IL CALCIO COME
MESSAGGERO
INTRACELLULARE
• Ca2+ è un messaggero intracellulare universale
• Ca2+ è coinvolto nella regolazione specifica e
selettiva di processi cellulari (contrazione muscolare,
fecondazione, trasmissione sinaptica, sopravvivenza,
divisione, differenziamento e movimento cellulare,
coagulazione, etc.)
• Ca2+ non può essere visualizzato direttamente
• per misurare variazioni di Ca2+ si usano specifiche
molecole con proprietà ottiche particolari che si
modificano a seguito del legame con Ca2+
Il calcio intracellulare è altamente compartimentalizzato:
la sua concentrazione nel citosol è mantenuta molto bassa a
spese di energia
Ca2+ 2 mM
permeazione passiva:
canali del calcio
permeazione attiva:
antiporto Na/Ca e
pompe (PMCA e
SERCA)
5.1
SERCA
ER
mit
CaBPr
IP3R
RyR
N
CaBPr
CaBPr
Ca2+ 100 nM
canali
PMCA
e
Na/Ca
TECNICHE DI FLUORESCENZA
La fluorescenza è il risultato di un processo a tre
stadi che si verifica in molecole chiamate fluorofori
o coloranti fluorescenti o sonde
stadio 1 – eccitazione
stadio 2 – stato eccitato
stadio 3 – emissione di fluorescenza
DIAGRAMMA DI JABLONSKI
stato elettronico eccitato
stato elettronico eccitato
emivita della stato eccitato
(10-9-10-8 s)
eccitazione
emissione
di fluorescenza
efficienza quantica
stato di riposo
fotoni emessi (stadio 3)
fotoni assorbiti (stadio 1)
SPETTRO DI FLUORESCENZA
STRUMENTAZIONE
Sistemi di rivelazione della fluorescenza
sorgente di eccitazione
fluoroforo
filtri
rivelatore
Tipi di strumenti
spettrofluorimetro
microscopio in fluorescenza
citometro a flusso
CRITERI DI SELEZIONE degli indicatori di
calcio
• intervallo di interesse della concentrazione di Ca2+
(costante di dissociazione Kd; risposta misurabile
0.1Kd to 10Kd)
• modalità di misura (dati qualitativi vs. quantitativi, tipo
di strumento, sorgente di rumore etc.)
• intensità della fluorescenza emessa dall’indicatore
• registrazione simultanea di altri parametri biologici
DIAGRAMMA SCHEMATICO DEL METODO DI
CARICAMENTO DEL FLUOROFORO: UTILIZZO
DELL’ACETOSSIMETIL (AM) ESTERE
PROBLEMI:
compartimentazione
idrolisi incompleta dell’AM estere
perdita di fluoroforo
INDICATORI FLUORESCENTI ECCITATI
DA LUCE UV
• Fura-2, Indo-1 and derivati
• Quin-2 and derivati
• indicatori con affinità intermedia (Fura4F, Fura-5F & Fura-6F; Benzothiaza-1 &
Benzothiaza-2)
• indicatori a bassa affinità (Fura-FF,
BTC, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, MagIndo-1)
• eccitazione a 340 e 380 nm.
• emissione at 510 nm
2+] dipende dal rapporto
•
[Ca
Ex at 340 nm
Ex340/Ex380,
independentemente dalla
concentrazione di fura-2 e
da
altri
parametri
esterni
Ex at 380 nm
Fura-2
Indo-1
• eccitazione a 380 nm
• doppia emissione (400
e 475 nm)
• [Ca2+ ] = rapporto tra
Em400 / Em475
indipendente dalla
concentrazione di indo
CALIBRAZIONE RAZIOMETRICA
• utilizzabile solo con indicatori che presentano
shift dello spettro di eccitazione o emissione
• intensità di fluorescenza misurata a due
lunghezze d’onda (con variazioni opposte del
segnale a seguito del legame con il Ca2+)
• elimina le variabili legate a concentrazione
dell’indicatore, percorso ottico, intensità di
eccitazione, efficienza di rilevazione
calibrazione raziometrica
esempio di calibrazione con fura-2 mediante utilizzo di
ionoforo (ionomicina o simili)
[Ca]=Kd x (R-Rmin)/(R-Rmax) x Sf2/Sb2
Rmin=A1/A2
Rmax=B1/B2
Sf2/Sb2=A2/B2
INDICATORI ECCITATI DALLA LUCE VISIBILE
- VANTAGGI
• possibilità di utilizzo con microscopia
confocale laser
• minore autofluorescenza
• minor danno e scattering cellulare
• maggiore assorbanza
• compatibilità con composti caged
INDICATORI ECCITATI NEL VISIBILE
• Fluo-3, Rhod-2 e relativi derivati
• indicatori a bassa affinità: Fluo-5N,
Rhod-5N, X-Rhod-5N e relativi derivati
• Calcium Green, Calcium Orange e
Calcium Crimson
• Oregon Green 488 BAPTA
• Fura Red
• Calcein
Fluo-3
• indicatore eccitato nel
visibile (488 nm, sorgente
laser Argon).
• emissione a 525 nm
• non è raziometrico
Fluo-3 e Fura Red
• l’uso dei due indicatori risolve il
problema della calibrazione
Fluo-3 (aumento a 525 a seguito
del legame con il Ca2+) e Fura
Red (diminuzione a 650).
• entrambi eccitati a 488 nm.
• [Ca2+ ] dipende dal rapporto
Em del Fluo-3 / Em del Fura Red,
independentemente dalla
[indicatore].
neuroni di bulbo olfattivo di rana
fluo3 e fura red
• risposta del Ca2+ a
trattamento con KCl e
nifedipina. l’immagine
è il rapporto di
immagini relative a
fluo e fura red
acquisite al
microscopio
confocale.
segnale di calcio attivato da recettori
metabotropici glutamatergici in neurone
purkinje di cervelletto embrionale di topo
CONIUGATI DEGLI INDICATORI
FLUORESCENTI
• coniugati con destrani
– destrani con fura e indo
– Calcium Green e Oregon Green 488 BAPTA
destrani
• derivati lipofilici per il rilevamento del calcio sotto
membranario
– Fura-C18 e Calcium Green-C18
SETUP DI
MICROSCOPIA
CONFOCALE
LASER (CLSM)
la CLSM consente di isolare
sezioni ottiche di un preparato e
di ricostruire
tridimensionalmente le variazioni
di calcio
bFGF
[Ca]i
50 s
control
2
3
1
100 ng/ml bFGF
INDICATORE BIOLUMINESCENTE
• la bioluminescenza è la produzione di luce
operata da fotoproteine presenti in alcuni
organismi
• la bioluminescenza non richiede illuminazione
• l’intensità luminosa è generalmente bassa
• L’equorina è una fotoproteina luminescente
isolata da una medusa
• l’equorina non è esportata o secreta, ma
deve essere microiniettata nelle cellule
l’equorina
ricombinante
consente di misurare
le variazioni di calcio
in distretti
intracellulari diversi
(mitocondri, nucleo...)
•Photoproteins
•A Ca2+-induced conformational change of the
apoprotein (depicted as a rod-shaped structure)
leads to peroxidation of the coenzyme (the
reduced form of the coenzyme coelenterazine is
shown in black and the oxidized form,
coelenteramide, is shown in dark blue), which
results in the release of blue light (see figure,
part A). Red circles represent the peroxide
molecules.
GFP-based probes
In the case of cameleon, a Ca2+-induced interaction between
calmodulin (CaM) and the CaM-binding peptide M13 increases
fluorescence resonance energy transfer (FRET) leading to a
decrease in the fluorescence of cyan fluorescent protein (CFP)
and an increase in the fluorescence of yellow fluorescent protein
(YFP) (see figure, part Ba). A similar FRET-based probe, FIPCB, was constructed that measured the concentration of free Ca2+
as a decrease of FRET (not shown). For the camgaroo probe, the
Ca2+-induced conformational change in CaM leads to an increase
in the fluorescence of YFP (see figure, part Bb). The Ca2+induced interaction between CaM and the binding peptide M13 of
pericam leads to changes in the fluorescence characteristics of
circularly permuted (cp)YFP (see figure, part Bc). A similar probe
with circularly permuted enhanced green fluorescent protein
(cpEGFP) has also been developed (not shown).
Sensitivity to pH is a bigger problem with GFPbased indicators than with synthetic dyes.
With the synthetic dyes, pH has an effect on
fluorescence and Ca2+ affinity only below
about pH 6.5, whereas with most GFP-based
probes, even pH changes around neutral can
lead to marked changes in fluorescence.
Finally, it is worth pointing out that the loss of
signal (owing to photobleaching and/or
photoisomerization) with protein dyes is more
significant than with synthetic dyes, and that
some GFPs have absorption spectra that are
not suitable for standard confocal microscope
laser lines.
Fig. 4. Targeting of GFP-based calcium sensors. CYT, cytoplasm;
ER, endoplasmic reticulum; MT, mitochondria; NUC, nucleus; PM,
plasma membrane; SGs, secretory granules.
Fluorescence resonance energy transfer
(FRET) is a quantum mechanical
phenomenon that occurs between a
fluorescence donor and a fluorescence
acceptor that are in molecular proximity
of each other if the emission spectrum of
the donor overlaps the excitation
spectrum of the acceptor. Under these
conditions, energy (E) is transferred nonradiatively from the donor to the acceptor
with an efficiency defined by the equation,
where r is the distance between the two
fluorophores and R0 (Förster distance) is
the distance at which 50% energy
transfer takes place (typically 20–60 Å).
R0 is dependent on the extent of spectral overlap
between the donor and acceptor, the quantum
yield of the donor and the relative orientation of
the donor and acceptor.
Excitation of a donor fluorophore in a FRET pair
leads to quenching of the donor emission and to
an increased, sensitized, acceptor emission.
Intensity-based FRET detection methods include
monitoring the donor intensity with or without
acceptor photobleaching, the sensitized acceptor
emission or the ratio between the donor and
acceptor intensity. Methods that are based on
fluorescence-decay-kinetics include determining
the rate of donor photobleaching, the decrease of
donor fluorescence lifetime or the appearance of
new components in the acceptor decay kinetics.
DAR-4M AM
• indicatore per NO
eccitato nel visibile (568
nm, sorgente laser
Argon).
• emissione a 585 nm
• non è raziometrico
(Figura successiva) Schematic depiction of the
structure and response mechanism of Cyclic
AMP Fluorosensor (FlCRhR). Fluorescence
resonance energy transfer from the
fluorescein-labeled (Fl) catalytic subunit to
the rhodamine-labeled (Rh) regulatory
subunit is eliminated upon cAMP-dependent
dissociation of the holoenzyme. The
resulting increase of the 488 nm light–
excited fluorescein (520 nm) to rhodamine
(580 nm) emission ratio can be used to
measure intracellular cAMP.