TECNICHE ELETTROFORETICHE
Le tecniche elettroforetiche permettono la separazione di
miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo
elettrico con diverse velocità. Sono spesso associate alle
tecniche cromatografiche, perché basate su di una diversa
velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi
cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la
ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria,
tranne che nel caso dell’l’elettrocromatografia. Si tratta di un
gruppo di tecniche molto utilizzate soprattutto in campo
biologico (separazione di proteine, polinucleotidi e altri
biopolimeri), e in generale di ioni, sostanze ionizzabili e
anfoliti, (es. aminoacidi e peptidi). Trova applicazione anche
in altri campi, dati alcuni vantaggi che mostra rispetto alla
cromatografia.
PROTOSTORIA DELL’ELETTROFORESI
• 1886 Lodge – Migrazione di H+ in un tubo di fenolftaleina
“gelificato”
• 1892 Smirnow – Frazionamento di una soluzione di tossine di
Ditteri per azione di un campo elettrico
• 1899 Hardy – Migrazione di globuline in un tubo ad “U” al
passaggio di corrente elettrica.
• 1905 Hardy – Studi dettagliati sul movimento di globuline con
varie tipologie di tubi ad “U”.
• 1907 Field e Teangue - Separazione tossina/antitossina via
ponti di agar tra campione ed acqua
• 1923 Kendall e Crittenden – Separazione preparativa di
isotopi in tubi ad “U” di agar
2
The Nobel Prize in Chemistry 1948 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius ( 1902 1971)
Uppsala University Sweden
"for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his
discoveries concerning the complex nature of the serum proteins"
•1930 Tiselius – Studi dello strato mobile di proteine
in soluzione
•1937 Tiselius - Apparato migliorato per lo studio
dello strato mobile
•1939 Coolidge – Separazione elettroforetica di
proteine del siero in tubi riempiti di lana di vetro
•1946 Consden – Ionoforesi di amminoacidi e peptidi
su strato di silice; primi esperimenti di “blotting”
•1950 Haglund e Tiselius – Elettroforesi su colonna di polvere di vetro
•1956 Porath – Elettroforesi su colonna di cellulosa
•1964 Ornstein – Apparato per “disc” elettroforesi
•1965 Tiselius – “free zone elettroforesi di particelle virali in capillari
rotanti di 3 mm I.D.
3
L’era di Hjerten
• 1965 Hjerten – “Particle seiving” elettroforesi di ribosomi in
tubi di gel di poliacrilammide
• 1967 Hjerten – Elettroforesi in soluzione in tubi da e mm I.D.
• 1974 Virtenen – Dimostra i vantaggi di tubi di piccolo diametro
• 1979 Mikkers – Elettroforesi in capillari polimerici
• 1981 Jorgenson e Lukacs – Approccio teorico e sperimentale
all’elettroforesi ad alta risoluzione in capillari di vetro (CE)
• 1983 Hjerten – Elettroforesi capillare SDS-PAGE
• 1984 Terabe – Cromatogrfia micellare elettrocinetica per la
separazione di molecole neutre
• 1987 Cohen e Karger – Dimostrano l’elevata efficienza
dell’elettroforesi capillare su gel
• 1989 Prima strumentazione commerciale per CE
VELOCITA’ DI MIGRAZIONE
ELETTROFORETICA
V = µep x E = µep x V/L
µep = flusso elettroforetico E = campo elettrico
In presenza di flusso elettroosmotico µeo si ha:
V = (µep +
µeo) x V/L
6
In assenza di flusso elettroosmotico
µeo
µep +
µep -
effetto netto
+
O
8
Doppio strato che origina il flusso
elettroosmotico µeo
9
Micro- and Nanoscale Fluid Mechanics:
Transport in Microfluidic Devices
Brian J. Kirby
http://www.kirbyresearch.com/index.cfm/wra
p/textbook/microfluidicsnanofluidicsch6.html
ELETTROOSMOSI
Il valore del potenziale elettroosmotico è dato
dall’equazione di Helmholtz
ζ = 4πη µeo /ε
η = viscosità;
ε = costante dielettrica
La velocità elettroosmotica è quindi:
Veo = E µeo = E ε ζ / 4πη
12
LA RISOLUZIONE IN ELETTROFORESI
• L’allargamento della banda di migrazione è dovuto
alla sola diffusione longitudinale:
σ2 = 2Dm t; t = L/V = L2 / (µeo + µep) V
σ2 = 2Dm L2 / (µeo + µep) V
2
2
N = L /σ = (µeo + µep) V/2Dm
1/2
(µ
+µ
)-(µ
+µ
)=(µ
µ
)
¼N
eo
ep1
eo
ep2
ep1
ep2
R=
= ¼ (µep1- µep2) [V/Dm (µeo + µep)]
13
Classificazione delle tecniche
Le tecniche elettroforetiche si classificano in:
• elettroforesi priva di carrier, in cui
gli ioni migrano in una soluzione
tampone. Non viene più usata.
• elettroforesi mediante carrier, più
comunemente utilizzata, in cui gli
ioni migrano su un supporto di
carta, un gel o un polimero. Un
esempio comune è
• L’elettroforesi classica (es. su carta
per la separazione delle proteine
del siero)
• elettroforesi capillare
14
ELETTROFORESI SU GEL
• L’ elettroforesi su gel è senza dubbio una delle tecniche maggiormente
utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette
• la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse
biologico quali acidi nucleici e proteine.
• Tale separazione dipende dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui
sono dotate tali macromolecole.
• Tali molecole poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata tra
due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta.
• Gli acidi nucleici migrano naturalmente verso il polo positivo per la presenza
nella loro molecola delle cariche negative dei gruppi fosfato (PO4- - ) Il
numero di gruppi fosfato è uguale al numero di nucleotidi per cui, se le
catene sono completamente svolte, la separazione dipende dal PM.
• Le proteine si muovono tutte verso il polo positivo e vengono separate in
base al PM solo dopo essere state complessate con sodio dodecil solfato
(SDS)
15
16
GEL DI POLIACRILAMMIDE
• Variando la concentrazione di acrilamide e di
bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa
grandezza.
• La concentrazione di bis-acrilamide può variare
dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel.
• Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti
ottenuti per polimerizzazione del gel tra due
lastre di vetro, che consentono il caricamento di
più campioni• Prima del caricamento le proteine in genere sono
denaturate, ridotte ed alchilate
17
STRUTTURA RAMIFICATA DELLA
POLIACRILAMIDE
18
STOCK SOLUTIONS FOR POLYACRYLAMIDE GEL PREPARATION
Monomer solution
30% T, 2.5% C
30% T, 3% C
30% T, 4% C
Mix 29.25 g of acrylamide and 0.75 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
Mix 29.10 g of acrylamide and 0.90 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
Mix 28.80 g of acrylamide and 1.20 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml.
Initiator solution
40% (w/v) ammonium persulphate
This reagent is stable at 4°C for no more than 1 week
Catalyst
TEMED
This reagent is used undiluted. It is stable at 4°C for several months.
19
20
Caricamento del
campione per una
corsa di
elettroforesi su gel
21
VASCHETTA PER GEL
22
AZIONE DI SDS SULLE PROTEINE
23
IL MERCAPTOETANOLO RIDUCE I
PONTI DISOLFURO
24
SDS-PAGE di
miscele di
proteine
ridotte ed
alchilate in
urea 6
mol/L
25
Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide.
Isoelettrofocalizzazione
26
28
ANFOLINE
sostanze anfolitiche usate in isoelettrofocalizzazione
29
30
31
32
33
COMMON ADDITIVES FOR IEF
Additive
Purpose
Sucrose,
Glycerol
To improve the mechanical
5-20%
properties of low %T gels and to
reduce water transport and drift.
The increased viscosity slightly slows
the focussing process.
Glycine,
Taurine
To change the dielectric constant 0.1-0.5 M
of the medium. This increases the
solubility of some proteins (e.g.
globulins) and reduces ionic
interactions
Disaggregation of supramolecular 2-4 M
complexes.
Glycine is zwitterionic between pH 4
and 8, Taurine between pH 3 and 7.
Their presence somewhat slows the
focussing process and shifts the
resulting gradient.
Unstable in solution especially at
alkaline pH.
Solubilisation of water-insoluble
proteins, denaturation of
hydrophilic proteins.
Urea is soluble at >10°C; it
accelerates
polyacrylamidepolymerisation, so
reduce the amount of TEMED added.
To be added to the polymerising
solutions just before thè catalysts to
avoid foaming; they interfere with
polyacrylamide binding substrata;
they are precipitated by to reactive
TCA and require a specific staining
protocol.
Urea
Urea
Non-ionic
Solubilisation of amphiphilic
and
proteins.
zwitterionic
detergents
Concentration
6-8 M
0.1-1%
Limitations
34
35
OFF-GEL
il gradiente di pH necessario alla focalizzazione può essere formato dal passaggio della
corrente in una miscela di sostanze anfotere, gli anfoliti trasportatori (CA): CA-IEF,
oppure preformato attraverso la copolimerizzazione in una matrice di PAA di
acrilamidoacidi e acrilamidobasi, formando gradienti di pH immobilizzati: IPG
38
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
40
ESTRATTO DI PROTEINE VEGETALI…
41
…STRESS SALINO
42
GEL D’AGAROSIO
• L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6
anidro galattosio.
• L' agarosio è sciolto in opportuno tampone: Tris Borato
EDTA (TBE) oTris Acetato (TAE) e fatto gelificare su un
supporto di vetro o di plastica.
• Si crea così una matrice gelificata le cui maglie permettono
la separazione di macromolecole a diverso PM.
• Anche per l'agarosio è possibile intervenire sulla
concentrazione per favorire la migrazione di materiale più o
meno grande.
• In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo
0,3% - 2%.
43
unità strutturale L-galattosil-3,6-anidro-L-galattosio
doppie eliche
fasci di doppie eliche
44
UTILIZZAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO
PER LA SEPARAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
45
CAPACITA’ SEPARATIVA
46
Separazione elettroforetica di
frammenti di DNA
ESEMPIO DI SEPARAZIONE
48
EVIDENZIAZIONE DELLE BANDE
49
50
ELETTROFORESI CAPILLARE
Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono:
•convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al
flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di
temperatura che porta all’allargamento dei picchi•difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi.
Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della
tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In
questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un
sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale il
calore di Joule è più facilmente disperso con vantaggi
evidenti sulla risoluzione.
51
PROFILO PIATTO DEL FLUSSO
ELETTROOSMOTICO
Il profilo piatto del flusso è vantaggioso dal
momento che non contribuisce direttamente alla
dispersione del soluto (cosa che avverrebbe nel
caso di flusso laminare dove le componenti che
si trovano al centro del tubo migrano ad una
velocità maggiore di quelle che si trovano ai
bordi.
Effetto del gradiente di temperatura
schema del gradiente di temperatura in un capillare, dal centro all'ambiente
esterno.
La dissipazione termica del calore attraverso le pareti del capillare può dar luogo a
temperature più alte nel centro del capillare piuttosto che alle pareti
Tali gradienti di temperatura causano differenze locali di viscosità nel buffer e53
quindi una migrazione non uniforme.
54
Le 4 modalità in cui può essere
condotta l’elettroforesi capillare
55
ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL
• Separazione per elettroforesi
capillare su gel in presenza di
sodio dodecilsolfato (SDS-CGE)
di una serie di proteine:OG:
colorante Orange-G(rif.)
• 1)β-lattalbumina(PM 14200 Da
2)Anidrasicarbonica (PM 29000
Da) 3)Ovalbumina(PM 45000)
4)Albumina di siero bovino (PM
66000) 5)FosforilasiB (PM
97400) 6)β-galattosidasi(PM
116000) 7) miosina(PM 205000)
56
La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC.
Rispetto alla tipica CZE il capillare è impaccato con una fase stazionaria
tipica per l’HPLC in fase inversa (C18, C8): La presenza di gruppi silanolici
sulla superficie delle particelle di impaccamentosi traduce in un forte
incremento del flusso elettroosmotico, rispetto all’elettroforesi capillare
convenzionale.
Poiché il flusso
elettroosmotico ha un
profilo piatto, non
parabolico,
l’allargamento di banda è
decisamente inferiore
rispetto all’HPLC e quindi
l’efficienza molto
superiore, anche se
inferiore rispetto alla
CZE.
57
RIVELAZIONE OTTICA
La configurazione tipica prevede la
presenza di un’apertura nel
rivestimento di poliimmide (non
trasparente alla radiazione UV) posto
intorno al capillare di silice,
attraverso la quale passa il fascio
della radiazione incidente che
attraverso perpendicolarmente il
flusso di analita e raggiunge poi il
rivelatore.
Il fascio della radiazione deve essere
estremamente focalizzato, data
l’esiguità dell’ampiezza di banda.
Il rivelatore può essere un singolo
fototubo fotomoltiplicatore o
un DAD (DiodeArrayDetector).
58
PULSED FLOW
ELETTROPHORESIS
While in general small fragments can find their way through the gel matrix more easily than
large DNA fragments, a threshold length exists above 30–50 kb where all large fragments will
run at the same rate, and appear in a gel as a single large diffuse band.
However, with periodic changing of field direction, the various lengths of DNA react to the
change at differing rates. That is, larger pieces of DNA will be slower to realign their charge
when field direction is changed, while smaller pieces will be quicker. Over the course of time
with the consistent changing of directions, each band will begin to separate more and more
even at very large lengths. Thus separation of very large DNA pieces using PFGE is made possible
MICROFLUIDIC