IMMUNOBLOTTING
Pag. 322 par. 7.6
Blocking
molti siti di legame della membrana (di nitrocellulosa
o PVDF) rimangono liberi da proteine dopo il
trasferimento
quindi
si devono bloccare questi siti con
BSA o dry Milk (latte in polvere)
prima dell’incubazione con anticorpi
La BSA e’ generalmente piu’ purificata del latte in
polvere ma contiene epitopi identici, quindi ha
meno capacità “bloccante” rispetto al latte
Il latte tuttavia non e’ raccomandato se si usano
anticorpi che riconoscono carboidrati.
Il detergente non ionico
Tween-20
(stringenza dell’ ibridazione)
Il TWEEN nel buffer di incubazione con l’anticorpo
serve per interferire con il legame aspecifico dell’anticorpo
alla membrana
Un effetto indesiderato e’ che il Tween interferisce anche
con il legame tra antigene e anticorpo e puo’ causare la
dissociazione delle proteine dal filtro.
Quindi la concentrazione di Tween deve essere
attentamente calibrata e dipende dalla forza dell’
interazione tra ligando e anticorpo
Anticorpo secondario
Coniugato a: Fluoroforo o
Immuno-blotting :
HRP o AF
1. separazione del campione tramite
PAGE
(Poliacrilammide
elettroforesi)
2.
Anticorpo
secondario
Anticorpo
primario
Membrana
Proteina
legata alla membrana
Western
gel
blotting:
trasferimento
delle
proteine
separate
elettroforeticamente su membrana
3. “BLOCKING”:
bloccaggio
dei
siti
aspecifici
4. Rivelazione con anticorpi: primari
(che riconoscono e legano recognize
la proteina specifica di interesse) e
secondari
Perché nell’immunodetection si usa un anticorpo
secondario?
Anticorpo secondario
Coniugato a: Fluoroforo o
HRP o AF
Anticorpo
secondario
Anticorpo
primario
Membrana
Proteina
legata alla membrana
L’anticorpo secondario
riconosce specificamente le
IgG
del primario
ed è coniugato con
composti che ne
permettono la
evidenziazione
L’ anticorpo secondario può essere coniugato a:
Anticorpo secondario
Coniugato a: Fluoroforo o
HRP o AF
.
-fluorofori,
- colloidi d’oro
-radioisotopi
o, piu’ comunemente,
Anticorpo
secondario
Anticorpo
primario
Membrana
ad un enzima
(es. Fosfatasi alcalina AF
o perossidasi di rafano
HRP)
ECL
(Enhanced Chemioluminescence System)
M
E
M
B
R
A
N
A
Ab
secondario
coniugato ad
HRP
Substrato ECL
Luce emessa
P
Rivelazione:
Ab primario
X-Ray film
CCD camera
La perossidasi di rafano (HRP)
in presenza di perossido di idrogeno
ossida il suo substrato, il luminolo, con concomitante emissione di luce
10 volte piu’ sensibile di un metodo colorimetrico
Colorazione delle proteine su carta
Ponceau S
Colorazione delle proteine trasferite su carta con
Ponceau S
e’ un metodo rapido e reversibile di
colorazione delle proteine dopo
trasferimento su carta.
meno sensibile del Comassie ma NON
interferisce con le procedure di
immuno-detection
Ponceau S
C22H12N4O13S4.Na4
Ponceau S Staining Solution
:(0.1%(w/v)
Ponceau S in 5%(v/v) acetic acid)
Es. Colorazione su membrana:
Es. Colorazione su gel:
Gel SDS-PAGE
colorato con CBB
ECL detection su membrana NC
Sec4GFP
MW
1
2
Sec4
Membrana colorata con PonceauS
Altri tipi di elettroforesi:
One Dimensional (1D) Protein Electrophoresis
Separation:
Isoelectric focusing (IEF) (par 10.3.4)
2D PAGE
pag 385 paragrafo 8.5.1
Isoelectric focusing (IEF)
IEF e un metodo per separare le proteine secondo
il loro punto isoelettrico
In un gradiente di pH e
in presenza di un campo
elettrico
le proteina migreranno
fino a raggiungere
il punto nel gradiente
dove la loro carica e’ nulla:
Cioè al loro Punto isoelettrico
IEF impiega gel orizzontali su piastre di vetro o fogli di
plastica e percentuali di acrilammide e agarasio che
permettono la libera mobilità dela molecole
Gli anfoliti coprono
diversi di pH (es.pH 3-10
o pH7-8)
Il range di pH va scelto in
dipendenza dei pI delle
proteine di interesse
Per creare i gradienti nel gel
si usano anfoliti
=
miscele complesse di
di acidi poliammino-policarbossilici sintetici
Isoelectric focusing of proteins (IEF)
Utile per separare proteine con differenti modificazioni (es. Fosforilazioni)
o isoenzimi
Creazione di un gradiente
di pH usando anfoliti
http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_IEF+Separation
A. Nessun voltaggio applicato
B. Gli anfoliti e le proteine si muovono quando
la corrente e’ applicata secondo la loro carica
C. Al pH isolelettrico le proteine sono “focused”
cioè ferme
PROTEOMICA
L'elettroforesi bidimensionale (2D-Gels)
ID=IEF. Le proteine vengono assorbite su strisce di gel secchi che hanno
gradienti di pH immobilizzati. Una volta idratate e applicato il campo elettrico
le proteine acide che si trovano sul lato alcalino del gel dissoceranno e
saranno
. caricate negativamente. A causa del campo elettrico queste proteine
migreranno al polo positivo (il lato acido del gel).
2D=SDS-PAGE
ID
pH 11
I
E
F
pH 2
Gel figure from http://www.microbiology.science.ru.nl/tech/twod/
2D
2D: SDS-PAGE
The MALDI-ToF
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
Time-of-Flight)
MALDI ToF permette l’ analisi rapida di proteine digerite purificate da spots
ottenuti da gel 2D or possibilmente 1D gel, by peptide mass fingerprinting.
Parent masses of whole intact proteins can also be measured. Questo
strumento è anche eccellente per determinare modificazioni che cambiano la
massa o lo stato di carica di proteine note.
Es. di uno strumento di
Maldi-Tof in commercio
Spettrometria di Massa
MS-MALDI TOF
-Le molecole di campione sono convertite in ioni gassosi
-gli ioni sono poi accellerati in un campo elettrico o magnatico o
viene misurato il TOF di ioni di massa diversa in una data distanza
- separati da un’analizzatore di massa-carica (m/z)
-il rivelatore detrmina il rapporto massa/carica di ogni specie
ionizzata
Sistema ad alto vuoto
entrata
sorgete
di ioni
MALDI
Analizzatore
di massa
rivelatore
Analisi
dati
TOF
TOF=Time of Flight
Tempo impiegato da ioni di massa diversa per percorrere un data distanza
MALDI-TOF
(Ionizzazione per desorbimento laser assistito da una matrice)
Time of flight) mass spectometer
2D PAGE pag 385 paragrafo 8.5.1
MALDI, spettrometria di massa TOF e MALDI-TOF
Pag.408-419 paragrafo 9.3.7
L’elettroforesi capillare e’ usata per
la separazione analitica delle proteine, aminoacidi,
peptidi e frammenti di DNA
Elettroforasi capillare
Fonte di luce
rivelatore
dati
catodo
A
S
S
O
B
A
N
Z
A
anodo
tempo
TIPI di ELETTROFORESI CAPILLARE
CE: Elettroforesi capillare,
CZE: elettroforesi capillare
in soluzione libera
HPCE: elettroforesi capillare zonale
Elettroforasi capillare
Fonte di luce
rivelatore
Alto
voltaggio
(typicamente
10-30kV)
capillare
sottile (25100mm).
dati
catodo
A
S
S
O
B
A
N
Z
A
anodo
tempo
Le estremità del capillare sono immerse nel serbatoi riempiti con l’elettrolita.
Gli elettrodi sono fatti di platino e sono anche inseriti nei serbatoi con l’elettrolita.
Il campione (nanomoli) viene inniettato a una estremità nel capillare.
Generalmente un rivelatore ad assorbanza UV si trova alla estremità opposta
capillare.Il rivelatore genera un grafico in funzione del tempo
del
Vantaggi: nanolitri di campione sono sufficienti e l’analisi è effettuata
in tempo reale con alta sensibilità (fentomoli 10-15)
Tecniche cromatografiche
Nella cromatografia si definisce :
una fase mobile
(liquida o gassosa che fluisce sopra o attraversa
una fase stazionaria
(un solido, un gel, un liquido o una miscela solido liquido
immobilizzata).
I composti che devono essere separati si devono distribuire tra
fase mobile e stazionaria in modo che abbiano diversi coefficienti
di distribuzione
Cromatografia su colonna.
La fase stazionaria è attaccata ad una matrice
(un supporto inerte e insolubile) impaccata in una colonna
la fase mobile passa attraverso la colonna per gravità o
usando un sistema di pompaggio oppure un gas sotto
pressione.
Caricamento
del campione
Aggiunta
del solvente
Colonna
contenente
la fase
stazionaria
Recupero
del campione
Schema di una semplice separazione in cromatografia a
fase liquida
La cromatografia a fase mobile liquida semplice
consiste di una colonna che tiene una fase stazionaria
nell'equilibrio con un solvente.
Le fasi stazionarie tipiche (e le loro interazioni con i soluti)
sono:
1) solidi (assorbimento Es. Silice QIAprep),
2) gruppi ionici su una resina (scambio ionico),
3) liquidi su un supporto solido inerte (di ripartizione ) e
4) particelle inerti porose (size-esclusion).
Le molecole pi ù grandi del formato
del poro non possono entrare nei pori
ed eluiscono insieme al primo picco
nel cromatogramma.
Cromatografia di gel filtrazione
Le molecole che possono entrare nei
pori avranno un tempo di soggiorno
medio nelle particelle che dipende dal
formato e dimensione delle molecole.
Le molecole differenti quindi hanno
tempi totali differenti di transito
attraverso la colonna.
Le molecole che sono pi
ù piccole di il
formato del poro pu ò entrare in tutti i pori
ed hanno il tempo massimo del soggiorno
sulla colonna e si eluiscono insieme come
l'ultimo picco nel cromatogramma. Questo
ultimo picco nel cromatogramma
determina il limite totale di permeazione
Campioni piccoli
Campioni grandi
La cromatografia a fase liquida (LC)
è una tecnica cromatografica analitica che è utile
per la separazione gli ioni o di molecole dissolte in un solvente.
La soluzione del campione rimane a luogo in contatto con una
seconda fase solida o liquida, i soluti differenti interagiranno con
l'altra fase secondo le differenze
nell'adsorbimento, scambio ionico, dimensione o forma.
I componenti della miscela si separeranno usando queste
differenze ed esse determineranno il periodo di transito dei soluti
attraverso una colonna
La scelta tra fase mobile e stazionaria
viene fatta in modo che i composti da separare abbiano
diversi
coefficienti di distribuzione Kd
Kd
descrive il modo in cui un composto si distribuisce
tra due fasi immiscibili A e B a temperatura costante.
Kd =(concentrazione nella fase A/ concentrazione
nella fase B)
Capacità di ritenzione (K’)
è
la quantità totale di sostanza presente in una fase
divisa la quantità totale presente nell’ altra fase
In pratica
Capacità di ritenzione K’= Kd . VA/VB
Kd=coefficiente di distribuzione (concentrazione
relativa dell’analita tra ledue fasi)
VA=volume del composto A;
VB=volume del composto B
Tre diversi metodi di eluizione:
a. semplice o progressiva;
b. a stadi;
c. a gradiente di potere eluente.
A. Eluizione semplice
la fase mobile rimane la medesima durante tutta
l'eluizione e le sostanze escono dalla colonna in
dipendenza dai loro coefficienti di ripartizione
B. L'eluizione a stadi
si utilizza quando si vogliono separare due sostanze
che presentano un coefficiente di ripartizione molto
diverso tra la fase fissa e la fase mobile utilizzate.
C. Eluizione a gradiente di potere
eluente
la variazione della composizione della fase
mobile è progressiva, anziché brusca come
nel metodo a stadi.
Questo metodo di eluizione viene utilizzato
soprattutto quando le sostanze che costituiscono
la miscela in studio presentano
valori molto diversi di coefficiente di
ripartizione tra fase fissa e fase mobile.
I componenti che si eluiscono dalla colonna
possono
essere misurati da un rivelatore
e/o essere raccolti per ulteriore analisi.
Cromatogramma e parametri che influenzano
la risoluzione cromatografica
A280
Wb1=ampiezza del picco1
Wb2=ampiezza del picco2
Vr1=il volume del picco 1
Vr2=il volume del picco 2
Pick2
Pick1
Vr1
Wb1
Vr2
Volume di
eluizione
Risoluzione:
è la misura della separazione relativa raggiunta tra
due
materiali cromatograficamente distinti
R= Vr2 - Vr1
½ (Wb2 + Wb1)
Wb1=ampiezza del picco1
Wb2=ampiezza del picco2
Vr1=il volume del picco 1
Vr2=il volume del picco 2
La massima risoluzione è lo
scopo primario di ogni
purificazione
Capacità o fattore di risoluzione
k
E’ la misura della ritenzione di un componente del campione
da non confondere con la capacità di caricamento della
colonna
k = Vr2-Vm
Vm
Vm= volume della
fase mobile
Vr2= volume di eluizione
del picco 2
Pick1
EFFICIENZA
(N)
Pick2
Vr1
Vr2
Wb1
Wb2
E’ la misura
dell’ampiezza del
picco di eluizione
della colonna