Laboratorio Professionalizzante
di Spettroscopia
Prof. Lorenzo Stella
Settore 5 Livello 1 Stanza 4
Tel.: 06-7259-4463
E-mail: [email protected]
La luminescenza
Luminescenza:
emissione di luce da atomi, molecole o cristalli
eccitati elettronicamente.
Eccitazione luminosa:
~ns:
fluorescenza
~ms:
fosforescenza
Eccitazione chimica:
Chemiluminescenza
Spettroscopia di fluorescenza:
Informazioni ottenibili
Vantaggi sperimentali
Concentrazione della sonda fluorescente
(fluoroforo), fino a nM.
Ambiente chimico ed accessibilità al
solvente del fluoroforo.
Dinamica dell’ambiente del fluoroforo.
Dinamica conformazionale e diffusionale
della (macro)molecola fluorescente (nei psns).
Numero e popolazione di specie presenti in
soluzione.
Distanza tra due fluorofori
Elevatissima sensibilità
(fino alla singola
molecola).
Flessibilità di
campionamento (anche
misure “in vivo”).
Basso costo e semplicità
della strumentazione.
Alcuni esempi:
•Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di
fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci,
sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …
Il diagramma di Jablonski
Conseguenze
Stokes shift (spostamento ad energie più basse).
Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione).
Regola dell’immagine speculare.
Sensibilità alla dinamica.
Tempo di vita dello stato eccitato
dN *
 (k r  k nr )N *
dt
dN *
 (k r  k nr )dt
*
N
N*
t
dN *
* N *  (k r  k nr )  dt
0
N0
kr= costante di decadimento radiativo
kn.r.= costante di decadimento attraverso i
processi non radiativi
N*= numero di molecole nello stato eccitato
N * 
ln *  (k r  k nr )t
N 0 
N*
 e (kr knr )t
*
N0
N *  N *0 e (kr knr )t
I  kr N *

t
I  I 0e 
1

 tempo di vita
kr  knr
I
t
Fluorofori
Tutte le molecole assorbono.
In fase condensata (solidi, soluzione) sono
fluorescenti solo molecole con probabilità di
transizione radiativa molto elevata: sistemi ad
elevata coniugazione.
Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.
Il fluorimetro
Beam splitter
Lampada
Campione
lecc.
Monocromatore
di eccitazione
Lente
lecc.
Lente
Monocromatore
di emissione
Computer
PMT
“riferimento”
PMT
“segnale”
Osservabili: intensità
Dipende da:
Ecc.
Concentrazione di fluoroforo
Efficienza dell’assorbimento di radiazione (e)
Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica)
Em.
fotoni emessi
decadimenti radiativi
kr
  resa quantica 


fotoni assorbiti
totale decadimenti
kr  knr
F  fotoni emessi = (fotoni assorbiti)   
per A' 1
 (I 0 ' I ')   (I 0 ' I 0 '10A ' )    (1 10A ' )
 d

 d

A
10A  10A A  0   (10 A ) A  1 A   e ln(10 )  
dA
A  0
dA
A  0
 d

 1 A   e A ln10   1 A   ln10 e A ln10 A  0  1 A  ln 10
dA
A 0

1 10A  A ln10
(1 10A' )  A'ln10

F    A   C e  l
Osservabili: intensità e resa quantica
•L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché
dipende anche da:
•Intensità della lampada
•Efficienza dei monocromatori
•Banda passante utilizzata
•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore
•Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata
•Al contrario,
•l’assorbanza è una misura assoluta [A=log(I0/I)]
•la resa quantica è una misura assoluta [=kr/(kr+knr)]
F

A
F0
0 
A0
F A0

0
A F0
Filtro interno
Ecc.
Ecc.
Em.
Em.
Campione diluito
Campione concentrato

F  I(centro cella )  I0 10

A( lecc. )  0.03 10
0.03
2
A( lec c. )
2
 0.97
Assorbanza contro fluorescenza
Inoltre: l’assorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no
•sensibilità molto maggiore all’ambiente del cromoforo (processi non radiativi)
•Sensibilità alla dinamica.
Osservabili: spettro di emissione
lecc. fissa.
lem. variabile.
F in funzione di lem..
Rilassamento del solvente
S1
E
Ass.
S1’
Em.
hn
S0’
hn
S0
c-Hex
DMF EtOH
H2O
Esempi
Osservabili: spettro di eccitazione
lem. fissa.
lecc. variabile.
F in funzione di lecc..
Se:
unico fluoroforo
 indipendente da lecc.
(unico stato eccitato).
A<<1
Allora F(lecc.)
A(lecc.)
•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori
Smorzamento della fluorescenza (quenching)
Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo
eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo.
Misurando l’efficienza di smorzamento della fluorescenza si può
determinare l’accessibilità del fluoroforo al quencher.
k nr  k nr0  k q [Q]

kr
k r  k nr0  k q [Q]
0
1 k r  k nr  k q [Q] k r  k nr0 k q
1 kq


 [Q] 
 [Q]

kr
kr
kr
 0 kr
 0kq
0
 1
[Q]  1  K [Q]

kr
F0
 1 K[Q ]
F
a
1
Esperienza
Spettri di assorbimento, emissione ed
eccitazione.
Intervallo di dipendenza lineare di F da C.
Solvatocromismo
Processi di associazione
Il fluoroforo: PRODAN
d = 10 Debye
d = 2.8 Debye
6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene
(PRODAN)
c-Hex
DMF EtOH
H2O
Le ciclodestrine
•Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8).
•Si ottengono per conversione enzimatica dell’amido.
Complessi di inclusione
• La struttura 3-D delle ciclodestrine è a
tronco di cono, con una cavità apolare.
• In soluzione acquosa formano complessi di
inclusione con molecole idrofobe.
• Questa proprietà viene utilizzata per
modificare le proprietà della molecola
ospite:
–
–
–
–
solubilità
volatilità
tossicità
resistenza alla biodegradazione.
• I complessi di inclusione hanno inoltre
molteplici applicazioni in campo catalitico e
separativo.
• Poiché la ciclodestrina è chirale, i complessi
di inclusione sono enantioselettivi.
Complessazione
ciclodestrina-PRODAN
15
F-F 0
10
5
0
0
Applicazione: sensori a fluorescenza.
20
40
60
80
[-CD] (mM)
100
120