hydrasys™-Hyrys (AGE),
from Sebia and usually currently used most in
clinical laboratories. This new study focuses
on the evaluation of analytical performance
and a comparison between the two systems,
including 285 samples taken from the routine
of the laboratory, one pathologic pool, 2
normal pools and one serum of quality
control, measuring, also, an analytical
throughput of 90 electrophoresis/h.
Risultati: I risultati dello studio di
comparazione hanno dimostrato una buona
correlazione tra il metodo d’elettroforesi
capillare e su gel d’agarosio (r = 0.97 per la
frazione albumina, e per le γ-globuline r =
0.98), eccetto per la frazione beta (r = 0.73).
La precisione nella serie fornisce dei
coefficienti di variazione (CV %) inferiori a
0.7% per l’albumina, tra 0.6-1.7% per le γglobuline, e tra 1-5% per le altre frazioni.
Results: The results of the comparison
study demonstrated a good correlation
between the Capillary electrophoresis system
and the agarose gel electrophoresis (r = 0.97
for albumin fraction and for the γ-globulin
r = 0.98) except for β-globulin (r = 0.73).
Precision within-run shows coefficients of
variation (CVs %) less than 0.7% for albumin,
between 0.6-1.7% for γ-globulin and between
1-5% for the other fractions.
Conclusioni: Il Capillarys™ 2 rappresenta
un’alternativa concreta alla convenzionale
elettroforesi su gel d’agarosio per i laboratori
d’analisi con una routine giornaliera superiore
a 20 campioni, combinando i vantaggi della
completa automazione con le grandi capacità
risolutive.
Conclusions: The Capillarys™ 2 represents
a reliable alternative to conventional agarose
gel electrophoresis for clinical laboratories
with a daily routine superior than 20 samples,
combining the advantages of full automation
(rapidity, ease of use and low costs) with an
high analytical resolutions.
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2. INTRODUZIONE
2.1 PROTEINE
Le proteine sono macromolecole organiche azotate, d’elevato peso molecolare e di struttura molto
complessa, presenti in tutte le forme di vita. Sono i costituenti organici più rappresentativi
nell’organismo, specialmente animale: svolgendo funzioni diversificate ma essenziali per la vita,
quali funzioni di catalisi chimica (enzimi), difesa (anticorpi), regolazione (ormoni), funzioni
strutturali, trasporto e produzione d’energia. Caratterizzate inoltre dalla presenza di quattro
elementi: carbonio, ossigeno, idrogeno e azoto; altri elementi quali zolfo, ferro e fosforo sono
presenti in proteine più specializzate.
Il peso corporeo è rappresentato per il 15% circa da proteine, la maggior parte di esse di si trova
nei muscoli. Gli elementi che costituiscono le molecole proteiche sono gli amminoacidi. La
combinazione dei differenti amminoacidi, tramite legami peptidici, formano la grande varietà di
proteine presenti nell’organismo.
Nel plasma sono contenuti 60-80 g/L di proteine di peso molecolare e funzioni eterogenee, che
possono essere suddivise in 3 grandi gruppi: le albumine, le globuline e il fibrinogeno. In base alla
funzione vengono classificate in: enzimi, proteine di trasporto, ormoni (glicoproteine, peptidi),
immunoglobuline, frazioni del complemento, fattori della coagulazione e della fibrinolisi, proteine
di mantenimento della pressione osmotica del sangue (albumina). Le proteine plasmatiche sono per
la maggior parte prodotte dal fegato (ad eccezione delle immunoglobuline, ormoni e di alcuni
enzimi), in equilibrio dinamico con le componenti dei tessuti e dei liquidi biologici, degradate ed
eliminate soprattutto a livello epatico e gastrointestinale.
2.1.1 FRAZIONI ELETTROFORETICHE ED INTERPRETAZIONE CLINICA DEL PROFILO
A scopo diagnostico le proteine totali del siero vengono separate e determinate ad un pH di 8.6. A
questo valore di pH, tutte le proteine assumono carica negativa e migrano verso l’anodo (polo
positivo). Mediante elettroforesi si possono separare le diverse componenti in 5 frazioni principali:
albumina (frazione più veloce), α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. La figura 1
rappresenta un profilo elettroforetico normale: esso si presenta come un grafico costituito da una
serie di picchi corrispondenti alle varie frazioni proteiche; mentre nella figura 2 si può osservare un
profilo schematizzato delle zone elettroforetiche su gel, con le proteine ad esse associate.
Figura 1: rappresentazione grafica del profilo proteico
di un campione normale, con descrizione delle proteine
più importanti, suddivise nelle 5 frazioni principali (1)
Figura 2: rappresentazione schematica di un risultato
su gel di un elettroforesi delle siero-proteine, con
annesse la suddivisione delle varie proteine nelle
frazioni proteiche (1)
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Cambiamenti nella quantità di proteine specifiche si chiamano disproteinemie e questi scompensi
possono facilmente essere identificati nell’elettroforesi delle proteine sieriche. Le poche proteine
che possono portare a cambiamenti significativi del profilo proteico sono:
•
l’albumina: è una proteina di 69 kD che costituisce la frazione sieroproteica più abbondante. Le
sue funzioni sono essenzialmente di mantenimento della pressione osmotica del sangue, di
trasporto di acidi grassi, bilirubina, ormoni e farmaci; di riserva energetica e di amminoacidi.
Cambiamenti nella concentrazione dell’albumina possono essere di origine ereditaria o
acquisita. Le cause più frequenti della forma acquisita sono disfunzioni della distribuzione,
perdita d’albumina a livello renale o intestinale oppure disturbo della sintesi dovuto a danno
epatico o a carente assunzione di proteine. Inoltre l’ipoalbuminemia è un fattore importante
nella patogenesi dell’edema e della sindrome nefrosica. Nelle infiammazioni si osservano,
localmente degli arrossamenti, delle tumefazioni, produzione di calore e dolore, mentre a livello
sistemico si manifesta una sensazione di malessere, febbre, leucocitosi e velocità di
sedimentazione (VES) aumentata.
•
le proteine della fase acuta: sono delle proteine prodotte in risposta a cause infiammatorie,
chimiche o fisiche. Il loro scopo è quello di circoscrivere il danno e preparare l’organismo prima
della reazione specifica del sistema immunitario. Le cellule infiammatorie, quali
monociti/macrofagi, liberano diverse citochine, compresa l’interleuchina 6, la quale a livello
epatico stimola la produzione delle proteine della fase acuta. Queste ultime si riscontrano
prevalentemente nella frazione delle α1-globuline e α2-globuline. Nella fase precoce di
un’infiammazione, aumenta prima la frazione delle α1-globuline, successivamente aumentano
sia la frazione delle α1-globuline sia quella delle α2-globuline. La proteina C-reattiva (CRP), è
una proteina della fase acuta, che migra nella zona delle γ-globuline; essa può aumentare la sua
concentrazione nel siero da 10 a 1000 volte a dipendenza dello stimolo che induce la sua
produzione. Altre proteine della fase acuta, come l’albumina, la transferrina (proteina che migra
nella zona delle β-globuline) e la pre-albumina, diminuiscono la loro concentrazione durante
uno stato infiammatorio.
•
le lipoproteine: cambiamenti nella distribuzione delle lipoproteine indicano disturbi metabolici;
aumenti delle LDL si manifestano nella regione delle β-globuline.
•
le proteine del complemento: le componenti C3 e C4, che migrano nella regione delle βglobuline, possono aumentare anche della metà durante un’infiammazione, mentre
diminuiscono nelle patologie autoimmuni.
•
le immunoglobuline: la frazione delle γ-globuline è rappresentata dalle immunoglobuline e
principalmente dalle IgG, che in condizioni normali è prevalente sulle altre. Un aumento delle γglobuline configura i quadri di una gammopatia monoclonale (picco a base stretta) o della
gammopatia policlonale (picco a base larga). La frazione delle immunoglobuline aumenta in
modo policlonale durante infezioni acute e croniche, grazie alla produzione di molte classi
d’immunoglobuline, mentre aumenta in modo monoclonale durante patologie autoimmuni. Il
picco monoclonale compare quando viene espresso principalmente un solo tipo
d’immunoglobulina caratterizzata da un unico tipo di catena leggera (kappa o lambda). La
funzione immunologica è garantita solamente quando la loro concentrazione supera i 3 g/L.
Questo esame è indicato nella diagnosi e nel monitoraggio di malattie neoplastiche, negli stati di
dispersione proteica a livello renale ed intestinale, nei disturbi immunologici, nell’insufficienza
epatica, nelle malattie nutrizionali e negli stati edematosi cronici. In questi ultimi anni questo esame
viene eseguito soprattutto per la diagnosi ed il monitoraggio di patologie immunologiche, nella
ricerca d’eventuali gammopatie monoclonali.
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2.2 EVOLUZIONE DELL’ELETTROFORESI
L’elettroforesi è una tecnica di separazione basata sul movimento di molecole cariche (ioni) in un
campo elettrico. Molecole dissimili si muovono a velocità diverse e i componenti di una miscela si
separano quando si applica un campo elettrico. La mobilità elettroforetica di una molecola dipende
da:
•
La carica netta di una molecola campione determina la direzione di movimento e ne influenza
la mobilità (cationi verso catodo). Essa dipende dal pH ed è determinata dal numero relativo
delle catene laterali d’amminoacidi cariche positivamente e negativamente ad un dato valore di
pH. Quindi l’elettroforesi si esegue a pH costante grazie all’utilizzo di un tampone.
Preferibilmente si utilizza un pH alcalino, dove la maggior parte delle proteine ha una carica
netta negativa e quindi, in un campo elettrico, migreranno verso il polo positivo (anodo).
•
Le dimensioni (la resistenza frizionale esercitata su molecole che si muovono in soluzione da
parte della matrice porosa, fa si che le molecole più piccole migrino più velocemente di quelle
più grandi) e
•
La forza del campo elettrico
L’elettroforesi, come tecnica di separazione, fu introdotta da Arne W. K. Tiselius nel 1937 (4).
Per il suo lavoro nella separazione di sostanze Tiselius fu onorato del premio Nobel per la chimica
nel 1948.
L’efficienza, o risoluzione, della separazione in soluzione libera, come eseguita da Tiselius, era
limitata dagli effetti delle correnti di convezione (derivate dal riscaldamento dovuto al campo
elettrico) e dalla diffusione termica. È per questa ragione che, l’elettroforesi convenzionali sono
state eseguite, in primo luogo, in supporti anti-convezione (supporti porosi), come poliacrilamide o
gel d’agarosio. I gel, nel formato di lastra o cilindrico, sono stati usati principalmente per la loro
capacità di separazione in relazione alla taglia delle macromolecole biologiche, quali acidi nucleici
e proteine. Nonostante sia una delle più diffuse tecniche di separazione, l’elettroforesi su gel,
presenta diversi svantaggi quali lunghi tempi d’analisi, bassa risoluzione e difficoltà d’automazione.
I primi due sono dovuti soprattutto all’impossibilità di aumentare la potenza del campo elettrico, al
fine di evitare i problemi dovuti ad un’eccessiva produzione di calore.
Un’alternativa ai gel, può essere rappresentata dalla separazione elettroforetica eseguita in un
capillare, in considerazione del fatto che i capillari stessi evitano gli effetti delle correnti di
convenzione, così da permettere l’esecuzione della separazione elettroforetica anche in questo
supporto.
I primi lavori con capillari furono descritti da Hjérten nel 1967. A quei tempi erano usati dei
capillari di quarzo, aventi un diametro di 1-3 millimetri. Più tardi Virtanen e poi Mikkers
eseguirono elettroforesi in capillari con un diametro interno di approssimativamente 200 µm,
formati rispettivamente di vetro e Teflon. Nei primi anni ‘80 Jorgenson e Lukacs (5) fecero
evolvere ulteriormente la tecnica elettroforetica usando dei capillari con un diametro interno di 75
µm e formati da silice fusa.
2.3 ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO (age)
Per separare le proteine si deposita una porzione di siero su una matrice imbevuta di una
soluzione elettrolitica (tampone), che permette il passaggio della corrente (AGE, vedi allegato 2). Il
tampone ha anche lo scopo di mantenere costante il pH costante, durante tutta la migrazione, e
alcalino in cui la maggior parte delle proteine possiede una carica netta negativa. La matrice porosa
introduce un ulteriore effetto di setaccio molecolare; le dimensioni dei pori sono in genere dello
stesso ordine di dimensione delle molecole che vengono separate, e restringono di conseguenza il
movimento delle molecole più grandi rispetto a quelle più piccole. Essa può essere costituita da
carta da filtro, acetato di cellulosa, gel d’agarosio (polisaccaride ottenuto dalle alghe marine e
utilizzato per la separazione di proteine, lipo-proteine, DNA e RNA), gel d’acrilamide, ecc. Lo
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scopo di questi supporti è quello di ridurre la diffusione delle particelle, in modo che queste migrino
e si separino in una zona ben precisa e caratteristica. Le sostanze vengono fatte migrare grazie alla
differenza di potenziale elettrico tra i due elettrodi. Le grosse proteine tendono a spostarsi fra le
maglie della matrice porosa più lentamente rispetto a quelle più piccole che si spostano verso
l’anodo con meno difficoltà.
Prima della colorazione, le proteine separate devono essere fissate in posizione in modo che non
diffondano, tramite l’utilizzo di MeOH. I coloranti utilizzati sono l’Amidoschwarz, il Blue di
Comassie e il Ponceau S.
Per la quantificazione delle proteine separate su gel d’agarosio, la tecnica più utilizzata è la lettura
mediante un densitometro. Un fascio di luce molto fine (fascio laser o luce monocromatica) viene
fatto passare su tutta la lunghezza della striscia delle proteine colorate. Un lettore registra i
cambiamenti d’intensità della luce che passa attraverso il gel e li rappresenta in un tracciato
elettroforetico. La dimensione delle bande e la loro intensità sono proporzionali alla concentrazione
delle varie proteine. Il grafico finale risulta costituito da una serie di picchi corrispondenti alle
frazioni proteiche (2,3,8).
2.4 ELETTROFORESI CAPILLARE (CE)
L’elettroforesi capillare è nata dalla combinazione del meccanismo di separazione
dell’elettroforesi e dal concetto della strumentazione e automazione della cromatografia. Essa
supera in gran parte il problema principale dell’elettroforesi senza mezzo di supporto, cioè bassa
risoluzione dovuta a correnti convettive e a diffusione.
Nell’elettroforesi capillare la migrazione viene eseguita in un fine capillare, tipicamente con un
diametro interno da 25 µm a 75 µm, riempito solamente con del tampone (formato da elettroliti), e
con una lunghezza pari a 20-200 cm.
L’uso del capillare ha numerosi vantaggi, in particolare la capacità di disperdere efficacemente il
calore prodotto dal campo elettrico, grazie ad un grande rapporto superficie/volume, diminuendo
così l’effetto Joule (2). Questo permette l’applicazione di un campo elettrico a partire da 100 V/cm
fino a 500 V/cm (10 – 30 kV), aumentando di conseguenza la capacità di risoluzione e riducendo i
tempi d’analisi. Il calore generato durante l’elettroforesi è proporzionale al quadrato della corrente
applicata e alla resistenza elettrica del mezzo: la produzione di calore porterà ad un allargamento
delle zone facendo aumentare la velocità della diffusione dei componenti del campione nelle zone
più calde, e degli ioni del tampone. La generazione di calore può portare anche ad altri problema
quali la denaturazione da calore dei componenti biologici del campione da separare e la riduzione
della viscosità del tampone, portando ad una diminuzione della resistenza. In pratica, la maggior
parte degli apparati elettroforetici su gel, incorpora un dispositivo di raffreddamento e controllo
della temperatura; ma anche così la distorsione di una zona elettroforetica rispetto alla banda netta e
lineare, può essere spiegata da un’inefficiente dissipazione del calore. L’elettroforesi capillare
utilizza alti voltaggi e, in considerazione di quanto detto, si capisce quanto sia importante la
capacità di dissipazione del calore.
L’elettroforesi capillare permette inoltre un minimo utilizzo di campione, nell’ordine di 1-50 nL, e
la possibilità di un’automazione completa delle analisi, riducendo la manipolazione da parte
dell’uomo, e, tramite l’utilizzo di bar-code, si minimizza la possibilità di errori e/o scambi di
provetta.
Una caratteristica della CE è la semplicità della strumentazione. I componenti principali dello
strumento sono: un generatore di corrente ad alto voltaggio, due serbatoi per il tampone, due
elettrodi e un capillare che attraversa un sistema ottico di misurazione; il tutto controllato da un
computer. Nella figura 1, è rappresentato un diagramma semplificato di un generico sistema di
elettroforesi capillare.
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Le estremità del capillare sono posizionate
in due piccoli serbatoi contenti il tampone.
Esso è identico a quello contenuto nel
capillare. Il campione è introdotto nel
capillare, tramite l’applicazione di una
pressione esterna, grazie allo scambio del
serbatoio anodico con il serbatoio contenente
il campione pre-diluito automaticamente.
Dopo avere rimesso l’estremità anodica del
capillare nel serbatoio contente il tampone,
viene applicato il campo elettrico, così da
permettere la separazione elettroforetica del
campione in esame. La determinazione delle
molecole separate viene eseguita all’estremità
catodica direttamente attraverso le pareti del
capillare, tramite lettura diretta per
spettrometria d’assorbimento (7).
Figura 3:
Diagramma semplificato di un generico sistema
d’elettroforesi capillare, composto da un capillare, due
serbatoi per il tampone un contenitore per il campione,
due elettrodi e un generatore di alto voltaggio(7).
Un buon capillare deve essere chimicamente ed elettricamente inerte, trasparente ai raggi UV,
flessibile ma robusto, e poco costoso. I capillari di silice fusa soddisfano molti di questi parametri, e
sono dunque quelli più utilizzati al giorno d’oggi. I diametri interni dei capillari di silice fusa
possono variare a partire da 10 µm fino a 200 µm, mentre quelli esterni variano da 300 a 350 µm:
un buon compromesso fra efficiente dissipazione del calore e necessità di un percorso della luce
non troppo breve per la rivelazione mediante spettrofotometria UV/visibile. Questi capillari sono
ricoperti da uno strato esteriore di un polimero, al fine di assicurare forza e flessibilità.
Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è il suo ampio campo di applicazione.
Originariamente è stata concepita per l’analisi di macromolecole biologiche; ma successivamente
essa ha dimostrato una capacità di separazione di altri componenti: amminoacidi, droghe, vitamine,
pesticidi, ioni inorganici, acidi organici, peptidi e proteine, carboidrati, oligonucleotidi e frammenti
di restrizione di DNA, come pure cellule e particelle di virus (6).
2.4.1 PRINCIPI dell’ELETTROFORESI CAPILLARE
La migrazione degli analiti è avviata dall’applicazione di un campo elettrico tra i due serbatoi alle
estremità del capillare. È importante notare, però, che tutti gli ioni presenti nel campione da
separare, positivi o negativi, migrano nella stessa direzione attraverso il capillare, questo è dovuto
all’azione del flusso elettroendo-osmotico (EOF), il quale ha una forza maggiore rispetto alla
tendenza degli ioni di migrare nel campo elettrico, trascinandoli con se (7). Esso rappresenta un
costituente fondamentale dell’elettroforesi capillare, e si manifesta come un movimento di volume
di liquido di tampone nel capillare.
L’EOF è la conseguenza delle cariche poste sulla superficie interna del capillare. In condizioni
acquose la maggior parte delle superfici dei solidi possiede un eccesso di cariche negative. Nei
capillari di silice fusa l’EOF è causato dai numerosi gruppi SiOH sulla superficie interna del
capillare, i quali possono esistere nella forma anionica (SiO-) a valori di pH superiore a 3. Attratti ai
gruppi Si-O-, i cationi, presenti nel tampone, tendono a formare 2 strati interni (“diffuse double
layer”) sulla superficie interna del capillare. Quando si applica il campo elettrico, lo strato più
esterno di cationi, e quelli rimanenti nel tampone, vengono trascinati verso il catodo. La soluzione
tampone tende a migrare assieme allo strato esterno di cationi, generando così il flusso elettroendoosmotico, che trascina con se gli analiti da separare. L’EOF dipende dalla forza del campo elettrico,
dal pH e dalla composizione ionica del tampone.
Il vantaggio del flusso elettroendo-osmotico è il fatto che causa il movimento di tutte le specie,
indipendentemente dalla carica elettrica della molecola, nella stessa direzione, come si può notare
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nella figura 4. Nei capillari con una superficie interna negativa, il flusso generato si muove
dall’anodo verso il catodo. I cationi migrano più velocemente grazie alla somma dell’EOF con la
forza del campo elettrico, le sostanze neutre sono trascinate con la stessa velocità del tampone, ed
infine gli anioni migrano più lentamente, dato che sono rallentati dalla tendenza di migrazione verso
l’anodo.
Figura 4: La figura quattro mostra le differenti velocità di migrazione dei soluti, aventi cariche elettriche diverse,
dovute alla presenza del flusso elettroendo-osmotico nell’elettroforesi capillare (7).
Nella CE solo piccoli volumi di campione sono introdotti nel capillare, nell’ordine dei nL. Queste
quantità sono proporzionali al piccolo volume del capillare. L’iniezione del campione nel capillare
può avvenire secondo due tecniche principali:
•
Iniezione idrodinamica: è la tecnica più diffusa. Essa viene eseguita tramite l’applicazione di
una pressione al margine del capillare di inserzione e viene applicato un vacum (sotto vuoto) al
margine terminale del capillare. Il volume di campioni iniettato è in funzione delle dimensioni
del capillare, dalla viscosità del tampone, dalla pressione applicata e dal tempo di applicazione.
•
Iniezione eletrocinetica o elettromigrazione: è eseguita tramite il posizionamento del margine
anodico del capillare nella fiala contente il campione e applicando un campo elettrico. I
campioni entrano nel capillare sotto l’azione della migrazione del campo elettrico e dall’azione
del flusso elettroendo-osmotico. La quantità di campione introdotto dipende dalla mobilità
elettroforetica specifica di ogni soluto e dalla forza dell’EOF generato.
In tutte e due i casi, il volume del campione iniettato non è una quantità conosciuta, ma può essere
calcolata. Invece del volume, i parametri di quantificazione per l’iniezione sono il tempo di
pressione, per l’iniezione idrodinamica, e il tempo di voltaggio, per quella elettrocinetica.
La determinazione delle molecole nella CE, deve fare fronte alle piccole dimensioni del capillare
e quantità di campione. Il metodo più comunemente utilizzato è la determinazione tramite lo spettro
di assorbimento UV, durante la migrazione delle molecole. In questo sistema, una sezione del
capillare stesso è utilizzato come camera di misurazione. La tecnica di determinare gli analiti
direttamente nel capillare permette la misurazione degli stessi senza perdita di risoluzione. La
porzione di capillare utilizzato per la misurazione UV, deve essere otticamente trasparente: per
questo motivo, in questa regione, viene eliminato il polimero utilizzato per il rivestimento del
capillare. Secondo la legge di Lambert-Beer, la sensitività della misurazione è proporzionale alla
lunghezza della cella. Dunque per migliorare la capacità di misura bisogna cercare di aumentare il
percorso della luce, senza però perdere in capacità risolutiva. Esistono due principali metodi che
possono essere utilizzati per aumentare il percorso della luce: il capillare stesso può essere espanso
creando una bolla (“bubble cell”) creando una zona con un diametro maggiore, oppure creando un
segmento “Z”, al fine di aumentare il tragitto della luce.
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Alla fine della migrazione e quindi anche dalla misurazione dei componenti separati, i risultati
appaiono come dei grafici, che riportano gli analiti riscontrati sotto forma di picchi con differenti
tempi di ritenzione.
2.5 OBBIETTIVI
La separazione delle proteine sieriche, tramite elettroforesi, è ormai un’analisi di routine, con lo
scopo di individuare alterazioni qualitative e/o quantitative delle proteine e soprattutto per la ricerca
di componenti monoclonali nel siero, per il monitoraggio di patologie maligne e/o immuni dei
linfociti B (quali MGUS, mieloma multiplo, …), ed in minima parte per la diagnosi di stati
infiammatori e altri scompensi proteici (disproteinemie, deficienze congenite di proteine).
Con la tecnica dell’elettroforesi le proteine sieriche vengono separate in 5 frazioni principali:
albumina, α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. L’interpretazione clinica del
grafico elettroforetico si basa sulla variazione del contenuto di una o più delle 5 frazioni maggiori e
sull’analisi visiva del risultato al fine di riscontrare eventuali alterazioni patologiche rispetto al
tracciato normale.
Al giorno d’oggi, all’interno dei laboratori clinici, la separazione delle proteine è effettuata
principalmente tramite l’utilizzo di gel d’agarosio, come supporto per la migrazione, con l’ausilio di
strumenti semi-automatici, quali Hydrasys™-Hyrys (Sebia) o Paragon (Beckman Coulter).
Nonostante l’utilizzo di questo tipo di apparecchiatura e di kit pronti all’uso, questa tecnica rimane
laboriosa e con lunghi tempi di analisi. Da molti anni a questa parte le richieste di elettroforesi delle
proteine sono cresciute a tal punto da rendere necessario un’automatizzazione del lavoro per
incrementare le prestazioni fornite e la velocità dell’analisi.
Durante l’ultimo decennio, l’elettroforesi capillare è emersa come una nuova tecnica con grandi
prestazioni analitiche (9,10). È per questo motivo che nel 2006, è stato deciso di testare un nuovo
apparecchio per l’elettroforesi capillare: il Capillarys™ 2 della ditta Sebia (Francia). Il primo
strumento automatizzato per l’elettroforesi capillare delle proteine sieriche e la caratterizzazione di
gammopatie monoclonali in routine, il Paragon CZE2000™ (Beckman Coulter), è stato
commercializzato nel 1994. L’apparecchio Capillarys™ 2 permette una separazione delle proteine
completamente automatizzata a partire dall’inserimento del campione, fino all’ottenimento del
tracciato elettroforetico.
L’obbiettivo del mio lavoro di diploma è la valutazione delle caratteristiche dell’apparecchio
automatizzato per l’elettroforesi multicapillare delle proteine sieriche (Capillary™2, Sebia), basato
sul principio dell’elettroforesi capillare in soluzione libera, comparandolo con il sistema di
elettroforesi in gel d’agarosio Hydrasys-Hyrys™ (Sebia). Questo lavoro di comparazione è stato
svolto all’interno del laboratorio Viollier nella sede principale di Allschwil (BL, Svizzera). In
questo laboratorio la tecnica elettroforetica attualmente in uso è l’elettroforesi su gel d’agarosio
tramite l’utilizzo del sistema semi-automatizzato Hydrasys-Hyrys™ della ditta Sebia. Oltre
all’analisi di comparazione sono state valutate altre caratteristiche, quali la precisione
dell’apparecchio capillare, i costi dei due sistemi, tempi di analisi, ed inoltre sono stati determinati i
valori di riferimento per il sistema capillare. Tramite questo studio si vorrebbe introdurre il nuovo
apparecchio, Capillarys™ 2, nella routine del laboratorio. Esso permette la separazione, in tampone
alcalino, delle proteine del siero umano nelle 6 maggiori frazioni proteiche (albumina, α1-, α2-, β1-,
β2- e γ-globuline), eseguendo automaticamente tutte le fasi del processo di separazione fino ad
ottenere un profilo proteico per l’analisi qualitativa e/o quantitativa delle frazioni ottenute. I suoi
vantaggi includono un’alta risoluzione, riproducibilità, sensibilità nella determinazione di
paraproteine (vs. AGE), utilizzo di piccole quantità di campione e reagenti, e automazione
completa.
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
3. MATERIALI E METODI
In questo lavoro sono state comparate due tecniche elettroforetiche: l’elettroforesi su gel d’agarosio
tramite il sistema Hydrasys™-Hyrys (Sebia) e l’elettroforesi capillare, tramite lo strumento
Capillarys™ 2 (Sebia, Francia).
3.1 ELETTROFORESI CAPILLARE
Il sistema Capillarys™ 2 comprende 8 capillari in parallelo (con un diametro interno inferiore a
100 µm), così da permettere 8 analisi simultaneamente. Utilizzando rack di 13x8 il Capillarys™ 2
riesce ad eseguire 90 elettroforesi per ora.
Il pipettaggio dei campioni avviene direttamente dalla provetta primaria (da 13 a 16 mm di
diametro e da 75 a 100 mm di altezza) o in microprovette da 1,5 mL posizionate su provette
primarie, sempre senza tappo. Lo strumento capillare esegue sempre 8 elettroforesi
contemporaneamente, dunque se si deve analizzare un numero inferiore a 8 campioni su un rack, il
resto delle posizioni deve essere occupato da delle provette contenenti acqua bidistillata.
L’iniezione dei campioni (diluiti 1/10 con tampone) nei capillari avviene tramite il sistema
idrodinamico, applicato per 4 secondi (campione iniettato circa 1 nL); lo strumento necessita di un
volume morto di campione di circa 200 µL.
La separazione avviene applicando una differenza di potenziale costante di 9 kV alle estremità di
ogni capillare, per una durata di 4 minuti. La temperatura dei capillari è tenuta sotto controllo a
35°C per effetto Peltier durante tutta la migrazione. La misurazione delle proteine viene effettuata
all’estremità anodica del capillare per spettrometria di assorbimento ad una lunghezza d’onda di
200 nm. Alla fine della misurazione i capillari vengono risciacquati utilizzando una soluzione di
lavaggio e poi nuovamente riempiti con la soluzione tampone.
La separazione delle proteine è eseguita utilizzando il kit Capillarys Protein(e) 6 (ref. n° 2003),
che, in un tampone basico (pH 9.9), permette la separazione delle proteine sieriche in 6 frazioni
maggiori nel seguente ordine: γ-globuline, β2-globuline, β1-globuline, α2-globuline, α1-globuline ed
albumina. La composizione del kit Capillarys Protein(e) 6 comprende: 2 flaconi da 700 mL di
tampone di analisi a pH 9.9 pronto all’uso, un flacone da 70 mL di soluzione di lavaggio
concentrata (da portare a volume di 700 mL con acqua bidistillata) contenente della soda caustica,
una confezione di 90 di coppette multiple monouso per la diluizione automatica dei campioni di
siero e 3 filtri monouso per i flaconi dei reattivi. Gli altri reagenti necessari sono: acqua bidistillata
per il risciacquo del sistema automatico, Capiclean (soluzione enzimatica concentrata, Sebia, ref. n°
2051, 1 flacone da 12 mL) contenente enzimi proteolitici e composti chimici per la pulizia
settimanale dei capillari e dell’ago di prelievo del sistema automatico.
Il procedimento dell’analisi è completamente automatizzato e prevede le seguenti fasi: la lettura
dei codici a barre delle provette primarie (fino a 8) e dei portacampioni, la diluizione dei campioni a
partire dalle provette primarie, il lavaggio dei capillari, l’iniezione dei campioni diluiti, la
separazione e la lettura diretta delle proteine separate. Le fasi manuali sono le seguenti: il
caricamento delle provette primarie nei portacampioni, l’inserimento dei portacampioni nel sistema
Capillarys™ 2, l’avvio della sequenza automatica e il recupero dei portacampioni dopo l’analisi. I
profili corrispondenti ai campioni analizzati appaiono sullo schermo dopo circa 10 minuti (tempo
calcolato per i primi 8 campioni). Il trattamento dei risultati e l’identificazione delle varie frazioni è
effettuata automaticamente dal programma software Phoresis (versione 5.29), fornito con
l’apparecchio. I profili elettroforetici sono analizzati visivamente per rilevare eventuali anomalie.
Il kit CAPILLARYS IMMUNOTYPING permette la rilevazione e la caratterizzazione in tampone
basisco (pH = 9.9) delle proteine monoclonali (immunotipizzazione) nel siero umano tramite
elettroforesi capillare nel sistema automatico Capillarys™ 2. Questo Kit deve essere utilizzato
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insieme al kit Capillarys Protein(e) 6. Ogni campione di siero da analizzare viene mescolato con
diversi antisieri specifici, anti-catene pesanti gamma (IgG), alfa (IgA) e mu (IgM), e anti-catene
leggere kappa e lambda (libere e legate). Con questa metodica l’immunotipizzazione viene
effettuata con antisieri monospecifici e permette l’identificazione dei picchi monoclonali individuati
con l’elettroforesi. Nel sistema Capillarys™ 2, costituito da 8 capillari in parallelo, il campione è
iniettato all’anodo simultaneamente in 6 capillari (i capillari 7 e 8 non vengono utilizzati). Il profilo
proteico di riferimento è ottenuto per iniezione del campione pre-diluito, in presenza del tampone
del kit Protein(e) 6, nel capillare 1 per l’esecuzione del tracciato elettroforetico del campione. I
profili degli antisieri sono ottenuti per iniezione del campione pre-diluito in presenza degli antisieri
di diverse specificità negli altri 5 capillari (dal numero 2 al 6). La sovrapposizione di uno dei profili
degli antisieri con il profilo di riferimento ottenuto sul capillare 1, permette di visualizzare la
scomparsa e/o la diminuzione di un picco monoclonale sul profilo antisiero e di dedurne una
gammopatia. L’immunotipizzazione viene eseguita in quattro fasi. Prima di tutto viene diluito il
siero con un diluente specifico contenuto nel doppio pozzetto della barretta degli antisieri. Il siero
diluito viene quindi mescolato con i relativi antisieri. Il complesso antigene-anticorpo si forma
rapidamente in fase liquida e non richiede un tempo d’incubazione o di sedimentazione. La terza
fase prevede l’iniezione dei campioni trattati nei 6 capillari (estremità anodica), seguita dalla
separazione elettroforetica. La rilevazione diretta delle proteine avviene a 200 nm, sul lato catodico
del capillare. Infine viene eseguita una sovrapposizione del profilo di riferimento ottenuto sul
capillare 1 con i profili ottenuti con gli antisieri, ciò che permette la caratterizzazione della proteina
monoclonale.
Il kit Capillarys Immunotyping è composto da 60 coppette multiple monouso con antisieri
(immunoglobuline totali di mammifero), pronte all’uso. Ogni antisiero ha un colore specifico e le
coppette hanno una forma caratteristica che permette l’inserimento sui portacampioni del sistema
Capillarys™ 2 soltanto nella posizione corretta.
3.2 ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO
Tecnica semi-automatizzata, effettuata con il sistema Hydrasys™, che permette la separazione
delle proteine sieriche in un tampone alcalino (pH 9.2) su una matrice di gel d’agarosio (Hydragel 7
Protein(e) o Hydragel 15/30 Protein(e)). Le proteine sono separate in 5 frazioni principali:
albumina, α1-globuline, α2-globuline, β-globuline e γ-globuline. Le proteine separate vengono
colorate tramite una soluzione di Amidoschwarz e l’eccesso di colorante viene eliminato mediante
una soluzione acida (acido citrico 0.5 g/L dopo diluizione). Le frazioni proteiche vengono valutate
visivamente per la ricerca di eventuali anormalità. Con la densitometria (a 570 nm) si ottiene una
quantificazione precisa di ogni zona colorata presente sul gel.
Il sistema Hydrasys™ comporta le seguenti tappe: l’applicazione dei campioni non diluiti (10 µL
di siero), la migrazione elettroforetica a 20 W (per il kit Hydragel 15/30 protein(e)) ad una
temperatura di 20°C controllata con elemento Peltier, per una durata di circa 7 minuti, l’essiccatura
(10 minuti a 65°C), la colorazione del gel, la decolorazione, l’essiccatura finale e la lettura su uno
scanner densitometrico (Hyrys™, Sebia, Versione 4.16) a 570 nm.
La composizione del kit di reattivi Hydragel Protein(e) comprende: delle strisce tamponate pronte
all’uso (le quali hanno il compito di riserva di tampone per l’elettroforesi ed assicurano il contatto
tra il gel e gli elettrodi (pH 9.2 ± 0.3), un flacone da 10 mL di colorante Amidoschwarz concentrato
(soluzione acida a pH 2; ad una concentrazione di 4 g/L), etilene-glicolo (6.7%, diluente per la
soluzione colorante concentrata), gli applicatori per il siero, i filtri e le carte assorbenti, e 10 gel
d’agarosio pronti all’uso. Ogni gel contiene 8 g/L d’agarosio e del tampone Tris-barbital ad un pH
di 9.2 ± 0.1. Gli altri reattivi necessari sono una soluzione di decolorazione contenente 0.5 g/L di
acido citrico (da diluire 1:1'000 con acqua distillata: portare 5 mL di soluzione concentrata in 5 litri
con acqua distillata), una soluzione di lavaggio Hydrasys™ (tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 e sodio
azide 0.625%), del Fluidil™ (Sebia, reattivo di composizione protetta e da acquistare separatamente)
per il trattamento dei campioni viscosi o torbidi, e infine acqua distillata per le diluizioni.
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Le immunofissazioni sono realizzate su dei gel Hydragel 4 IF™, Sebia. Ogni gel contiene: 8 g/L
d’agarosio e del tampone Tris-barbital, ad un pH di 8.8 ± 0.1. La composizione del kit di reattivo
Hydragel 4 IF™ comprende: 10 gel d’agarosio, delle strisce tamponate, del colorante
Amidoschwarz, del colorante violetto acido (2 g/L di violetto acido, 10% di acido acetico), del
diluente (tampone alcalino pH 8.0 ± 0.3, blu di bromofenolo), un fissatore e gli anti-sieri
(contenenti delle immunoglobuline totali di mammifero anti-globuline umane), e dei filtri
assorbenti. Gli altri reattivi necessari sono: una soluzione decolorante (acido citrico: 0.5 g/L da
diluire 1:1'000 con acqua distillata), una soluzione di lavaggio (tampone alcalino a pH 8.8 e sodio
azide: 0.625%), del Fluidil™ e dell’acqua distillata per le diluizioni.
3.3 RACCOLTA DEI CAMPIONI
I campioni impiegati nella comparazione degli apparecchi provengono dalla routine interna del
laboratorio Viollier (Allschwil, BL), il quale raccoglie i campioni provenienti dalle sue sedi minori
in tutta la Svizzera (vedi allegato 1). I materiali utilizzati sono campioni di siero raccolti in provette
senza anticoagulanti e centrifugati presso le varie sedi dove viene effettuato il prelievo, e spediti
successivamente nella sede centrale. Nella sede di Allschwil essi vengono centrifugati per 10 minuti
a 3000 g a 25°C. Nell’arco di 2 mesi, 285 campioni della routine sono stati processati lo stesso
giorno, prima sul sistema Hydrasys™ e succecssivamente sull’apparecchio Capillarys™ 2. La scelta
dei campioni per le analisi di comparazione è stata completamente randomizzata. In 173 campioni
l’albumina è stata quantificata, sull’apparecchio Cobas Integra™ 800 (Roche Diagnostics,
Rotkreuz), con metodo facente capo al verde di bromocresolo, nel reparto di automazione del
laboratorio, ed i valori sono stati comparati con quelli dell’albumina ottenuta con il sistema
capillare e rispettivamente su gel d’agarosio. I risultati sono stati analizzati mediante regressione
lineare.
3.3.1 DETERMINAZIONE DEI VALORI di riferimento
Per la determinazione dei valori di riferimento sono stati presi in considerazione dei campioni
(n = 100) aventi un tracciato elettroforetico su gel d’agarosio normale (valori in %: albumina 55-73,
α1 1.6-3.4, α2 7.5-13.5, β 7.4-13.2 e γ 7.2-20), proteine totali comprese tra 60 e 80 g/L, albumina tra
37 e 51 g/L, IgG tra 6.64 e 14.94 g/L, IgA tra 0,57 e 3.24 g/L e IgM tra 0.39 e 1.57 g/L. I campioni
processati tramite elettroforesi su gel d’agarosio, che presentavano un tracciato elettroforetico e
delle proteine totali normali, sono stati processati con l’elettroforesi capillare; successivamente,
sempre nello stesso giorno, sono state eseguite le analisi delle immunoglobuline e dell’albumina. I
campioni che presentavano dei valori patologici sono poi stati scartati, dato che per questo studio
vengono presi in considerazione solo i campioni che presentano dei valori normali per i parametri
sopra menzionati. La distribuzione delle età dei pazienti presi in considerazione variano dai venti
agli ottanta anni, con una media (n = 100) di 56 anni. Per l’analisi dei valori normali, le
immunoglobuline (IgG, IgA e IgM) sono state determinate tramite analisi di turbidimetria (Cobas
Integra™ 800) sui campioni di siero. Mentre l’albumina è stata determinata con il metodo del verde
di bromocresolo, sempre sull’apparecchio Cobas Integra™ 800.
3.3.2 STUDIO DELLA PRECISIONE
Lo studio della riproducibilità nella serie (3 x 10 n), di giorno in giorno (4 x 10 n) e per la
riproducibilità dei capillari, è stato effettuato utilizzando 4 tipi di campioni diversi:
•
un siero di controllo di qualità liofilizzato della ditta Sebia (lot: 01045/01, scd: 04/2009, vedi
allegato 12): quattro flaconi di siero di controllo liofilizzato sono stati ricostituiti aggiungendo
1 mL di acqua distillata per ogni campione. Essi sono stati lasciati ricostituire per 30 minuti, al
termine dei quali i quattro sieri sono stati uniti in un unico pool. Da questo pool sono state
eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna, in piccole microprovette eppendorf da 1.5 mL. 10
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aliquote sono state analizzate in un'unica mattina al fine di determinare i valori per la ripetibilità
nella serie. Successivamente le 10 aliquote sono state poste in frigorifero a 2-8°C e sono state
rianalizzate successivamente, una dopo l’altra in 10 giorni non consecutivi, nell’arco di 16
giorni, per determinare la precisione di giorno in giorno e stabilire così gli effetti della
conservazione del siero a temperatura di 4°C. Le altre 10 aliquote sono state congelate a -20°C e
anch’esse, sono state analizzate, nell’arco di 16 giorni, per l’analisi della riproducibilità di
giorno in giorno. Per l’analisi della riproducibilità degli 8 capillari, sono state preparate 8
aliquote di controllo di qualità, tramite la ricostituzione di altri 2 flaconi di controllo liofilizzato.
Queste aliquote sono state processate contemporaneamente sugli 8 capillari, 3 volte nella stessa
giornata.
•
due pool normali (1 e 2) diversi ottenuti mischiando dei sieri che presentavano un tracciato
elettroforetico su gel d’agarosio normale, valori delle proteine totali compresi tra 60 e 80 g/L,
albumina tra 37 e 51 g/L, IgG tra 6.64 e 14.94 g/L, IgA tra 0,57 e 3.24 g/L e IgM tra 0.39 e 1.57
g/L. Sono state eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna, del pool normale 1. 10 aliquote sono
state analizzate, nella stessa giornata, per la determinazione della precisione nella serie, mentre
le altre 10 aliquote sono state congelate a -20°C ed analizzate una dopo l’altra, in 10 giorni non
consecutivi, nell’arco di 16 giorni totali, per la determinazione della precisione di giorno in
giorno. Per l’analisi della riproducibilità dei capillari si è utilizzato il pool normale 2. Sono state
preparate 32 aliquote di 200 µL ciascuna: le prime 8 sono state analizzate contemporaneamente
sugli 8 capillari, mentre le rimanenti sono state congelate a -20°C. Nei 3 giorni consecutivi
seguenti, sono state scongelate 8 aliquote per giorno, e analizzate sugli 8 capillari
simultaneamente.
•
un pool patologico, creato in laboratorio, aggiungendo al siero di un paziente con una
gammopatia monoclinale di tipo IgG/K, un pool di sieri normali provenienti dalla routine del
laboratorio e aventi proteine, albumina e immunoglobuline normali (ambiti normali come sopra
citati): sono state eseguite 20 aliquote, da 200 µL ciascuna. 10 aliquote sono state analizzate,
nella stessa giornata, per la determinazione della precisione nella serie, mentre le altre 10
aliquote sono state congelate a -20°C ed analizzate una dopo l’altra, in 10 giorni non
consecutivi, nell’arco di 16 giorni totali, al fine di determinare i parametri della precisione di
giorno in giorno.
Lo scongelamento dei campioni da analizzare è stato effettuato togliendoli dal congelatore 30
minuti prima di effettuare l’analisi, e mescolate delicatamente sul vortex.
Tabella 1: Riassunto dell’utilizzo dei vari campioni nello studio della precisione dell’apparecchio Capillarys™ 2
Campione
di
controllo
4 flaconi da
1 mL
20
aliquote
2 flaconi da
1 mL
8 aliquote
Pool
normale 1
Pool di sieri
20
aliquote
Pool
patologico
Pool di sieri
Pool
normale 2
Pool di sieri
20
aliquote
32
aliquote
10 aliquote
Precisione nella serie
Precisione di giorno in
giorno (congelate a 4°C)
10 aliquote
Precisione di giorno in giorno
(congelate a -20°C)
10 analisi in 10 giorni non
consecutivi (16 giorni totali)
Precisione capillari
3 volte nella stessa giornata
10 aliquote
Precisione nella serie
10 aliquote
Precisione di giorno in giorno
(congelate a -20°C)
10 aliquote
Precisione nella serie
10 aliquote
8 aliquote
24 aliquote
Precisione di giorno in giorno
(congelate a -20°C)
8 analisi simultanee sugli 8
capillari
8 analisi simultanee per 3
giorni consecutivi
10 analisi nella stessa
giornata
10 analisi in 10 giorni non
consecutivi (16 giorni totali)
10 analisi nella stessa
giornata
10 analisi in 10 giorni non
consecutivi (16 giorni totali)
Campione fresco
Campione congelato a -20°C
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3.4 Strumenti analizzati
Per l’esecuzione del mio lavoro di diploma ho utilizzato principalmente tre tipi di apparecchi. Per
l’elettroforesi capillare ho utilizzato lo strumento Capillarys™ 2, della ditta Sebia (Francia). Per
l’elettroforesi su gel d’agarosio lo strumento Hydrasys™ sempre della ditta Sebia (Francia)
combinato con l’apparecchio densitometrico Hyrys™(Sebia, Francia). Per la determinazione dei
valori dell’albumina, delle proteine totali, e delle immunoglobuline (IgA, IgG ed IgM), dati
utilizzati per la determinazione dei valori normali e per la comparazione della quantificazione
dell’albumina, lo strumento utilizzato è il Cobas Integra™ 800, della ditta Roche Diagnostics
(Rotkreuz, Svizzera).
3.5 ANALISI DEI COSTI
I costi dei due metodi di analisi sono stati stimati confrontando il prezzo di listino, fornito dalla
ditta MEDIM Schweiz GmbH (Medical Diagnosic Products, Zugo), rappresentate in Svizzera della
ditta Sebia. Il prezzo unitario dell’analisi, con l’apparecchio Capillaris™2 e con l’apparecchio
Hydrasys™, è stato determinato prendendo in considerazione il prezzo totale del kit di analisi per i
due sistemi ed il numero totale di analisi che si possono effettuare con il rispettivo kit. Per l’analisi
dell’ammortamento della spesa d’acquisto dell’apparecchio Capillarys™ 2, è stato preso in
considerazione il prezzo dell’apparecchio (corrispondente a CHF 96'000.--, più CHF 6'000.-- per il
PC, il monitor e la stampante) su un periodo di 10 anni. I giorni lavorativi di un anno sono stati
calcolati (giorni festivi non considerati nel calcolo) a partire da 52 settimane annuali, composte da 5
giorni lavorativi, per un totale di 260 giorni all’anno.
3.6 STATISTICA
La raccolta dei dati, sia per l’analisi di comparazione, della determinazione dei valori normali e
per l’analisi della riproducibilità è stata eseguita tramite la creazione di una tabella di raccolta dati
con il programma Microsoft Office Excel 2003. Le analisi statistiche sono state eseguite con
l’utilizzo del programma Analyse-it™ (General + Clinical Laboratori 1.71), per quanto riguarda la
verifica dei valori normali in elettroforesi capillare e per la comparazione dei dati nella
determinazione dell’albumina. Le rette di regressione lineare sono state ottenute tramite il
programma Microsoft Office Excel e sono state usate per la valutazione analitica dell’elettroforesi
capillare comparata con la tecnica di elettroforesi su gel d’agarosio. Media, Deviazione Standard e
Coefficiente di variazione (CV) sono stati calcolati per la valutazione della precisione
dell’apparecchio Capillarys™ 2.
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4. RISULTATI
Un tipico grafico di una migrazione
elettroforetica, ottenuto tramite lo strumento
Capillarys™ 2 è illustrato nella figura 5. Il
profilo elettroforetico è molto simile a quello
ottenuto con un’elettroforesi su gel
d’agarosio. Come si può vedere nella figura 6,
sono stati messi a confronto i tracciati di un
campione normale fatto migrare sui due
sistemi elettroforetici. La differenza più
marcata tra i due tracciati è osservabile nella
regione delle β-globuline, dove la maggiore
risoluzione del sistema di elettroforesi
capillare permette una separazione di questa
regione in due frazioni: β1- e β2-globuline.
Inoltre la regione delle γ-globuline appare,
nella maggior parte dei casi, più stretta
nell’elettroforesi capillare rispetto a quella
ottenuta su gel d’agarosio. La fondamentale
differenza fra i due metodi risiede nella
modalità di migrazione. Nell’elettroforesi
capillare l’ultima frazione ad essere
determinata è l’albumina. Grazie all’azione
del flusso elettroendo-osmotico le proteine
sieriche vengono trascinate attraverso il
capillare fino alla finestra di misurazione
nell’ordine inverso rispetto alla loro mobilità
elettroforetica convenzionale.
Figura 5: Tipico profilo elettroforetico ottenuto con lo
strumento Capillarys™ 2. Frazione per frazione sono
anche riportate le principali proteine sieriche (1)
a
Regione
beta
globuline
Regione
gamma
globuline
b
Regione
beta
globuline
Regione
gamma
globuline
Figura 6: Tracciato elettroforetico, dello stesso campione di siero, ottenuto con lo strumento Capillarys™ 2 (a),
programma Phoresis, e con lo strumento Hyrys, Sebia (b), Versione 4.16.
4.1 PRECISIONE (IMPRECISIONE)
I risultati dello studio della precisione ottenuti sono riportati nelle tabelle 2 e 3. Nella tabella 2
vengono riportati i risultati dell’imprecisione nella serie (ripetibilità, vedi allegati 7 e 8), ottenuti
misurando 10 volte nella stessa giornata tre campioni: un di controllo di qualità, un campione di
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siero normale (pool normale 1) ed un campione patologico (pool) che presenta una gammopatia
monoclonale (IgG/K).
Tabella 2: Risultati dello studio di precisione per il Capillarys™ 2 usando tre tipi
di campione
Imprecisione nella serie (n=10; ripetibilità)
Frazione
Albumina
Media, %
CV (nella serie), %
α1-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
α2-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
β1-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
β2-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
γ-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
Campione CQ,
n = 10
Pool normale,
n = 10
Pool Patologico,
n = 10
62.3
0.69
63.6
0.63
53.4
0.72
4.2
2.20
4.1
3.64
3.82
3.66
9.07
1.80
9.5
1.4
8.74
2.76
6.13
1.55
6.32
1.25
5.49
2.91
4.28
1.48
4.12
3.2
3.28
4.72
14.0
1.67
12.4
1.13
25.3
0.63
Nella tabella 3, sono riportati i risultati dell’imprecisione di giorno in giorno su 4 campioni
differenti: un controllo di qualità conservato a -20°C, lo stesso campione di qualità ma conservato
in frigorifero a 4°C, un campione normale 1 conservato a -20°C e un campione patologico
conservato a -20°C (vedi allegati 5 e 6).
Tabella 3: Risultati dello studio di precisione per il Capillarys™ 2 usando 4 tipi di campione
Imprecisione di giorno in giorno (n=10; riproducibilità)
Frazione
Albumina
Media, %
CV (nella serie), %
α1-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
α2-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
β1-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
β2-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
γ-globuline
Media, %
CV (nella serie), %
CQ
conservato a -20°C
n = 10
CQ
conservato a 4°C,
n = 10
Pool normale
conservato a -20°C,
n = 10
Pool patologico,
conservato a -20°C,
n = 10
62.6
0.47
63.4
0.60
63.6
0.54
53.1
0.65
4.16
2.32
3.94
3.21
4.05
2.10
3.83
2.48
9.01
0.97
8.6
2.05
9.6
1.39
9.03
1.65
6.12
1.50
6.2
1.70
6.36
1.33
5.59
2.45
4.18
2.47
4.16
3.04
4.14
2.60
3.14
3.42
13.9
1.81
13.7
1.76
12.2
1.91
25.3
0.66
Prima dell’analisi dell’imprecisione, nella serie e di giorno in giorno, è stata anche verificata
l’imprecisione dei capillari, al fine di determinare se gli otto capillari dello strumento misurano
nello stesso modo, e danno dei risultati riproducibili. I risultati ottenuti su un campione di siero
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
(pool normale 2), che non mostra una gammopatia monoclonale, sono riportati nella tabella 4 (vedi
allegato 9). Si può notare che per la frazione dell’albumina il capillare con una maggiore
riproducibilità risulta essere il capillare 7 (CV = 0.16%), mentre il meno preciso è il capillare 5 (CV
= 0.79). Per quanto riguarda la frazione delle γ-globuline i CV variano da 0.69%, del capillare 7, a
2.72% del capillare 8. Per le altre frazioni i CV variano da 0.46% a 6.21%.
Tabella 4: Risultati dello studio della precisione dei capillari tramite l’analisi di un campione normale nell’arco di 4
giorni consecutivi.
ALBUMINA
n=4
Capillare Media DS
CV
1
63.1
0.30
0.48
2
62.4
0.41
0.66
3
62.5
0.26
0.41
4
61.7
0.13
0.21
5
62.2
0.49
0.79
6
62.3
0.32
0.51
7
62.4
0.10
0.16
8
61.8
0.17
0.28
TOT
62.3 (media) 0.4
α1-globuline
n=4
Capillare Media DS
CV
1
4.1
0.08
1.99
2
4.1
0.14
3.45
3
4.1
0.08
1.99
4
4.3
0.10
2.24
5
4.2
0.13
3.01
6
4.1
0.05
1.21
7
4.2
0.10
2.29
8
4.3
0.13
3.04
TOT
(media) 2.4
4.2
α2-globuline
n=4
Capillare Media DS
CV
1
11.6
0.05
0.43
2
11.8
0.21
1.77
3
11.8
0.13
1.10
4
12.0
0.13
1.05
5
11.8
0.08
0.69
6
11.9
0.10
0.84
7
11.7
0.14
1.21
8
11.8
0.10
0.81
TOT
11.8 (media) 1.0
β1-globuline
β2-globuline
γ globuline
n=4
Capillare Media DS
CV
1
5.7
0.06
1.02
2
5.7
0.14
2.48
3
5.7
0.10
1.67
4
5.8
0.10
1.64
5
5.8
0.10
1.74
6
5.8
0.17
2.96
7
5.8
0.05
0.87
8
6.0
0.10
1.68
TOT
(media) 1.8
5.8
n=4
Capillare Media DS
1
4.0
0.10
2
4.1
0.25
3
4.0
0.17
4
4.1
0.17
5
4.2
0.21
6
4.1
0.17
7
4.1
0.08
8
4.2
0.10
TOT
(media)
4.1
CV
2.38
6.21
4.38
4.28
4.94
4.19
1.99
2.27
3.8
n=4
Capillare Media DS
CV
1
11.6
0.24
2.06
2
12.0
0.10
0.80
3
12.0
0.10
0.80
4
12.2
0.10
0.79
5
11.9
0.15
1.26
6
11.9
0.22
1.82
7
11.9
0.08
0.69
8
12.0
0.33
2.72
TOT
11.9 (media) 1.4
4.2 RISULTATI DELLE COMPARAZIONI
I risultati della comparazione dei metodi di quantificazione delle frazioni proteiche (n = 285) sono
presentati nella tabella 5 (Rappresentazioni grafiche, vedi allegati 3 e 4). Non si osservano
variazioni tra i due metodi per quanto riguarda la frazione dell’albumina e quella γ-globulinica (r >
0.97). Nonostante una correlazione di r = 0.96, per la frazione delle α1-globuline, si nota un errore
sistematico, il quale provoca dei risultati aumentati, nell’elettroforesi capillare, in media dell’1.6%
(1.1 g/L). La frazione delle β-globuline denota, invece, un coefficiente di correlazione inferiore alle
altre frazioni (r = 0.73).
Tabella 5: Metodo di comparazione per la quantificazione
delle frazioni proteiche
Capillarys vs. Hydrasys
Frazione
Albumina
Alfa1-globuline
Comparazione dati in %
Regressione lineare (n=285)
r = 0.97
Differenze medie g/L
-1.7 (da -6.8 a 5.6)
r = 0.96
1.1 ( da 0.3 a 2.6)
Αlfa2-globuline
r = 0.92
-0.4 (da -2.2 a 1.3)
Βeta-globuline
r = 0.73
0.1 (da -4.2 a 4.3)
Gamma-globuline
r = 0.98
0.9 (da -3.9 a 4.3)
Tabella 2: Risultati ottenuti nella comparazione tra i
risultati misurati con il sistema capillare e con quello di
elettroforesi su gel d’agarosio. I dati sono stati calcolati
tramite regressione lineare tra i valori ottenuti. I
risultati mostrano dei coefficienti di correlazione per le
frazioni proteiche superiori allo 0.90, tranne per la
frazione delle β-globuline (r = 0.73).
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La figura 7 mostra la rappresentazione grafica della comparazione tra i due sistemi (regressioni
lineari) per le 5 frazioni elettroforetiche su un totale di 285 campioni analizzati.
Figura 7: Grafici dello studio della
comparazione tra il sistema capillare
(asse delle ordinate) e quello su gel
d’agarosio (asse delle ascisse), per le
varie frazioni elettroforetiche (n =
285)
È stata inoltre effettuata una comparazione tra i due metodi per quanto riguarda la determinazione
della frazione dell’albumina. Nella figura 8 si possono notare i grafici delle rette di regressione
lineare ottenute tramite la comparazione del sistema capillare e quello su gel d’agarosio. Per quanto
riguarda la comparazione dei valori in % è stato ottenuto un coefficiente di correlazione di 0.93,
mentre per i valori in g/L il coefficiente di correlazione è di 0.96.
Figura 8: Grafici di comparazione per la determinazione dell’albumina tra elettroforesi su gel di agarosio (ascissa) e
quella capillare (Capillarys™ 2) (ordinata). Nel grafico a) la comparazione tra i due metodi è stata eseguita con valori
espressi in g/L mentre il grafico b) è stato ottenuto con i valori espressi in %. Nel grafico viene inoltre riportato il valore
del coefficiente di variazione, per le due comparazioni. I campioni analizzati sono 173.
Si nota una differenza per quanto riguarda la
frazione dell’albumina, se la determinazione
dell’albumina (in g/L), con il sistema su gel
d’agarosio e capillare, viene comparata con la
determinazione dell’albumina con il metodo
del verde di bromocresolo (Cobas Integra™
800), metodo di riferimento attualmente in
uso presso il laboratorio. La figura 9 illustra
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una
comparazione
descrittiva
delle
misurazioni dell’albumina in g/L sui tre
sistemi; mentre nella figura 10 si possono
osservare due grafici (bias plot) che
rappresentano la comparazione tra la
determinazione dell’albumina in g/L con il
metodo del verde di bromocresolo e
rispettivamente con l’elettroforesi su gel
d’agarosio (a) e con il Capillarys™ 2 (b). Per
quanto riguarda la determinazione con il
sistema capillare si ottiene un errore
sistematico di 0.7%, mentre l’errore aumenta
al 2.32% con il sistema su gel d’agarosio.
Figura 9 (a fianco): Rappresentazione grafica dei
valori, in g/L, dell’albumina, misurati con il metodo del
verde di bromocresolo (Cobas Integra 800) (a), con il
sistema dell’elettroforesi su gel d’agarosio (b) e
capillare (c)
Figura 10: (a) Grafico di comparazione (bias plot) tra il sistema Cobas Integra™ 800 e l’elettroforesi su gel d’agarosio
per la determinazione dell’albumina (risultati espressi in g/L – sull’ordinata è espressa la differenza tra la misurazione
con il sistema su gel d’agarosio e con il Cobas Integra™ 800), (b) Grafico di comparazione (bias plot) tra il sistema
Cobas Integra™ 800 e l’elettroforesi capillare per la determinazione dell’albumina (risultati espressi in g/L –
sull’ordinata è espressa la differenza tra la misurazione con il sistema capillare e con lo strumento Cobas Integra™ 800)
Nella tabella 6 sono riportati I risultati per i
valori di riferimento ottenuti sull’apparecchio
Capillarys™ 2, a partire da una popolazione
di individui (n = 100), che non mostrano
paraproteinemie o altre alterazioni proteiche.
La distribuzione delle età delle persone prese
in considerazione per lo studio è raffigurata
nella figura 11. L’età media dei pazienti è
circa 56 anni, mentre l’arco degli anni delle
persone spazia da 20 ad 80 anni. Non sono
state effettuate delle distinzioni tra uomini e
donne.
Figura 11: Distribuzione delle età dei pazienti presi in
considerazione per l’analisi dei valori normali
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
Tabella 6: Valori di riferimento in % e in g/L per lo strumento Capillarys™ 2 determinati a partire da una popolazione di
100 campioni normali, confrontati con quelli forniti dalla ditta Sebia (Francia) e quelli in vigore per l’elettroforesi su gel
d’agarosio
Viollier, elettroforesi
Sebia (Francia),
Valori ottenuti
sistema capillare
su gel d’agarosio
Frazione
Albumina
α1-globuline
α2-globuline
β-globuline
β1-globuline
β2-globuline
γ-globuline
Valori in %
56.0 – 69.0
2.7 – 5.4
6.5 – 13.2
8.1 – 12.2
4.6 – 6.9
2.8 – 5.9
9.6 – 17.5
Valori in g/L
37.1 – 50.1
1.9 – 3.7
4.6 – 9.1
5.6 – 8.5
3.2 – 4.9
2.0 – 4.1
6.4 – 12.5
Valori in %
55.8 – 66.1
2.9 – 4.9
7.1 – 11.8
7.9 – 13.7
4.7 – 7.2
3.2 – 6.5
11.1 – 18.8
Valori in %
55.0 – 73.0
1.6 – 3.4
7.5 – 13.5
7.4 – 13.2
7.2 – 20
Nella tabella 7 sono riportati i risultati delle immunofissazioni (Immunotyping) eseguite nell’arco
dello sviluppo del lavoro di diploma, effettuate per prendere confidenza con l’apparecchio
Capillarys™ 2 (n = 36).
Tabella 6: Confronto della determinazione delle componenti monoclonali tramite esecuzione dell’immunotyping,
sull’apparecchio Capillarys™ 2, e dell’immunofissazione, sull’apparecchio Hydrasys™ per l’elettroforesi su gel
d’agarosio (n = 36)
Numero di campioni
12
9
6
2
1
1
1
2
2
Risultati immunotyping
Negativa
Positiva IgG/Lambda
Positiva IgG/Kappa
Positiva IgA/Kappa
Positiva IgA/Lambda
Positiva IgM/Kappa
Positiva IgM/Lambda
Positiva
Negativa
Risultati immunofissazione
Negativa
Positiva IgG/Lambda
Positiva IgG/Kappa
Positiva IgA/Kappa
Positiva IgA/Lambda
Positiva IgM/Kappa
Positiva IgM/Lambda
Banda debole non indagata
Banda debole
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5. DISCUSSIONE
Lo strumento Capillarys™ 2 fa parte della seconda generazione di apparecchi automatici
multicapillari per l’analisi delle proteine sieriche. Grazie alla sua completa automazione (lettura del
codice a barre, diluizione, migrazione e quantificazione) non richiede nessuna manipolazione
tecnica da parte del personale, a partire dall’inserimento del campione fino all’ottenimento dei
grafici della separazione elettroforetica.
5.1 PRECISIONE
Prima di procedere all’analisi della riproducibilità sul Capillarys™ 2, sono stati eseguiti dei
controlli di precisione, tramite l’utilizzo di un pool normale, al fine di determinare la riproducibilità
degli 8 capillari dello strumento. Le analisi sono state eseguite utilizzando un siero congelato (pool
normale 2) per 3 giorni consecutivi. I risultati indicano che gli otto capillari hanno una
riproducibilità variabile. Si può notare che il capillare con delle variazioni maggiori risulta essere il
capillare 2. In questo capillare i CV delle varie frazioni elettroforetiche sono sempre superiori ai CV
medi delle rispettive frazioni, tranne per la frazione delle γ-globuline, dove il CV, misurato in
questo capillare, risulta inferiore alla media ed alle altre misurazioni delle γ-globuline sugli altri
capillari. Il capillare che fornisce risultati più ripetibili è il capillare 7. Si può notare inoltre che i CV
più elevati si osservano per la frazione delle β2-globuline, con una variazione dei CV da 1.99%, del
capillare 7, e il 6.21% del capillare 2. La media dei CV sugli 8 capillari, per la frazione delle β2globuline è di 3.8%.
La stessa comparazione è stata eseguita su un siero di controllo, il quale è stato analizzato 3 volte
nella stessa giornata, sugli 8 capillari. Questo studio fornisce dei risultati non propriamente simili a
quelli ottenuti con il pool normale 2. Il capillare più ripetibile, con il siero di controllo, risulta essere
il capillare 6, tranne per la frazione delle α2-globuline, mentre il capillare meno ripetibile risulta
essere proprio il capillare 7, con dei CV che variano da 1.10% a 5.4% (sulla base di analisi
effettuate in laboratorio, vedi allegato 10). Per questo studio sono comunque stati presi in
considerazione i risultati ottenuti con il pool normale 2, poiché esso rispecchia stessa matrice dei
campioni dei pazienti.
I risultati dell’imprecisione nella serie forniscono dei CV, per l’albumina < 1.0%, per le γglobuline < 1.7% e < 5% per le altre frazioni elettroforetiche. I risultati ottenuti, nel nostro
laboratorio, sono migliori dei risultati riportati in letteratura (11-13), ma comparabili per quanto
riguarda i dati forniti dalla ditta Sebia, concernenti il kit Protein(e) 6 (CV albumina < 1.0%, per le
γ-globuline < 1.7% e < 4% per le altre frazioni elettroforetiche) (1). Questo sta ad indicare che lo
strumento Capillarys™ 2 possiede riproducibilità superiori rispetto agli strumenti di generazioni
precedenti come il Capillarys (CV albumina < 2.6%, per le γ-globuline < 2.7% e < 7% per le altre
frazioni elettroforetiche) (11), o altri strumenti di elettroforesi capillare (come per esempio il
CZE™2000 della ditta Beckman Coulter: CV albumina < 2.5%, per le γ-globuline < 6.8% e < 10%
per le altre frazioni elettroforetiche) (12). Inoltre il Capillarys™ 2 è più preciso rispetto ai metodi di
elettroforesi convenzionali su gel (gel d’agarosio o acetato di cellulosa). Kahn e Strony (15)
riportano dei CV che variano da 2.9% per l’albumina sierica, a 9.5% per la frazione delle α1globuline, mentre Baars e Lombarts, per le stesse frazioni, osservarono dei CV tra 4% e 32%, ed
enfatizzando la dipendenza del risultato dell’elettroforesi su gel con le capacità tecniche
dell’operatore che esegue l’analisi (16).
Per quanto riguarda l’imprecisione di giorno in giorno si sono ottenuti i seguenti di CV: per la
frazione dell’albumina, dei CV di 0.47% con il controllo di qualità conservato in congelatore, un
valore di 0.60% con il controllo di qualità conservato in frigorifero, di 0.54% con il pool normale 1
conservato in congelatore e di 0.65% con il pool patologico, sempre conservato in congelatore a 20°C. Invece per la frazione delle γ-globuline, abbiamo ottenuto i seguenti CV: un valore di 0.66%
con il pool patologico, di 1.81% con il controllo di qualità conservato in congelatore, di 1.76% con
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
il controllo di qualità conservato in frigorifero e di 1.91% per il pool normale 1 conservato in
congelatore. Per le altre frazioni elettroforetiche, considerando solamente i campioni conservati in
congelatore nell’arco di 16 giorni, sono stati ottenuti dei CV < 2.48% per la frazione delle α1globuline, < 1.65% per quella delle α2-globuline, < 2.45% per le β1-globuline e
< 3.42% per le β2-globuline. Si nota che, considerando i risultati ottenuti con i controlli di qualità, i
valori sono più riproducibili se conservati a -20°C, piuttosto che a 2-8°C. Inoltre per le frazioni più
piccole (α1-globuline, α2-globuline, β1-globuline, β2-globuline), i CV sono maggiori nel campione
patologico rispetto agli altri campioni, sempre conservati in congelatore; mentre la determinazione
della frazione delle γ-globuline risulta più precisa, rispetto agli altri campioni analizzati (controllo
di qualità, conservato a 4°C e congelato, e al pool normale 1 congelato).
5.2 COMPARAZIONI
Le rette di regressione, per le varie frazioni elettroforetiche hanno dato dei coefficienti di
correlazione che sono riportati nella tabella 5. Lo studio effettuato ha riscontrato un coefficiente di
correlazione per la frazione dell’albumina, con valori espressi in percentuale, pari a 0.97. Questo
valore risulta simile a quanto riscontrato in bibliografia, come si può notare nella tabella 7. La stessa
considerazione vale anche per la frazione delle γ-globuline.
Tabella 7: tabella che mostra i coefficienti di correlazione per le 6 maggiori frazioni elettroforetiche, ottenuti nello
studio (prima colonna) e quelli riscontrati in bibliografia
Capillarys™ 2 Ditta Sebia (Francia). Capillarys™
Capillarys™
Paragorn CZE®2000
vs. Hydrasys- Capillarys™ vs. AGE vs. Hydrasys- vs. Hydrasys- vs. Hydrasys-Hyrys®
Hyrys®
(1)
Hyrys® (11)
Hyrys® (14)
(12)
Frazione
Albumina
α1-globuline
α2-globuline
β1-globuline
β2-globuline
γ-globuline
0.97
0.96
0.92
0.73
0.98
Coefficiente di correlazione = r, (valori analizzati in %)
0.97
0.99
0.95
0.97
0.84
0.79
0.95
0.94
0.91
0.85
0.82
0.79
0.97
0.97
0.99
0.97
0.98
0.76
0.90
0.65
0.98
Si osservano invece delle differenze nella misurazione della frazione delle α1-globuline. Il
coefficiente di correlazione per questa frazione risulta di r = 0.96. Il dato più importante che si
estrapola dal grafico di correlazione lineare per questa frazione (figura 7), è l’aumento medio di
circa il 150% dei i valori misurati con il Capillarys™ 2, rispetto a quelli misurati con il sistema di
elettroforesi su gel d’agarosio. Nella letteratura sono riportati degli studi che mostrano risultati
simili con altri apparecchi di elettroforesi capillare, come il CZE™2000 (circa 100% di differenza
(13)) e anche con la prima versione dell’apparecchio Capillarys™ (circa il 200% di differenza (11)).
Queste osservazioni impongono pertanto una correzione o una nuova determinazione dei valori di
riferimento per quanto riguarda l’apparecchio di elettroforesi capillare. L’aumento della frazione
delle α1-globuline nell’elettroforesi capillare è dovuto essenzialmente a due motivi:
•
Il primo motivo è legato alla presenza di gruppi acidi nella proteina α1-glicoproteina acida, i
quali interferiscono con il legame dei coloranti usati per la quantificazione delle proteine nei
sistemi di elettroforesi su gel d’agarosio. Il metodo di determinazione UV, utilizzato dallo
strumento Capillarys™ 2, non è condizionato dalla presenza di questi gruppi acidi, e dunque
esso determina valori superiori i rispetto all’elettroforesi su gel.
•
Il secondo motivo è che la determinazione delle proteine a 200 nm offre una migliore
determinazione dell’orosomucoide, il quale è difficilmente quantificabile con le tecniche di
colorazione (13,17).
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
Inoltre si può osservare una correlazione, per quanto riguarda la frazione delle β-globuline,
inferiore rispetto alle altre frazioni. Per questa frazione si osserva un coefficiente di correlazione di
0.73, che nell’elettroforesi capillare può essere causato dallo spostamento della zona di migrazione
di alcune componenti quali le lipo-proteine, dalla zona β, nell’elettroforesi su gel, alla zona α/β,
finanche alla zona dell’albumina. In aggiunta, questo risultato può essere spiegato dalla
composizione del tampone utilizzato nell’elettroforesi capillare e dalla diversa risoluzione delle due
tecniche, che causano la divisione in due zone della frazione delle β-globuline.
La correlazione tra i due sistemi, per quanto riguarda la frazione delle γ-globuline, frazione
maggiormente coinvolta nella medicina di laboratorio per la diagnosi della maggior parte delle
gammopatie monoclonali, offre un coefficiente di correlazione di 0.98 per i risultati in % (r = 0.99
per i risultati espressi in g/L). Dunque possiamo dire che non esistono delle differenze per quanto
riguarda la frazione delle γ-globuline tra il sistema Hydrasys™-Hyrys e quello dell’elettroforesi
capillare, con lo strumento Capillarys™ 2.
Un coefficiente di correlazione di 0.93 è stato riscontrato tra la determinazione dei valori
dell’albumina in %, con il sistema dell’elettroforesi su gel d’agarosio e quella capillare (r = 0.96 per
i valori in g/L, vedi figura 8). La figura 9 mostra una rappresentazione grafica dei valori
dell’albumina in g/L determinati sui tre sistemi (Cobas Integra™ 800, Capillarys™ 2 e Hydrasys™Hyrys), e si può osservare direttamente come i valori determinati con il sistema dell’elettroforesi
capillare si avvicinano maggiormente a quelli ottenuti con il metodo del verde di bromocresolo
(Cobas Integra 800), rispetto alla determinazione con il sistema su gel d’agarosio. Sempre questa
figura si può inoltre osservare che, sia con l’elettroforesi capillare e sia con l’elettroforesi su gel
d’agarosio, l’albumina risulta sempre più elevata rispetto a quella misurata con il metodo di
riferimento all’interno del laboratorio. L’albumina, sullo strumento Capillarys™ 2, è maggiore in
media di circa il 0.7%, mentre l’albumina determinata con il sistema Hydrasys™-Hyrys presenta un
errore sistematico del 2.3% (considerando un intervallo di confidenza dei valori al 95%). Sono stati
inoltre eseguiti dei grafici di correlazione lineare tra la determinazione dell’albumina, in g/L, con il
metodo del verde di bromocresolo (Cobas Integra™ 800), con i due sistemi elettroforetici.
Confrontando la determinazione dell’albumina con l’elettroforesi capillare con il metodo al verde di
bromocresolo, si ottiene un coefficiente di correlazione di 0.87 (vedi allegato 11). Mentre il
confronto tra la determinazione dell’albumina con l’elettroforesi su gel d’agarosio e la
determinazione con il metodo al verde di bromocresolo, da un risultato di r pari a 0.85 (vedi
allegato 11).
In conclusione, possiamo quindi affermare che i due sistemi sovrastimano il valore dell’albumina
rispetto all’automazione, su Cobas Integra™ 800, ma i valori ottenuti con il Capillarys™2 sono
meglio paragonabili a questi ultimi.
5.3 VALORI DI RIFERIMENTO
Analizzando i campioni di 100 persone che non presentano nessun segno di una gammopatia
monoclonale, e/o altri scompensi proteici nel siero, sono stati ottenuti i valori normali per
l’elettroforesi capillare, che sono riportati nella tabella 6. I valori ottenuti sono confrontabili con
quelli forniti dalla ditta Sebia (vedi tabella 6) (1).
La differenza maggiore nei valori di riferimento tra quelli ottenuti per l’elettroforesi capillare
rispetto ai quelli utilizzati per l’elettroforesi su gel d’agarosio, è riscontrabile nei valori della
frazione delle α1-globuline. I valori ottenuti, oltre che ad essere confrontabili con quelli forniti dalla
ditta Sebia, sono simili a quelli ottenuti e pubblicati da Klein e Jolliff (18), i quali riportano un
ambito normale tra 2.7 e 5.1.
Inoltre in questo studio non è stata verificata la variabilità dopo un cambio di lotto dei reattivi o
dei capillari.
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
5.4 ALTRE CARATTERISTICHE
La maggiore risoluzione dell’elettroforesi capillare, permette la separazione di routine della
frazione β-globuline in β1- e β2-globuline. La separazione in 6 frazioni maggiori permette una più
facile individuazione di componenti monoclonali, presenti in piccole concentrazioni, o la cui
migrazione si è arrestata nella zona beta. Infatti, in una frazione beta unica, componenti come la
transferrina, la componente C3 del complemento o le β-lipoproteine, possono mascherare la
presenza di eventuali picchi monoclinali. Nella elettroforesi capillare la frazione delle β1-globuline
corrisponde alla transferrina, mentre la frazione delle β2-globuline, alla componente C3 del
complemento.
Nei 285 casi analizzati per la comparazione dei metodi, sono state riscontrate, con l’elettroforesi
capillare, due bisalbuminemie (anomalia caratterizzata da una doppia banda dell’albumina osservata
nel tracciato elettroforetico), non ulteriormente indagate e non riscontrate sull’elettroforesi su gel
d’agarosio, probabilmente a causa della minore capacità di separazione rispetto all’elettroforesi
capillare.
Analizzando i vari tracciati elettroforetici, si nota un’ulteriore differenza rispetto al grafico
elettroforetico ottenuto su gel d’agarosio: si osserva un restringimento della frazione gamma a
vantaggio della frazione delle β2-globuline. Questo non ha grande rilevanza da un punto di vista
clinico ma, come pure per lo sdoppiamento della frazione delle β-globuline, ha una rilevanza
analitica nell’interpretazione dei tracciati da parte del personale di laboratorio: essendo abituati ad
analizzare i grafici ottenuti con metodi convenzionali è necessario un breve periodo di adattamento
per l’interpretazione dei nuovi tracciati.
5.4.1 ANALISI DEI TEMPI
Tecniche di separazione convenzionali, che utilizzano una membrana o un gel, hanno lunghi
tempi di analisi e necessitano di conoscenze tecniche e pratiche riguardanti tutte le fasi dell’analisi,
a partire dalla manipolazione del gel, dalla preparazione e ricostituzione del tampone, dalla
preparazione della soluzione di lavaggio e di colorazione, dall’applicazione del campione, dalla
colorazione e misurazione con densitometro. Mediamente sono necessari fino a 90 minuti per
ottenere un tracciato elettroforetico.
È per questo motivo che sono stati sviluppati dei sistemi automatici per ottimizzare il lavoro. Il
Capillarys™ 2 è uno strumento completamente automatizzato che include nanotecnologie e che
esegue contemporaneamente 8 separazioni delle proteine in circa 4 minuti, con un’alta capacità
lavorativa (90 elettroforesi per ora. Per il primo rack, lo strumento impiega circa 13 minuti, mentre
per i rack successivi lo strumento impiega 8 minuti, dato che mentre esegue la migrazione del rack
precedente, contemporaneamente diluisce i campioni di quello seguente. La capacità massima del
sistema è l’esecuzione di 13x8 rack contemporaneamente, per un totale di 104 pazienti.
Per quanto riguarda l’esecuzione degli immunotyping, lo strumento impiega 10 minuti per
eseguire la prima analisi (su ogni rack va inserito un solo campione), mentre i successivi campioni
vengono analizzati in circa 7 minuti ciascuno (dato che mentre viene eseguita la migrazione del
campione precedente viene già diluito il successivo). Dunque in un ora vengono effettuate circa 8
immunofissazioni. Per eseguire 4 immunofissazioni su gel (4 campioni per gel) mediante lo
strumento Hydrasys™, si impiega circa 1 ora e 10 minuti (senza contare la preparazione iniziale del
campione, che comprende la sua diluizione manuale e applicazione sul supporto, come pure la
preparazione degli antisieri da pipettare).
Per il passaggio da una metodica all’altra (elettroforesi proteine – ImmunoTyping e viceversa), lo
strumento necessita di un tempo inferiore ad un minuto. Una volta acceso lo strumento, prima di
poter eseguire qualsiasi analisi, è necessario un ciclo di messa in funzione che dura circa 10-12
minuti; mentre prima di poter spegnere l’apparecchio bisogna eseguire un ciclo di spegnimento che
richiede circa 15 minuti.
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5.4.2 ANALISI DEI COSTI
Il prezzo del kit 30 SP (serum protein) Hydrasys, utilizzato per l’esecuzione dell’elettroforesi su
gel d’agarosio, ammonta a CHF 499.20. Con questo kit si possono analizzare un massimo di 300
campioni, per un costo unitario dell’analisi di CHF 1,66. Mentre il kit per l’esecuzione
dell’elettroforesi capillare sullo strumento Capillarys™ 2 costa CHF 1'420.--, e si possono eseguire
720 analisi, da cui si ricava un costo di analisi di CHF 1,97.
La singola elettroforesi capillare ha un costo superiore di CHF 0.31, rispetto all’elettroforesi su
gel (circa 18.7%). Nonostante un costo superiore della singola analisi, la strumentazione capillare
richiede una manipolazione, da parte del tecnico di analisi, nettamente inferiore rispetto alla tecnica
convenzionale su gel. Il tempo dedicato dall’operatore all’analisi capillare è limitato all’inserimento
dei campioni nell’apparecchio e all’analisi dei risultati al termine della migrazione, permettendogli
di svolgere altri compiti nell’attesa dei risultati. Al contrario, con il sistema su gel d’agarosio
l’operatore, come già detto, deve dedicare più tempo allo svolgimento dell’analisi fino
all’interpretazione finale dei risultati.
Sempre per quanto riguarda l’analisi dei costi, secondo Lissoir, Wallemacq e Maisin (14), il costo
di un test, in termini di reattivi, per l’apparecchio Capillarys™, è identico a quello del sistema
semi-automatizzato Hydrasys™ (circa EUR 0.60 per test). Nonostante il costo della singola analisi
risulti simile e considerando nel calcolo il tempo impiegato dal personale, il prezzo dell’analisi
capillare risulta essere inferiore di circa il 20%. In questo caso, il costo superiore dell’analisi
convenzionale è dovuto al maggiore impiego della manodopera.
Il costo dell’apparecchio Capillarys™ 2, secondo listino, è di CHF 102'000.--. Calcolando un
ammortamento della spesa su 10 anni e 260 giorni lavorativi l’anno, l’apparecchio risulta
conveniente per i laboratori la cui routine supera un quantitativo di analisi giornaliere di 20
campioni.
Tabella 8: riassunto dei costi, in CHF, del sistema capillare e su gel d’agarosio
Costo del Kit
Numero massimo di analisi per kit
Costo singola analisi
Prestazione del personale
Elettroforesi capillare
1'420.-720
1.97
Inserimento campione
Interpretazione risultati
Elettroforesi convenzionale
499.20
300
1.66
Preparazione del campione per la
migrazione
Preparazione per la colorazione gel
Lettura densitometrica
Interpretazione risultati
5.4.3 EVENTUALI PROBLEMI
All’inizio della nostra valutazione abbiamo dovuto fare fronte a dei problemi dovuti al fatto che
l’apparecchio non era stato posizionato su un piano completamente orizzontale. Le vibrazioni da
esso provocate causavano la perdita, all’interno dello strumento, della coppetta multipla per la
diluizione del campione posizionata sul rack. Per quanto riguarda il software non sono stati
riscontrati problemi.
5.5 RACCOMANDAZIONI
Eccezion fatta per lo studio della precisione di giorno in giorno, non sono stati verificati gli effetti
della conservazione sul campione di siero. Essa potrebbe essere eseguita misurando delle aliquote di
un campione di controllo e/o un pool di sieri (a dipendenza della possibilità del laboratorio), dopo
un giorno di conservazione a -20°C, dopo 2 giorni, dopo una settimana e eventualmente dopo un
mese, confrontando alla fine delle misurazioni la variazione del risultato nel tempo. Questo lavoro
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
potrebbe essere effettuato anche a differenti temperature, sempre per verificare l’effetto della
conservazione del campione nel tempo, simulando delle condizioni ambientali che possono
eventualmente influire sui risultati dei campioni inviati al laboratorio di analisi (ad esempio
temperature estive, invernali, tempo di trasporto, ecc).
In questo studio ci siamo concentrati sulla valutazione delle qualità analitiche dello strumento
Capillarys™ 2, per quanto riguarda l’analisi dell’elettroforesi delle proteine sieriche. Essendo il
Capillarys™ 2 uno strumento multiparametrico, in futuri studi si potrebbero verificare le capacità
dell’apparecchio soprattutto per quanto riguarda l’esecuzione degli immunotyping (basati sulla
procedura dell’immunosottrazione, vedi capitolo seguente). Le altre analisi che, con gli appositi kit,
questo strumento permette attualmente di effettuare, e che quindi potrebbero essere soggette a studi
futuri, sono l’analisi dell’elettroforesi delle proteine urinarie, immunotyping delle proteine urinarie,
l’elettroforesi dell’emoglobina e l’analisi della separazione delle isoforme sieriche della transferrina
(CDT).
5.5.1 IMMUNOTYPING
Lo studio e la comparazione dell’identificazione delle componenti monoclonali non era un
obbiettivo di questo lavoro di diploma, ma potrebbe esserlo per futuri lavori con questo
apparecchio. Per prendere confidenza con esso sono stati anche eseguiti 36 immunotyping. Dei 36
casi analizzati si sono notate quattro differenze (vedi tabella 6). In due casi si è riscontrato una
banda debole nella regione delle immunoglobuline con il sistema su gel (non ulteriormente
indagate), mentre gli immunotyping, di questi stessi campioni, sono risultati positivi (uno di
specificità IgG/K e l’altro IgG/L). Mentre negli altri due casi si è osservata una banda debole nella
zona delle γ-globuline su gel (una di specificità IgA/L e la seconda non ulteriormente indagata),
mentre gli immunotyping sono risultati negativi. Da questo risulta una concordanza dell’89%, anche
se sono stati analizzati un numero insufficiente di campioni per poter essere considerato un
parametro affidabile. In ulteriori studi si potrebbe dunque determinare la concordanza dei due
sistemi, includendo le percentuali di falsi-positivi o di falsi-negativi riscontrati, e la sensibilità
dell’apparecchio capillare utilizzando dei sieri con componenti monoclonali a concentrazioni scalari
regressive, al fine di determinare la più grande diluizione che fornisce un risultato positivo (limite
inferiore discriminante).
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6. CONCLUSIONE
In conclusione, lo strumento Capillarys™ 2 è un apparecchio multicapillare per l’elettroforesi
capillare, designato per l’analisi delle proteine sieriche umane. Le sue qualità analitiche possono
permettere al laboratorio di risparmiare una grande quantità di tempo, in confronto alle tecniche di
elettroforesi su gel d’agarosio, attualmente in uso nella maggior parte dei laboratori. Le sue grandi
prospettive, per quanto concerne le sue applicazioni, come l’analisi delle proteine urinarie, la
separazione dell’emoglobina, o la separazione delle isoforme della transferrina (CDT) ne fanno un
apparecchio sempre più indispensabile per l’evoluzione futura dei laboratori specializzati. Grazie ai
suoi numerosi vantaggi, quali la grande rapidità, la facilità di utilizzo del apparecchio (non richiede
specifiche conoscenze e capacità tecniche dell’operatore di laboratorio) e del software, bassi costi
e minimo consumo dei reattivi, buona precisione ed alta risoluzione ne fanno quindi un ottima
alternativa in laboratorio ai metodi di elettroforesi convenzionale. Il software offre inoltre la
possibilità di creare un database per memorizzare le curve elettroforetiche dei vari pazienti, e
permette il confronto con eventuali curve dello stesso paziente conservate in memoria.
Considerato quanto sopra e riassunto nella tabella 9, si può concludere che l’introduzione di
questo strumento risulta vantaggioso all’interno di laboratori clinici con una routine giornaliera di
almeno 20 campioni, permettendo così di ridurre i tempi di analisi e le esigenze del laboratorio.
Infine, proprio grazie alla facilità di utilizzo dell’apparecchio e del software, sarà necessario solo un
breve periodo di formazione e di adattamento del personale al nuovo strumento.
Tabella 9: Rappresentazione riassuntiva delle caratteristiche degli apparecchi
Costo singola analisi
Tempi di elettroforesi
Tempi di analisi
Facilità di uso
Apparecchio multiparametrico
Innovazioni future
Risoluzione
Quantità di campione
Elettroforesi capillare
CHF 1.97
4 min
Fino a 37 min per 30 tracciati
Alta
SI
Elettroforesi, immunotyping,
separazione emoglobine, CDT,
urine,
SI
Maggiore rispetto AGE
nL (volume morto di 200 µL)
Elettroforesi su gel d’agarosio
CHF 1.66
7 min
Fino a 90 min per 30 tracciati
Media
SI
Elettroforesi ed
immunofissazione, urine
Minore rispetto CE
10 µL
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7. RINGRAZIAMENTI
I miei ringraziamenti vanno in particolar modo all’Istituto Viollier per avermi dato la possibilità di
effettuare il mio periodo di stage pratico e il mio lavoro di diploma nella sede di Allschwil (BL).
Ringrazio tutte le persone che hanno contribuito alla realizzazione del mio lavoro di diploma …
… la ditta MEDIM (Medical Diagnostic Products, rappresentate in Svizzera della ditta
Sebia), per avermi messo a disposizione gratuitamente l’apparecchio Capillarys™ 2e i
reattivi per l’esecuzione del mio lavoro di diploma;
… il Dr. Phil II Giovanni Togni, per il suo supporto e i consigli dati durante tutto il periodo
di formazione pratica e del lavoro di diploma, che mi hanno aiutato a proseguire e a
migliorare sempre;
… Véronique Zygmunt, capo laboratorio del reparto di chimica, per il suo aiuto nella
valutazione dell’apparecchio;
… tutte le colleghe reparto di chimica e chimica speciale del laboratorio Viollier di
Allschwil per il loro aiuto e sostegno in questi mesi di lavoro;
… il direttore ad interim Andrea Boffini, per il sostegno metodologico durante tutto l’anno
scolastico;
… le docenti Daniela Marcacci e Sonia Marci per il loro sostegno e aiuto, non solo durante
lo svolgimento del lavoro di diploma;
… alla docente di inglese Susanne Gilbert per l’aiuto e la correzione nella redazione
dell’Abstract;
… La mia famiglia per l’aiuto e la comprensione incondizionata dimostrati in questi ultimi
mesi non solo per lo sviluppo grafico e di correzione del lavoro;
… La famiglia Forgiarini per avermi accolto ad Oberwil in questi ultimi mesi.
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
8. BIBLIOGRAFIA
1. Kit protein 15/30, Kit protein(e) 6. Instructions 2005/02, Sebia
www.sebia.com
2. Leland H. Hartwell, Leroy Hood, Michael L. Goldberg, Ann E. Reynolds, Lee M. Silver,
Ruth C. Veres. GENETICA dall’analisi formale alla genomica. McGraw-Hill, 2004
3. Rob Reed, David Holmes, Jonathan Weyers, Allan Jones. Metodologie di base per le
scienze biomolecolari. Zanichelli, 2002
4. Arne W. K. Tiselius. Electrophoresis and adsorption analysis as aids in investigations of
large molecular weight substances and their breakdown products. Nobel lecture, 13
Dicembre 1948
5. Jorgenson JW, Lukacs KD. Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Anal
Chem 1981; 53: 1298-302
6. Landers JP. Clinical capillary electrophoresis. Clin Chem 1995; 41: 495-509
7. David Heiden, High Performance Capillary Electrophoresis. Agilent Technologies 2000
8. Jeppson JO. Laurell CB, Franzén B. Agarose gel electrophoresis. Clin Chem 1979; 25: 629638
9. Lehmann R, Voelter W, Liebich HM. Capillary electrophoresis in clinical chemistry. J
Chromatogr B 1997; 697: 3-35
10. Jenkins MA, Guerin MD. Capillary electrophoresis as a clinical tool. J Chromatogr B 1996;
682: 23-34
11. Cécile Gay-Bellile, Djaouida Bengoufa, Pascal Houze, Didier Le Carrer, Mourad
Benlakehal, Bernard Bousquet, Bernard Gourmel, Thierry Le Bricon. Automated
multicapilary electrophoresis for analysis of human serum proteins. Clin Chem 2003; 49:
1909-1915
12. Roudiere L, Boularan AM, Bonardet A, Vallat C, Cristol JP, Dupuy AM. Evaluation of a
Capillary zone electrophoresis system versus a conventional agarose gel system for routine
serum protein separation and monoclonal component typing. Clin Lab 2006; 52: 19-27
13. Bienvenu J, Graziani MS, Arpin F, Bernon H, Blessum C, Marchetti C, Righetti G,
Somenzini , Verga G, Aguzzi F. Multicenter evaluation of the paragon CZE®2000 capillary
zone electrophoresis system for serum protein electrophoresis and monoclonal component
typing. Clin Chem 1998; 44: 599-605
14. Lissoir B, Wallemacq P, Maisin D. Électrophorèse des protéines sériques: comparaison de
la technique en capillaire de zone Capillarys™ (Sebia) et de l’électrophorèse en gel
d’agarose Hydrasys™ (Sebia). Annales de Biologie Clinique 2003 Volume 61; 5: 557-562
15. Kahn NS, Strony LP. Imprecision of quantification of serum protein fractions by
electrophoresis on cellulose acetate. Clin Chem 1986; 32: 356-357
16. Baars JD, Lombarts AJPF. Imprecision of protein electrophoresis. Clin Chem 1986; 32:
1425-1426
17. Kim JW, Park JH, Park JW, Doh HJ, Heo GS, Lee KJ. Quantitative analysis of serum
proteins separated by capillary electrophoresis. Clin Chem 1993; 39: 689-692
18. Klein GL, Jolliff K. Capillary electrophoresis for the routine clinical laboratory. Landers
JP: Handbook of capillary electrophoresis 1994; 419-458
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
Elettroforesi capillare o su gel d’agarosio?
Capillarys™2: un nuovo apparecchio per
l’elettroforesi capillare delle proteine sieriche
Giugno 2006
Marco Rossi
Istituto Viollier Allschwil (BL)
Dr. Phil II Giovanni Togni
INDICE ALLEGATI
ALLEGATO 1 ............................................. 1 - ERRORE. IL SEGNALIBRO NON È DEFINITO.8
Tabella per la raccolta dei dati ....................................................................................................................................1 - 8
ALLEGATO 2 ....................................................................................................................................9
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO ................................................................................................................. 9
ALLEGATO 3:.................................................................................................................................10
Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema di elettroforesi su gel d’agarosio e il sistema di
elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in % ............................................................. 10
ALLEGATO 4:.................................................................................................................................11
Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema di elettroforesi su gel d’agarosio e il sistema di
elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in g/L........................................................... 11
ALLEGATO 5:.................................................................................................................................12
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione dell’imprecisione di giorno in giorno, per i vari
campioni: controllo di qualità congelato e a temperatura di 4°C, pool normale 1 ed un pool patologico .................... 12
ALLEGATO 6:.................................................................................................................................13
Rappresentazioni grafiche dell’andamento, sull’arco dei 16 giorni, dei valori ottenuti tramite l’analisi di 4.............. 13
ALLEGATO 7:.................................................................................................................................14
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione nella serie, per i vari campioni:
controllo di qualità, pool normale 1 e pool patologico (n = 10)..................................................................................... 14
ALLEGATO 8:.................................................................................................................................15
Rappresentazioni grafiche, dei valori ottenuti tramite l’analisi di 4 campioni (campione di controllo di qualità, pool
normale 1 ed un pool patologico), al fine di determinare la precisione nella serie ....................................................... 15
ALLEGATO 9:.................................................................................................................................16
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione dei capillari, nell’arco di 4 giorni
consecutivi su di un campione di siero normale (pool normale 2)................................................................................. 16
ALLEGATO 10:...............................................................................................................................17
Risultati dello studio della precisione dei capillari, mediante l’analisi di un campione di controllo di qualità,
contemporaneamente sugli 8 capillari, per tre volte nell’arco della stessa giornata...................................................... 17
ALLEGATO 11:...............................................................................................................................18
Grafici di regressione lineare tra la determinazione dell’albumina, in g/L, con il sistema del verde di bromocresolo
(Cobas Integra™800) e rispettivamente con il sistema dell’elettroforesi capillare (a) e su gel di agarosio (b) ........... 18
ALLEGATO 12:...............................................................................................................................19
Siero di controllo per elettroforesi della ditta Sebia (Francia): lot 01045/01, scd 04/2009........................................... 19
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SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 2
ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO
L’elettroforesi è una tecnica di separazione basata sul movimento di molecole cariche in un
campo elettrico. Molecole, caricate elettricamente, dissimili possiedono differenti velocità di
separazione attraverso una soluzione, sotto l’influsso di un campo elettrico. La mobilità
elettroforetica di una particella caricata varia in base a:
•
La sua carica netta: le molecole cariche negativamente – anioni – migrano verso l’anodo,
mentre le molecole cariche positivamente – cationi – migrano verso il catodo; le molecole
altamente cariche si muovono più velocemente verso l’elettrodo di carica opposta
•
Le sue dimensioni: la resistenza frizionale esercitata su molecole che si muovono in soluzione
da parte della matrice porosa, fa si che le molecole più piccole migrino più velocemente di
quelle più grandi
•
La forza del campo elettrico e dalle proprietà del mezzo di migrazione.
La mobilità aumenta con l’intensificazione della forza del campo elettrico (voltaggio), ma vi sono
limiti pratici all’uso d’alti voltaggi nell’elettroforesi su gel, specialmente dovuti all’elevato
riscaldamento.
La carica netta di una proteina dipende dal pH ed è determinata dal numero relativo delle catene
laterali d’amminoacidi cariche positivamente e negativamente ad un dato valore di pH. In genere la
separazione delle proteine si esegue in un pH alcalino, in cui la maggior parte delle proteine ha una
carica netta negativa. Per separarle si deposita una porzione di siero su una matrice imbevuta di una
soluzione elettrolitica (tampone), che permette il passaggio della corrente. La matrice porosa
introduce un ulteriore effetto di setaccio molecolare. Le dimensioni dei pori sono in genere dello
stesso ordine di dimensione delle molecole che vengono separate, e restringono di conseguenza il
movimento delle molecole più grandi rispetto a quelle più piccole. La matrice può essere costituita
da carta da filtro, acetato di cellulosa, gel d’agarosio (polisaccaride ottenuto dalle alghe marine e
utilizzato per la separazione di proteine, lipo-proteine, DNA e RNA), gel d’acrilamide,… Lo scopo
di questi supporti è quello di ridurre la diffusione delle particelle, in modo che queste migrino e si
separino in una zona ben precisa e caratteristica. Il tampone ha una duplice funzione: garantire il
passaggio della corrente e mantenere costante il pH. Le sostanze vengono fatte migrare grazie alla
differenza di potenziale elettrico tra i due elettrodi. Le grosse proteine tendono a spostarsi fra le
maglie della matrice porosa più lentamente rispetto a quelle più piccole che si spostano verso
l’anodo con meno difficoltà.
Prima della colorazione le proteine separate devono essere fissate in posizione in modo che non
diffondano, tramite l’utilizzo di MeOH. I coloranti utilizzati per la colorazione sono l’Amido
Schwarz, il Blue di Comassie e il Ponceau S. Per la quantificazione delle proteine separate su gel
d’agarosio, la tecnica più utilizzata è la lettura mediante un densitometro. Un fascio di luce molto
fine (fascio laser o luce monocromatica) viene fatto passare su tutta la lunghezza della striscia delle
proteine colorate. Un lettore registra i cambiamenti d’intensità della luce che passa attraverso il gel
e li rappresenta in un profilo. La dimensione delle bande e la loro intensità sono proporzionali alla
concentrazione delle varie proteine. Il grafico finale risulta costituito da una serie di picchi
corrispondenti alle frazioni proteiche (2,3,8).
9
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 3
Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema d’elettroforesi su gel d’agarosio e il
sistema d’elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in %
ALBUMINA %
FRAZIONE BETA TOT %
90
25
y = 0.9935x - 2.0473
R2 = 0.9367
80
60
15
CE
CE
y = 0.8006x + 2.1865
R2 = 0.5266
20
70
50
10
40
30
5
20
10
0
10
30
50
70
90
0
5
10
AGE
70
y = 0.9518x + 1.9418
R2 = 0.9687
60
50
CE
CE
25
FRAZIONE GAMMA %
y = 1.3433x + 0.6847
R2 = 0.9207
40
30
20
10
0
0
5
10
15
0
20
FRAZIONE ALFA2 %
30
y = 1.0584x - 1.2113
R2 = 0.8414
25
20
15
10
5
0
0
10
20
40
AGE
AGE
CE
20
AGE
FRAZIONE ALFA1 %
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
15
20
30
AGE
10
60
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 4:
Rette di regressione ottenute dalla correlazione tra il sistema d’elettroforesi su gel d’agarosio e il
sistema d’elettroforesi capillare per le varie frazioni proteiche, con valori espressi in g/L
FRAZIONE BETA TOT g/L
ALBUMINA g/L
70.0
y = 0.9602x - 0.0029
R2 = 0.944
60.0
CE
CE
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
10.0
30.0
50.0
20.0
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
y = 0.9024x + 0.8164
R2 = 0.5705
0.0
70.0
5.0
10.0
15.0
20.0
AGE
AGE
FRAZIONE ALFA1 g/L
FRAZIONE GAMMA g/L
70.0
14.0
12.0
50.0
CE
10.0
CE
y = 0.9792x + 1.1132
R2 = 0.9821
60.0
y = 1.3269x + 0.5123
R2 = 0.9133
8.0
6.0
40.0
30.0
20.0
4.0
10.0
2.0
0.0
0.0
0.0
5.0
10.0
0.0
15.0
FRAZIONE ALFA2 g/L
25.0
y = 1.1024x - 1.1857
20.0 2
R = 0.8345
CE
15.0
10.0
5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
40.0
AGE
AGE
0.0
20.0
20.0
25.0
AGE
11
60.0
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 5:
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione dell’imprecisione di giorno in giorno,
per i vari campioni: controllo di qualità congelato e a temperatura di 4°C, pool normale 1 ed un pool
patologico
Controllo di qualità: lot 01045/01, conservato in congelatore a -20°C
Giorno
1
2
6
7
9
12
13
14
9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03
Albumina
62.8 62.3 62.6 63
62.5 62.4 62.2 62.9
alfa1
4
4.2
4.1
4.1
4.1
4.2
4.3
4.3
alfa2
8.9
9
9
8.9
9
9
9.2
9
beta1
6.1
6.2
6.1
6.1
6.3
6.1
6.1
6.2
beta2
4.2
4.2
4.3
4.4
4.1
4.1
4.1
4.2
γ
14
14.1 13.9 13.6 14
14.2 14.1 13.4
15
23.03
63
4.2
9
6
4.1
13.7
16
24.03
62.8
4.1
9.1
6
4.1
13.9
Controllo di qualità: lot 01045/01, conservato in frigorifero ad una temperatura di 4°C
Giorno
1
2
6
7
9
12
13
14
15
16
9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03 22.03 23.03 24.03
Alb
63
62.7 63.5 63.7 63.8 64
63.5 63.5 63.4 63.2
alfa1
3.9
4
3.7
3.8
3.9
4
4.1
4
3.9
4.1
alfa2
8.8
8.7
8.7
8.3
8.3
8.5
8.6
8.7
8.7
8.7
beta1
6.1
6.2
6.2
6.4
6.3
6.1
6.2
6.3
6.1
6.1
beta2
4.3
4.4
4
4.2
4.2
4
4.1
4.2
4.1
4.1
γ
13.9 14
13.9 13.6 13.5 13.4 13.5 13.3 13.8 13.8
Pool Normale, conservato in congelatore a -20°C
Giorno
1
2
6
7
9
12
9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03
Alb 63
63.8 63.9 63.9 63.7 63.8 63.8
alfa1 4.1
4
4
3.9
4
4.1
4
alfa2 9.7
9.4
9.4
9.6
9.6
9.7
9.6
beta1 6.5
6.3
6.3
6.3
6.5
6.3
6.3
beta2 4
4.2
4.3
4.1
4.2
4
4.1
γ
12.7 12.3 12.1 12.2 12
12.1 12.2
13
22.03
63
4.2
9.8
6.4
4.1
12.5
14
23.03
63.7
4.1
9.5
6.4
4.3
12
15
16
24.03
63.8
4.1
9.7
6.3
4.1
12
Pool Patologico, conservato in congelatore a -20°C
Giorno
1
2
6
7
9
12
9.03 10.03 14.03 15.03 17.03 20.03 21.03
Alb 53.2 52.7 53.7 52.7 53
53.4 53.2
alfa1 3.7
4
3.7
3.9
3.9
3.8
3.8
alfa2 9.1
9.1
8.8
9.3
9
9
9
beta1 5.4
5.4
5.5
5.7
5.6
5.6
5.7
beta2 3.3
3.2
3.1
3.1
3.1
3.1
3.2
γ
25.3 25.6 25.2 25.3 25.4 25.1 25.1
13
22.03
52.7
3.8
9.2
5.7
3.2
25.4
14
23.03
53.4
3.8
8.9
5.5
2.9
25.5
15
16
24.03
53
3.9
8.9
5.8
3.2
25.2
12
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 6:
Rappresentazioni grafiche dell’andamento, sull’arco dei 16 giorni, dei valori ottenuti tramite
l’analisi dei 4 campioni (campione di controllo di qualità, pool normale 1 ed un pool patologico
conservati a -20°C, e un campione di controllo conservato a 4°C)
CQcong
CQfrigo
P.normale
P.patologico
ALBUMINA
60
55
7
6
5
4
50
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
2
3
4
5
6
7
Alfa1CQcong
Alfa1CQfrigo
Alfa1P.normale
Alfa1P.patologico
FRAZIONE ALFA1
5
FRAZIONE BETA2
V a lo ri
4
3.5
3
5
4
3
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1
2
3
4
5
6
7
Giorni
CQcong
CQfrigo
P.norm
P.patologico
V alo ri
9
8.5
8
7.5
7
4
5
6
7
8
9
9 10 11 12 13 14 15 16
FRAZIONE GAMMA
10
9.5
3
8
Giorni
FRAZIONE ALFA2
2
CQcong
CQfrigo
P.norm
P.patologico
6
4.5
1
8 9 10 11 12 13 14 15 16
Giorni
Giorni
Va lo ri
CQcong
CQfrigo
P.norm
P.patologico
8
65
V alo ri
Valo re
70
FRAZIONE BETA1
1
11
1
1
1
15
30
25
20
15
10
5
1
Gio rni
13
CQcong
CQfrigo
P.Norm
P.patologico
2
3
4
5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16
Giorni
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 7:
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione nella serie, per i vari
campioni: controllo di qualità, pool normale 1 e pool patologico (n = 10)
Controllo di Qualità: Lot: 01045/01
Alb
alfa1
alfa2
beta1
beta2
γ
1
62.2
4.2
9.2
6.1
4.2
14.1
2
62.6
4.1
9.1
6
4.2
14
3
63
4.2
8.7
6.1
4.3
13.7
4
62.4
4.3
9.1
6.2
4.3
13.7
5
62
4.3
9.2
6.1
4.3
14.1
6
62.4
4.1
9
6
4.4
14.1
7
62.7
4.1
9
6.1
4.2
13.9
8
62.5
4.1
9
6.2
4.3
13.9
9
61.4
4.3
9.3
6.2
4.3
14.5
10
62.3
4.1
9.1
6.3
4.3
13.9
3
64.2
3.9
9.3
6.2
4.3
12.1
4
63.8
4
9.3
6.3
4.2
12.4
5
62.9
4.3
9.6
6.4
4.3
12.5
6
63.6
4
9.5
6.4
4.2
12.3
7
63.9
3.9
9.4
6.3
4.1
12.4
8
63.9
4.1
9.5
6.2
3.9
12.4
9
63
4.3
9.6
6.4
4.1
12.6
10
63.5
4.2
9.6
6.4
4
12.3
3
53.6
3.8
8.6
5.5
3.3
25.2
4
54
3.8
8.6
5.6
3
25
5
53.1
3.8
8.9
5.6
3.2
25.4
6
52.9
4
8.8
5.5
3.4
25.4
7
53.6
3.6
8.5
5.3
3.4
25.6
8
53.6
3.7
8.6
5.5
3.3
25.3
9
52.9
4.1
8.6
5.8
3.2
25.4
10
53.5
3.8
8.9
5.5
3.1
25.2
Pool Normale 1
Alb
alfa1
alfa2
beta1
beta2
γ
1
63.5
4.2
9.7
6.3
4
12.3
2
63.5
4.1
9.5
6.3
4.1
12.5
Pool Patologico
Alb
alfa1
alfa2
beta1
beta2
γ
1
52.9
3.8
9.3
5.3
3.4
25.3
2
53.5
3.8
8.6
5.3
3.5
25.3
14
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 8:
Rappresentazioni grafiche, dei valori ottenuti tramite l’analisi di 4 campioni (campione di controllo
di qualità, pool normale 1 ed un pool patologico), al fine di determinare la precisione nella serie
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
ALBUMINA (precisione giornaliera)
65
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
BETA1 (precisione giornaliera)
7.5
Valo re
7
60
6.5
6
55
5.5
5
50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4.5
10
1
2
3
4
5
Misurazioni
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
ALFA 1 (precisione giornaliera)
7
8
9
10
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
BETA2 (precisione giornaliera)
5
VA L O R I
Valo ri
5
4
3
2
4
3
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
Misurazioni
ALFA2 (precisione giornaliera)
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
5
6
7
MISURAZIONI
GAMMA (precisione giornaliera)
8
9
10
CQ
P.NORMALE
P.PATOLOGICO
30
VAL O RI
10
VA L O RI
6
M ISU R A Z ION I
9
8
25
20
15
10
7
1
2
3
4
5
6
7
MISURAZIONI
8
9
1
10
15
2
3
4
5
6
7
MISURAZIONI
8
9
10
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 9:
Tabelle che raggruppano i dati raccolti nella determinazione della precisione dei capillari, nell’arco
di 4 giorni consecutivi su di un campione di siero normale (pool normale 2)
Frazione
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
alb
20.03
62.8
62.7
62.6
61.7
62.8
62.4
62.3
61.6
alfa1
20.03
4.1
4.1
4.2
4.2
4
4.1
4.1
4.2
alfa2
20.03
11.7
11.8
11.7
12.2
11.7
11.8
11.8
11.9
beta1
20.03
5.6
5.6
5.8
5.9
5.6
5.7
5.8
5.8
beta2
20.03
4
3.7
3.7
3.8
3.9
4
4
4.1
gamma
20.03
11.8
12.1
12
12.2
12
12
12
12.4
Frazione
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
alb
21.03
63.4
62.8
62.8
61.5
61.6
61.8
62.5
61.7
alfa1
21.03
4.2
4
4.1
4.4
4.3
4.2
4.2
4.3
alfa2
21.03
11.6
11.5
11.6
12
11.8
11.8
11.5
11.7
beta1
21.03
5.6
5.7
5.6
5.8
5.8
6
5.8
6
beta2
21.03
3.9
4.1
4
4.2
4.4
4.1
4.1
4.3
gamma
21.03
11.3
11.9
11.9
12.1
12.1
12.1
11.9
12
Frazione
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
alb
22.03
62.8
62.3
62.2
61.6
62.2
62.5
62.3
61.7
alfa1
22.03
4.1
4.3
4.1
4.3
4.2
4.1
4.3
4.1
alfa2
22.03
11.6
11.7
11.9
12
11.8
12
11.8
11.9
beta1
22.03
5.7
5.6
5.7
5.7
5.8
5.6
5.7
6
beta2
22.03
4.1
4.1
4
4.1
4.2
3.9
4.1
4.3
gamma
22.03
11.7
12
12.1
12.3
11.8
11.9
11.8
12
Frazione
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
alb
23.03
63.2
61.9
62.4
61.8
62.1
62.4
62.3
62
alfa1
23.03
4
4
4
4.2
4.2
4.1
4.1
4.4
alfa2
23.03
11.6
12
11.8
11.9
11.9
11.8
11.7
11.8
beta1
23.03
5.7
5.9
5.8
5.9
5.8
5.8
5.8
6
beta2
23.03
4.1
4.3
4.1
4.1
4.2
4.3
4.2
4.2
gamma
23.03
11.4
11.9
11.9
12.1
11.8
11.6
11.9
11.6
16
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 10:
Risultati dello studio della precisione dei capillari, mediante l’analisi di un campione di controllo di
qualità, contemporaneamente sugli 8 capillari, per tre volte nell’arco della stessa giornata
Frazione alb
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
Capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
ALBUMINA
capillare Media
1
63.1
2
62.7
3
62.7
4
62.0
5
62.3
6
63.0
7
62.6
8
62.1
TOT
62.6
BETA1
capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
TOT
Media
5.9
6.1
6.2
6.3
6.3
6.0
6.1
6.2
6.1
alfa1
7.03
63.4
62.5
62.7
62.3
62.4
63
63.3
62
7.03
63.1
62.8
62.3
62.1
62
63.2
61.7
62.5
7.03
62.8
62.7
63.1
61.7
62.4
62.7
62.9
61.8
alfa2
7.03
4.2
4.2
4
4
4.1
4
4
4.1
7.03
4
4.1
4
4
4
4
4.2
4.1
7.03
4
4
4
4.2
4
4
4
4
beta1
7.03
8.9
9.2
9
9.1
9.1
9.1
9
9.3
7.03
9.1
9
9.1
9
9
8.8
9.2
9.1
7.03
9.2
9.2
9
9.4
9.2
9.2
9.1
9.3
Dev.st
0.30
0.15
0.40
0.31
0.23
0.25
0.83
0.36
(media)
CV
0.48
0.24
0.64
0.49
0.37
0.40
1.33
0.58
0.6
beta2
7.03
6
6
6.3
6.2
6.3
5.9
5.8
6.2
7.03
5.9
6.2
6.2
6.4
6.4
6
6.4
6.2
7.03
5.9
6
6
6.3
6.1
6
6
6.2
ALFA1
capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
TOT
Dev.st
0.06
0.12
0.15
0.10
0.15
0.06
0.31
0.00
(media)
CV
0.97
1.90
2.48
1.59
2.44
0.97
5.04
0.00
1.9
BETA2
capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
TOT
gamma
7.03
4
4.1
4.1
4
4.2
4
4.1
4.1
7.03
4
4.1
4.2
4
4.2
4.1
4.2
4
7.03
4
3.9
4
4.1
4.1
4
3.9
4.3
7.03
13.5
14
13.9
14.4
13.9
14
13.8
14.3
7.03
13.9
13.8
14.2
14.5
14.4
13.9
14.3
14.1
7.03
14.1
14.2
13.9
14.3
14.2
14.1
14.1
14.4
Prima determinazione
Seconda determinazione
Terza determinazione
Media
4.1
4.1
4.0
4.1
4.0
4.0
4.1
4.1
4.1
Dev.st
0.12
0.10
0.00
0.12
0.06
0.00
0.12
0.06
(media)
CV
2.84
2.44
0.00
2.84
1.43
0.00
2.84
1.42
1.7
ALFA2
capillare
1
2
3
4
5
6
7
8
TOT
Media
9.1
9.1
9.0
9.2
9.1
9.0
9.1
9.2
9.1
Dev.st
0.15
0.12
0.06
0.21
0.10
0.21
0.10
0.12
(media)
CV
1.68
1.26
0.64
2.27
1.10
2.30
1.10
1.25
1.5
Media
4.0
4.0
4.1
4.0
4.2
4.0
4.1
4.1
4.1
Dev.st
0.00
0.12
0.10
0.06
0.06
0.06
0.15
0.15
(media)
CV
0.00
2.86
2.44
1.43
1.39
1.43
3.76
3.70
2.1
GAMMA.
capillare Media
1
13.8
2
14.0
3
14.0
4
14.4
5
14.2
6
14.0
7
14.1
8
14.3
TOT
14.1
Dev.st
0.31
0.20
0.17
0.10
0.25
0.10
0.25
0.15
(media)
CV
2.21
1.43
1.24
0.69
1.78
0.71
1.79
1.07
1.4
17
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 11:
Grafici di regressione lineare tra la determinazione dell’albumina, in g/L, con il sistema del verde di
bromocresolo (Cobas Integra™800) e rispettivamente con il sistema dell’elettroforesi capillare (a) e
su gel d’agarosio (b)
a
b
18
SSMT, Marco Rossi, Giugno 2006
ALLEGATO 12:
Siero di controllo per elettroforesi della ditta Sebia (Francia): lot 01045/01, scd 04/2009.
19