MISURA DEI SEGNALI
INTRACELLULARI DI Ca2+
(Microscopia ad epiflurescenza)
La fluorescenza
Diagramma di Jablonsky
Step 1 ECCITAZIONE: Quando un fluoroforo
(una sostanza in grado di produrre il fenomeno
della fluorescenza) assorbe un fotone di
energia hnex passa dal livello fondamentale
S0 ad un livello elettronico eccitato S1’ (detto
singoletto).
Step 2 STATO ECCITATO: Lo
stato eccitato permane per un
breve lasso di tempo (1-10 x 10-9
sec), durante il quale dissipa
parte dell’energia assorbita a
causa di moti vibrazionali,
passando ad uno stato eccitato
S1 (detto singoletto rilassato) a
energia lievemente inferiore
rispetto a S1’.
Step 3 FLUORESCENZA: il
fluoroforo ritorna al livello
fondamentale So in seguito ad
emissione di un fotone di
energia hnem A causa della
parziale dissipazione di energia
durante
lo
stato
eccitato,
l’energia del fotone emesso è
minore rispetto a quella del
fotone assorbito, pertanto la
lunghezza d’onda è maggiore.
hnex – hnem = spostamento di Stokes
Eex ≥ Eem
I fluorofori per il Ca2
• Started with EGTA, the first chelator
shown to have high selectivity for Ca2+
over Mg2+ (~105).
• Binding of Ca2+ is 1:1.
• BAPTA made by converting aliphatic
amino groups of EGTA into aromatic
amino groups.
• BAPTA retains high selectivity for
Ca2+ over Mg2+
Coloranti raziometrici: il Fura-2
Il FURA-2 manifesta la singolare caratteristica di subire uno spostamento dello spettro di
assorbimento in funzione della [Ca2+] libero
In assenza di Ca2+, il fura-2 presenta uno spettro di eccitazione piuttosto ampio, con un
picco a circa 380 nm. Quando si lega al Ca2+, lo spettro di eccitazione si sposta ancora di
più nell’UV: picco a 340 nm. In presenza di Ca2+, quindi, l’intensità della fluorescenza
emessa dal fura-2 (misurata a 510 nm) aumenta se si eccita a 340 nm (F340) e diminuisce se
si eccita a 380 nm (F380).
Coloranti raziometrici: il Fura-2
Ne consegue che eccitando alternativamente alle lunghezze d’onda di
340 nm e 380 nm si raccoglie una coppia di segnali alla lunghezza
d’onda di emissione di 510 nm per ogni punto sperimentale.
Effettuando il rapporto dei due valori è possibile, quindi, ottenere una
misura che è indipendente dalla concentrazione dell’indicatore nel
campione.
Coloranti a singola : il Fluo-3
Spettri
di
emissione
del
Fluo-3 ottenuti
eccitando
alla
lunghezza
d’onda di 488
nm
e
in
presenza
di
diverse
concentrazioni
di Ca2+ libero
CALIBRAZIONE RAZIOMETRICA
• utilizzabile solo con indicatori che
presentano shift dello spettro di
eccitazione o emissione
• intensità di fluorescenza misurata a due
lunghezze d’onda (con variazioni opposte
del segnale a seguito del legame con il Ca2+)
• elimina le variabili legate a concentrazione
dell’indicatore, percorso ottico, intensità di
eccitazione, efficienza di rilevazione
Il caricamento delle cellule:
acid vs. ester
• Free acid forms of BAPTAbased indicators are
hydrophobic and do not cross
the plasma membrane (can
be loaded by microinjection or in
a patch pipette).
• Addition of AM ester groups
shields polar features and
permits indicators to readily
permeate the cell membrane.
• Once inside, intracellular
esterases convert indicators to
free acid form which remains
trapped inside the cell.
Il caricamento delle cellule:
acid vs. ester
PROBLEMI:
compartimentazione
idrolisi incompleta dell’AM estere
perdita di fluoroforo
Microscopia a fluorescenza
Specchio dicroico
Xeno
Mercurio
(o monocromatore)
Elemento chiave di un
microscopio a fluorescenza.
Permette di separare la luce
di eccitazione da quella di
emissione. Esso, infatti, è in
grado di riflettere la luce al di
sotto di una certa lunghezza
d’onda (lunghezza di taglio) e
di essere trasparente alla
luce con lunghezze d’onda
superiori.
La
luce
di
eccitazione viene, quindi,
riflessa verso il preparato,
ma solo la luce emessa dal
fluoroforo
raggiunge
gli
oculari del microscopio.
Microscopia a fluorescenza