PROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE
Campo elettrico
Campo magnetico
l : lunghezza d’onda
l
a : ampiezza d’onda
a
n : frequenza d’onda
Direzione
di
propagazione
L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck:
E = h  n (energia di un singolo fotone)
l
n = 2 Hz
am
pie
zza
tempo
am
pie
zza
l
1s
spazio
l
n = 4 Hz
am
pie
zza
am
pie
zza
1s
tempo
l
spazio
E’ importante ricordare che frequenza e lunghezza d’onda non si
possono confrontare sullo stesso grafico
Lunghezza d’onda, frequenza e velocità di una qualsiasi onda
elettromagnetica sono correlate dalla relazione
c=ln
Variazione di l con l’indice di rifrazione del mezzo
n = 6,0 x 1014 Hz
l = 500 nm
n = 6,0 x 1014 Hz
l = 350 nm
n = 6,0 x 1014 Hz
l = 500 nm
ampiezza
distanza
aria
vetro
aria
Passando dall’aria al vetro, la velocità di propagazione diminuisce a causa dell’indice di
rifrazione; pertanto, rimanendo costante la frequenza (dipendente solo dalla sorgente
luminosa), diminuisce anche la lunghezza d’onda.
REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO
Frequenza,
Energia
Raggi X
10-2- 100 Å
UV lontano
UV vicino
Visibile
IR vicino
10-200 nm
200-400 nm
400-750 nm
0,75-2,5 mm
IR medio
IR lontano
Microonde
2,5-50 mm
50-1000 mm
l
0,1-100 cm
1 Å = 10 -10 m
1 nm = 10 -9 m
Onde
radio
1-1000 m
1 mm = 10 -6 m
REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO
Principali applicazioni delle
diverse onde
INTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTE
E0 , E1 , E2 : livelli elettronici
v0 , v1 , v2 : livelli vibrazionali
r0 , r1 , r2 : livelli rotazionali
L’energia assorbita viene ceduta
per diseccitazione termica o, più
raramente, radiativa
(fluorescenza o fosforescenza)
SPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILE
I0 (P0)
I (P)
Soluzione
campione
Intensità (I):
energia (numero di fotoni) che attraversa una
superficie unitaria (J/m2) in un secondo
TRASMITTANZA
T= I
I0
0≤ T ≤1
0% ≤ T ≤ 100%
ASSORBANZA
1
A = - log T = log
= log I0
T
I
numeri
adimensionali
0≤ A ≤∞
Spettro di assorbimento: diagramma ottenuto misurando l’assorbanza in funzione di l
lmax
Spettro di assorbimento della clorofilla
lmax :
lunghezza d’onda a cui
corrisponde un massimo
di assorbimento
cammino ottico
LEGGE DI LAMBERT-BEER
I0
I
b
I0
I’
Valida per radiazioni monocromatiche
dI’ = - Kdn
I’
N° totale
- dI’ = KI’
dn
∫
I0
I
dI’ = - K
I’
∫
0
N
dn
molecole
ln I = - KN
I0
ponendo N = K’bc (c: conc. soluzione)
ln I = - (K · K’)bc = - a’bc
I0
I
dn
I = e-a’bc
T = e-a’bc
I0
passando ai log e ponendo a = a’log e
log T = -abc
T = 10-abc
Poiché A = - log T
A = - log 10-abc = abc
A = abc
A = abc
A = a (assorbività, costante per l costante)
Per b = c = 1
A =a
bc
A
coefficiente di estinzione (o assorbanza specifica)
se b espresso in cm e c in g/L
a=e
coefficiente di estinzione molare (o assorbanza specifica molare)
se b espresso in cm e c in mol/L
1%
: in F. U. estinzione specifica di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm
1 cm
A
concentrazione
Deviazioni dalla legge di Lambert-Beer
a) deviazioni fisiche
- a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente
generando deviazioni positive o negative
A
concentrazione
- a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la l della
radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione
viene misurata, di fatto, a l diverse con scostamento dalla linearità
b) deviazioni strumentali
Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente:
le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la banda passante
Banda passante:
intervallo di radiazioni isolate
dallo strumento e convogliate
sulla soluzione in esame
Skoog, West, Holler, Crouch
c) deviazioni chimiche
Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico
tra due specie
Esempio:
CrO4 2- + 2H+
lmax: 372 nm
Cr2O7 2- + H2O
lmax: 450 nm
Se a 372 nm e pH = 1,
Assorbanza (CrO4 2-) = x
Se a 450 nm e pH = 1,
Assorbanza (Cr2O7 2-) = y
Diluendo successivamente
nel rapporto 1 a 10:
Diluendo successivamente
nel rapporto 1 a 10:
Assorbanza (CrO4 2-) > 1 x
10
Assorbanza (Cr2O7 2-) < 1 y
10
ANALISI QUANTITATIVA
Viene effettuata quasi sempre in corrispondenza della lmax in modo che:
- aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (vedi prima)
- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti
A = abc
Sensibilità = dA = ab
dC
La sensibilità è cioè  al cammino ottico b e al coefficiente di estinzione a
ANALISI IN ASSORBIMENTO
a) Metodo di confronto
Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo
e limitato alle soluzioni colorate
Ax
Ax = A1
A1
A2
Mantenendo il cammino ottico costante, se Ax = A1
A3
A4
cx = c 1
E’ possibile anche usare una sola soluzione standard
e variare i cammini ottici fino a quando:
Ax = A1
a bx cx = a b1 c1
cx = b1 c1
bx
b) Metodo diretto
Ax = a b cx
Conoscendo il coefficiente di estinzione a (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico b,
è possibile risalire alla concentrazione cx
Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione
che andrebbe preliminarmente verificata
c) Metodo retta di taratura
A
A3
Ax
A2
A1
c1
c2
cx
c3 Conc.
d) Metodo delle aggiunte (per matrici complesse)
- aggiunta singola (di analita puro)
A
A1
Ax
x+a
x
0
0
a
x
x+a
mg
- aggiunte multiple
A
A3
A2
A1
Ax
x
x+a
x + 2a
x + 3a
0
x
a
2a
3a
mg
Spettri in derivata: Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / l
A
Spettro UV-Vis
l
Derivata 1a
Derivata 2a
Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il rumore di fondo
Gli spettri in derivata consentono una migliore risoluzione di bande sovrapposte
negli spettri normali
Analita 2
A
Analita 1
Spettro UV-Vis
l
Derivata 2a
Analita 1
Analita 2
ADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZE
A
x+y
Atot = S Ai = S ai b ci
A
x
y
l1
l
l2
l1
A1 = A1x + A1 y = a1x b cx + a1y b cy
l2
A 2 = A 2 x + A 2 y = a 2 x b c x + a 2 y b cy
Nel caso di due sostanze:
Punto isosbestico: punto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibrio
A
Es.: HA
pH: 7.0
H+ + A -
pH: 6.0
pH: 5.0
pH: 4.0
pH: 3.0
l
Ais = ais b [HA]
+ ais
b [A- ] = ais b ( [HA]
+ [A- ]) =
ais b ctot
Operazioni di taratura
corpo opaco
0%
TRASMITTANZA
campione
analitico
100%
bianco
soluzione identica al
campione analitico,
ma priva dell’analita
ASSORBANZA
operazione di
azzeramento
bianco
Limiti di trasparenza (cut off)
di alcuni solventi:
Acqua
180 -195 nm Metanolo 200 -210 nm
Cloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nm
Errore fotometrico
± 5.0
± 4.0
Errore %
relativo
± 3.0
± 2.0
± 1.0
0
20
40
60
80
100
Trasmittanza %
Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60%
Assorbanza: 0.2 - 0.7
Assorbimento molecolare di una radiazione
Per una molecola:
Etot = E nucleare + E elettronica + E vibrazionale + E rotazionale + E traslazionale
Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile
transizioni elettroniche
Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO)
E
N
E
R
G
I
A
Orbitale molecolare
antilegante
Orbitale
atomico
Orbitale
atomico
Orbitale molecolare
legante
Diagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolari
s*
E
N
E
R
G
I
A
p*
}
n
p
s
antileganti
non legante
}
leganti
Scarso interesse analitico:
assorbimenti nell’UV lontano
Es. di lmax per s
s*
CH4: 125 nm ; C2H5: 135 nm
Es. di lmax per n
s*
H2O: 167 nm ; CH3OH: 185 nm
Transizioni elettroniche n
p* (R o radicaliche come quelle n
s*)
Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di
assorbività (e ≤ 102, transizioni proibite dalle cosiddette regole di selezione quantomeccaniche)
Esempio: acetone, lmax (esano) 279 nm, e ~ 20
Transizioni elettroniche p
p*
Collocazione variabile:
~ 160-230 nm (sistemi p isolati, transizioni E o etileniche)
~ 250-280 nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoidi)
~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazione)
b-carotene
lmax (cloroformio): 466, 497 nm
Spettro di assorbimento
della 1,2,4,5-tetrazina in
tre diverse condizioni
Assorbanza
Vapore
E1
{
E0
{
Possibili transizioni tra due livelli
elettronici con sottolivelli
vibrazionali e rotazionali
Soluzione
di esano
Soluzione
acquosa
Lunghezza d’onda, nm
[Skoog-West-Holler]
CROMOFORI Gruppi funzionali insaturi le cui transizioni elettroniche danno
luogo ad assorbimento nel visibile e nel vicino UV
Cromofori più comuni:
C
C
N
C
C
N
C
N
N
C
O
O
C
Sistemi aromatici
in genere
Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di
molecole organiche sono legati più debolmente
e sono perciò più facilmente eccitabili
Ogni cromoforo ha l di massimo assorbimento (lmax) e coefficienti
di estinzione e caratteristici che variano però in funzione del
solvente e della struttura molecolare complessiva
Possibili
transizioni
per un
carbonile
Cromoforo
C=O
S
Transizione
lmax
e
p
p*
180
9000
n
s*
200
--
n
p*
280
20
Fattori che influenzano il valore di e
- Probabilità della transizione elettronica
e > 104
probabilità elevata
e < 103 probabilità bassa
- Variazione del momento dipolare legato alla transizione
L’assorbimento è tanto più intenso quanto maggiore la separazione
di carica nello stato eccitato
- Natura del solvente
- Tipo di sostituenti
Influenzano sia la probabilità di transizione che la variazione
del momento dipolare
Effetto ipercromico: aumento del valore di e
Effetto ipocromico: diminuzione del valore di e
Fattori che influenzano il valore di lmax
Effetto batocromico (red shift): spostamento della lmax verso valori più
alti (frequenza ed energia più basse)
Possibili cause
-solvente: importante la polarità
coniugazione con altri cromofori
-sostituenti
iperconiugazione
coniugazione con auxocromi
Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame;
la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia
di lmax che di e
Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solvente
o da interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico
Effetti sulla transizione p
con auxocromi
p* dell’iperconiugazione e della coniugazione
lmax
e
CH2 = CH2
162
10.000
CH2 = CH – CH3
168
10.000
CH3 – CH = CH – CH3
177
11.000
CH3 – CH = C – (CH3)2
187
12.000
(CH3)2 – C = C – (CH3)2
196
12.400
Cl – CH = CH – Cl
193
11.000
cromoforo
Se non coniugati:
 e sono additivi
- lmax costante
CH3CH2CH2CH=CH2
Cromofori multipli
lmax= 184 emax = ~10.000
CH2=CHCH2CH2CH=CH2 lmax= 185 emax = ~20.000
Se coniugati:
- effetto batocromico
- effetto ipercromico
H2C=CH-CH=CH2
lmax= 217
emax = ~21.000
Distribuzione degli orbitali in dieni coniugati
e
n
e
r
g
i
a
p4*
p*
162 nm
p6*
p5*
p3*
217 nm
p4*
258 nm
450 nm
N° doppi legami
p
Etilene
(e: 10.000)
p2
p1
Butadiene
(e: 21.000)
p3
p2
p1
Esatriene (e: 25.000)
b-carotene
(e: 100.000)
Sistemi aromatici Si possono considerare sistemi polienici coniugati; sono
caratteristici sia il comportamento chimico che spettroscopico
lmax: 184 nm (e = 60.000) e 204 nm (e = 7.900) (bande etileniche E1 e E2)
lmax: 256 nm (e = 200) (banda benzenoide B a struttura fine)
benzene
Solo la prima (E1) non è “proibita” ed è infatti la più intensa
Effetto del pH sull’assorbimento
È legato alla presenza di gruppi funzionali ionizzabili
Esempi:
Assorbimento nei composti inorganici
Transizioni elettroniche nei metalli di transizione (orbitali d)
Caso classico: ioni complessi a struttura ottaedrica
Co(NH3)62+
Co(H2O)62+
Teoria del campo cristallino
E
n
e
r
g
i
a
D0
Orbitali d
(nessun legante)
Orbitali d
(complesso ottaedrico)
Di solito D0 è piccolo per cui la
transizione avviene per assorbimento
nella regione del visibile
(soluzioni colorate)
Transizioni per trasferimento di carica
- Transizione intramolecolare: tipica dei composti di coordinazione, ma anche di
ioni quali MnO4-, CrO42-….; di solito consiste nel trasferimento di un elettrone dal
legante al metallo
Esempio 1: FeSCN2+
Fe3+ -------- -SCN
hn
Fe2+ --------
.
SCN
Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante
Esempio 2: ferroina:
hn
- Transizione intermolecolare: tipico esempio è quello del complesso I2-benzene in cui
un elettrone oscilla tra la nuvola p del benzene ed un orbitale vuoto di I2
+ I2
hn
Soluzione
Marrone scuro
Un altro esempio classico è quello del complesso I2-amido in cui un elettrone oscilla
tra la la molecola di I2e quella di amido che l’avvolge a spirale
Amido + I2
hn
Soluzione
blu
COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA UV
La colorimetria è limitata alla regione del visibile ed utilizza colorimetri fotoelettrici
La spettrofotometria UV è più affidabile, più versatile ed utilizza spettrofotometri
Caratteristiche principali:
- campo di indagine esteso dal vicino UV (~ 200 nm) al vicino IR (~ 1000 nm)
- condizioni di quasi monocromaticità delle radiazioni utilizzate
- continuità con cui può essere variata la lunghezza d’onda della radiazione
Componenti di colorimetri fotoelettrici e spettrofotometri
Sorgente
radiante
Selezionatore di
lunghezza d’onda
Cella
Rivelatore
Sorgenti radianti
Emettono radiazioni policromatiche contenenti cioè le lunghezze d’onda della
regione richiesta
Le sorgenti possono essere continue (a) o a righe (b)
Skoog, West, Holler, Crouch
Regione del visibile
- lampade a filamento di tungsteno (bulbo in vetro)
• temperatura di esercizio ~ 3000 K
• intervallo utile di l ~ 2200 ÷ ~ 350 nm
Emissione luminosa di
un corpo incandescente
3400 K
- lampade a tungsteno/alogeno (bulbo in quarzo)
• temperatura di esercizio ~ 3500 K
• intervallo utile di l ~ 2500 ÷ ~ 240 nm
• vita media doppia rispetto alla precedente
Wsublimato + I2
Intensità
relativa
3000 K
2600 K
2200 K
WI2 (gas)
filamento caldo
W + I2
si rideposita sul filamento
l (nm)
Regione dell’UV
- lampade a scarica elettrica in vapori di deuterio (bulbo in quarzo)
• intervallo utile di l ~ 380 ÷ ~ 160 nm
• meccanismo di emissione legato all’eccitazione di D2:
Scarica
elettrica
D2
D2*
D’ + D” + hn
Fotone
di luce
ED2* = ED’ + ED’’ + hn
ED’ e ED’’ : energie cinetiche dei due atomi di deuterio
ED’ + ED’’ può variare in modo continuo tra 0 e ED2*, quindi anche hn può farlo:
il risultato è uno spettro di emissione continuo
- lampade a scarica elettrica in vapori di mercurio (bulbo in quarzo)
• spettro di emissione a righe (UV e visibile)
• usi analitici particolari soprattutto nella regione dell’UV
Gli spettrofotometri hanno quindi al loro interno due diverse lampade, una per il
visibile e l’altra per l’UV opportunamente intercambiate. Nei modelli più recenti
un’unica lampada allo xenon copre tutto lo spettro (~ 200 ÷ ~ 1100 nm)
Selezionatori di lunghezze d’onda
Hanno la funzione di scomporre la radiazione policromatica in bande il più possibile
monocromatiche. Sono di due tipi: filtri e monocromatori.
La caratteristica principale, in entrambi i casi, è l’ampiezza della banda passante:
intervallo di radiazioni che emerge dal selezionatore con un’energia almeno pari
al 50% di quella della radiazione nominale
lunghezza d’onda nominale
Lunghezza d’onda
Filtri
Usati nei colorimetri fotoelettrici
Filtri di assorbimento:
• ampiezza di banda 30 ÷ 250 nm
• trasmittanza 5 ÷ 30%
• uso nel visibile (vetro)
Filtri a interferenza:
• ampiezza di banda 5 ÷ 20 nm
• trasmittanza 50 ÷ 60%
• uso nel visibile e UV
• costo più elevato
Skoog, West, Holler, Crouch
Monocromatori
Consentono di selezionare con continuità le radiazioni di qualsiasi lunghezza d’onda
Monocromatore a prisma
n1 : indice di rifrazione dell’aria
n2 : indice di rifrazione del prisma
i : angolo di incidenza
r : angolo di rifrazione
Quando una radiazione luminosa attraversa la superficie di separazione di due mezzi
trasparenti, il raggio rifratto si piega verso la normale alla superficie se il secondo mezzo
è più denso del primo. L’angolo di rifrazione r è funzione della l della radiazione.
Schema ottico di un monocromatore a prisma
lente
focalizzatrice
S
l1
sorgente
fenditura di
ingresso
lente
collimatrice
prisma
l2
fenditura di
uscita
Scomposizione spettrale operata da tre diversi tipi di monocromatori
assorbimento
200 nm
prisma di
vetro
400
500
600 700
prisma di
quarzo
200 nm
300
350
400
500
700
monocromatore
a reticolo
200 nm
300
400
500
600
700
N.B. : nel visibile, il prisma di vetro è preferibile a quello di quarzo
49
(maggiore dispersione)!
Fenomeno della diffrazione
Immagine di una fenditura di larghezza variabile su uno schermo illuminato con luce monocromatica
Sorgente
radiante
Sorgente
radiante
frange di
diffrazione
Sorgente
radiante
ordine
zero
Interferenza costruttiva e distruttiva di una radiazione monocromatica
Onde in concordanza di fase
Onde in opposizione di fase
A
intensità
l
l
A
2A
tempo
http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&feature=related
Monocromatori a reticolo di diffrazione
Sono di due tipi: reticoli di trasmissione e reticoli di riflessione
Reticoli di trasmissione
Costituiti da sottilissime fenditure (600 ÷ 2000/mm) incise su una superficie rivestita di
alluminio. Ampiezza delle fenditure e distanza sono dello stesso ordine di grandezza delle
radiazioni incidenti.
m
m = passo del reticolo
a = m  senb
b
a
Comportamento delle radiazioni
in un reticolo di trasmissione
Le radiazioni si sommano solo se:
m  senb = K l
(K = 0, 1, 2, 3…..)
Diffrazione di luce policromatica
Spettro del 1° ordine
frangia di ordine zero:
luce bianca
Sorgente
radiante
Ovviamente nello spettro del 1° ordine, come di quelli successivi, sono da
includere anche le radiazioni appartenenti a regioni diverse dal visibile!
Dispersione di luce bianca attraverso un reticolo di trasmissione
Cozzi, Protti, Ruaro
Gli spettri dei vari ordini sono tutti lineari in funzione della lunghezza d’onda,
cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro!
Reticoli di riflessione
Costituiti da una serie di solchi (100 ÷ 2000/mm) tracciati sopra una superficie riflettente,
piana o concava.
I reticoli più comuni sono quelli a gradini:
In questo caso, sono i raggi riflessi a dar luogo
ai fenomeni di interferenza costruttiva o
distruttiva del tutto simili a quelli
ottenuti con i reticoli di trasmissione
Esempio di diffrazione osservabile guardando con
luce radente un comune compact disc!
Cellette di assorbimento (cuvette)
Hanno la funzione di contenere la soluzione in esame e quella del riferimento
visibile
UV, visibile
Cuvette in vetro o materiale
plastico (polistirene, metacrilato)
Cuvette in quarzo
Hanno volume variabile e spessore (cammino ottico) che può variare
da pochi mm ad alcuni cm (di solito 1 cm)
Rivelatori
Sono trasduttori che convertono l’energia radiante in corrente elettrica misurabile con
un galvanometro. La corrente elettrica che si genera è direttamente proporzionale
all’intensità della radiazione luminosa.
Fototubi e fotomoltiplicatori
Il loro funzionamento si basa sull’effetto fotoelettrico
Relazione di Einstein per l’effetto fotoelettrico:
hn = E0 + ½ mv2
energia
fotone
potenziale ionizzazione
del metallo
Energia
cinetica
dell’elettrone
Fototubi
Anodo a filamento
Catodo
Fascio di fotoni
Involucro di vetro
o quarzo sotto
vuoto
elettroni
Amplificatore
e misuratore
90 V
Skoog, West, Holler, Crouch
Il catodo è ricoperto da uno strato di materiale fotoemissivo (generalmente cesio)
Fotomoltiplicatori
Simili ai fototubi ma molto più sensibili. Si basano sul fenomeno dell’emissione secondaria.
Sezione
trasversale
Numerosi elettroni
per ogni elettrone
Numerosi elettroni
per ogni fotone
900 V
Dinodi D1-D9
Involucro
di quarzo
Griglia
90 V
Radiazione
Catodo fotoemissivo
Anodo
Skoog, West, Holler, Crouch
Involucro
di quarzo
Catodo
Anodo
Dinodi
Lettura
Amplificatore
Producono correnti 105 ÷ 107 volte più intense di quelle di un fototubo per cui possono essere
usati solo per misure di bassi valori di intensità luminosa!
Rivelatori a serie di fotodiodi (DAD)
Fotodiodo: dispositivo costituito da una giunzione tra un semiconduttore di tipo p ed uno
di tipo n
Semiconduttore: materiale la cui conducibilità elettrica è intermedia tra quella di un conduttore
(metallo) e quella di un isolante
Esempio: silicio cristallino
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
La conducibilità elettrica è legata all’eccitazione termica di un elettrone (di conduzione)
che lascia una lacuna positiva anch’essa mobile come l’elettrone
Semiconduttore di tipo n: semiconduttore
drogato con eccesso di elettroni di conduzione
Esempio: silicio cristallino drogato
con un elemento del V gruppo (As)
Semiconduttore di tipo p: semiconduttore
drogato con eccesso di lacune elettroniche
Esempio: silicio cristallino drogato
con un elemento del III gruppo (Ga)
Skoog, West, Holler, Crouch
Schema di un fotodiodo al silicio
Giunzione pn
Contatto
metallico
Buca
Elettrone
Regione p
Regione n
Conduttore
Skoog, West, Holler, Crouch
Strato di
deplezione
Regione p
Regione n
Polarizzazione diretta
Regione p
Regione n
Polarizzazione inversa
Le condizioni di polarizzazione inversa sono quelle utilizzate nei rivelatori DAD
Schema ottico di uno spettrofotometro con rivelatore DAD
Serie di
fotodiodi
Specchio
Fenditura
Skoog, West,
Holler, Crouch
Reticolo di
diffrazione
Cella
Specchio
Otturatore
Sorgente
Acquisizione dello spettro in tempo reale!
La sensibilità del DAD è intermedia tra quella di un fototubo e quella di un fotomoltiplicatore.
Schema ottico di spettrofotometro a raggio singolo
Schermo
Sorgente
hn
Cuvetta di
riferimento
Monocromatore
Rivelatore
I0
Lettore
Amplificatore
Cuvetta del
campione
Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nello spazio
Schermo
Sorgente
hn
Cuvetta di
riferimento
Rivelatore 1
I0
Lettore
Beam
splitter
Monocromatore
Rivelatore
2
I
Specchio
Cuvetta del
campione
Skoog, West, Holler, Crouch
Amplificatore
differenziale
Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nel tempo
Cuneo
ottico
Cuvetta di
riferimento
Lettore
I0
Amplificatore
Specchio
a settori
Sorgente
hn
Cuvetta del
campione
Monocromatore
Rivelatore
I
Specchio
Specchio
a settori
Vista frontale
Motore
Trasparente
Specchio
Skoog, West, Holler, Crouch
Titolazioni spettrofotometriche
Si misura l’assorbanza di una soluzione ad una lunghezza d’onda opportuna dopo l’aggiunta di
incrementi noti di titolante.
agitatore
A + B
C
foro per
buretta
finestre di
quarzo
Celletta per titolazioni spettrofotometriche
A
A
eA = eC = 0
eB > 0
A
eB = eC = 0
eA > 0
0
V
V
eA = eB = 0
eC > 0
V
A
eA = 0
eB > e C > 0
A
eC = 0
eA > eB > 0
A
eA = 0
eC > eB > 0
0
V
V
V
Per ridurre l’effetto della diluizione, si impiegano soluzioni concentrate di titolante o
si correggono i dati sperimentali:
Assorbanza corretta = Assorbanza osservata  Volume totale
Volume iniziale
Analisi quantitativa in assorbimento
La spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nell’UV è una delle tecniche di più
ampio utilizzo nell’analisi quantitativa strumentale.
Caratteristiche salienti:
• Ampia applicabilità
• Alta sensibilità (fino a 10-7 M)
• Selettività da moderata ad alta
• Buona accuratezza
• Facilità e convenienza
Esempio di applicazione della spettrofotometria in campo biologico
Saggi immunologici: si basano sull’uso di anticorpi specifici per l’analita (proteina)
SAGGIO IMMUNO-ENZIMATICO ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
prodotto non colorato
o non fluorescente
prodotto colorato
o fluorescente
L’enzima può trasformare, ad es., un reagente incolore in prodotto colorato (dosaggio colorimetrico)
oppure un reagente non fluorescente in prodotto fluorescente (dosaggio fluorimetrico).
La quantità di prodotto colorato o fluorescente ottenuto è proporzionale alla concentrazione di analita.
FLUORIMETRIA
E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza.
Fluorescenza: processo nel quale gli atomi o le molecole, eccitate mediante assorbimento
di radiazioni elettromagnetiche, rilassano allo stato fondamentale cedendo l’eccesso di
energia come fotoni.
Skoog, West,
Holler, Crouch
L’emissione di
radiazioni fluorescenti
avviene a lunghezze
d’onda maggiori
(frequenza
ed energia minori)
rispetto alle radiazioni
assorbite (spostamento
o shift di Stokes)
La fluorescenza è possibile solo in presenza di cromofori con particolare distribuzione dei livelli
energetici (fluorofori). Le transizioni elettroniche coinvolte sono sempre le stesse:
p
p*
n
p*
Molti composti fluorescenti contengono anelli aromatici specie se condensati. La fluorescenza è inoltre
particolarmente favorita in molecole rigide. Ad esempio:
La fosforescenza è un fenomeno simile alla fluorescenza. Per capirne la differenza occorre
prendere in considerazione gli stati di singoletto e tripletto:
Skoog, West,
Holler, Crouch
Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente
nello stato di singoletto (spin elettronici appaiati). Nello stato eccitato possono assumere invece
sia lo stato di singoletto che di tripletto (coppia di spin elettronici spaiati).
Fluorescenza
singoletto eccitato
Fosforescenza
singoletto fondamentale
Transizione probabile e rapida (< 10-5 sec)
tripletto eccitato
singoletto fondamentale
Transizione poco probabile e più lenta (> 10-3 sec)
Analisi fluorimetrica
Spettri di eccitazione:
Eccitazione a
l variabile
Misurazione intensità di fluorescenza
a l fissa (di solito lmax)
In teoria, spettri di assorbimento e di eccitazione dovrebbero coincidere
Spettri di emissione:
Eccitazione a
l fissa (di solito lmax)
Misurazione intensità di fluorescenza
a l variabile
In genere, spettri di emissione e di eccitazione appaiono come immagini speculari l’uno dell’altro
Esempio: spettro di eccitazione (a) e spettro di emissione (b) dell’antracene in etanolo
stato
eccitato
antracene
stato
fondamentale
stato
eccitato
stato
fondamentale
Skoog, West, Holler, Crouch
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
E’ possibile dimostrare che:
If = S  F  I0 (1 – 10 –abc)
If = intensità radiazione fluorescente
I0 = intensità radiazione di eccitazione
a = coefficiente di estinzione alla l di eccitazione
b = spessore della soluzione (cammino ottico)
c = concentrazione della soluzione
S = costante di proporzionalità (≤ 1) legata all’efficienza quantica del campione (rapporto
tra fotoni emessi e fotoni assorbiti)
F = costante di proporzionalità (≤ 1) legata alla resa strumentale (rapporto tra fotoni misurati
e fotoni emessi)
Fattori che determinano la non linearità tra If e concentrazione:
• diminuzione di I0 nell’attraversamento della soluzione
• differente assorbimento della stessa radiazione fluorescente in funzione del cammino ottico percorso
If = S  F  I0 (1 – 10
–abc)
SFI0
If
Skoog, West, Holler, Crouch
concentrazione
Solo per soluzioni molto diluite si ha con buona approssimazione:
If = SFI0  abc
If = K  c
Processi di spegnimento (quenching)
Processi nei quali l’emissione da parte di una molecola eccitata diminuisce in intensità a causa del
trasferimento di energia ad un’altra molecola (spegnitore o quencher). Lo spegnitore eccitato può quindi
dissipare la sua energia attraverso altri processi.
Un esempio tipico di quencher è rappresentato da O2 :
M* + O2
molecola allo
stato eccitato
tripletto
fondamentale
M + O2 *
singoletto
eccitato
molecola allo
stato fondamentale
Autospegnimento (self-quenching)
Una molecola di analita assorbe energia da un’altra molecola di analita eccitata con trasferimento di
energia non radiante che alla fine viene dissipata sotto forma di calore. Aumenta con la concentrazione.
Autoassorbimento
Si verifica quando la l di emissione si sovrappone ad una banda di assorbimento. Aumenta anch’essa
con la concentrazione.
Nell’analisi quantitativa occorre assicurarsi dell’assenza di quenching!
Fluorimetri e spettrofluorimetri
La differenza sta nel selezionatore di radiazioni elettromagnetiche: filtri per i fluorimetri,
reticoli di diffrazione per gli spettrofluorimetri.
Sorgenti radianti
Devono produrre radiazioni di elevata energia (l’intensità di fluorescenza, come già visto,
è funzione dell’intensità di eccitazione) concentrata nell’UV: lampade a vapori di Hg o
lampade allo xenon.
Selezionatori di l
Sono normalmente due (filtri o reticoli), uno per il lato di eccitazione e l’altro per quello
di emissione.
Rivelatori
E’ indispensabile l’impiego di fotomoltiplicatori a causa dei bassi livelli di energia tipici
dell’emissione fluorescente.
Schema ottico di uno spettrofluorimetro
Skoog, West,
Holler, Crouch
L’emissione fluorescente è prelevata di solito a 90° rispetto al raggio incidente. Vantaggi:
• rivelazione della sola radiazione di fluorescenza (e non eventualmente di quella di eccitazione)
• maggiore intensità di fluorescenza emessa dai primi strati della soluzione del campione
Applicazioni della fluorimetria
Pur se di uso meno esteso rispetto alla spettrofotometria, la fluorimetria può essere applicata a
numerosi composti sia organici che inorganici. Per questi ultimi si ricorre ad agenti complessanti
come ad esempio:
Skoog, West,
Holler, Crouch
Vantaggi dell’analisi fluorimetrica:
• selettività potenzialmente superiore alla spettrofotometria
• sensibilità superiore alla spettrofotometria ottenuta aumentando la potenza I0 delle radiazioni di
eccitazione (limite di rivelabilità 10-8 - 10-9 M)
If = S  F  I0 (1 – 10 –abc)
mentre
A = abc = - log T = - log I0/I
Bionsensore a fibre ottiche per la misura della glicemia